土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法

1.本发明涉及污染土壤修复技术领域，具体涉及土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法。


背景技术：

2.抗生素被广泛用于治疗人类和动物的各种疾病，以及促进动物的生长等。然而，人类和动物服用的抗生素约有59％不能被吸收利用，进而随尿液和粪便排放到环境中。而进入到环境中的抗生素会对环境微生物产生负面影响，且土壤中的抗生素会对植物、土壤动物和微生物带来危害，严重影响环境安全。
3.由于我国动物饲养使用的抗生素多为四环素类抗生素，且四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，长久使用会导致土壤中富集大量的四环素类抗生素，严重污染环境和生态。
4.现阶段对土壤中四环素类抗生素的降解途径主要有生物降解、水解、光降解和微电解，其中生物降解不论在成本上还是在效率上均具有较大的优势，但是传统的生物降解大多是筛选出可降解四环素类抗生素的菌种，并通过一定浓度添加至土壤中对土壤进行修复，但是单一菌种的使用在整体的效率和效果上有所欠缺，无法长效的对土壤继续修复，对实际使用来说具有一定的局限性。


技术实现要素：

5.针对现有技术不足，本发明提供土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，通过吸附载体料和微生物菌剂复合的微生物修复剂对土壤进行修复，在有效提升修复效率的同时保证长期对土壤修复的效果，提升实际使用的便捷性。
6.为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
7.土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法主要为采用微生物修复剂对土壤进行修复，所述微生物修复剂由吸附载体料和微生物菌剂按照质量比6-8∶1-3复配组成；所述吸附包裹料由以下重量份原料制成：煅烧硅藻土20-30份、改性木质素3-5份、改性蛭石4-6份、改性甘蔗渣10-12份、改性淀粉4-6份、多级粒径生物炭10-15份、甲壳素2-4份、纳米二氧化硅1-3份、十二烷基磺酸钠0.6-1.2份；所述微生物菌剂由烟草节杆菌、枯草芽孢杆菌、木糖氧化无色杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌组合制成。
8.优选的，所述改性木质素和改性甘蔗渣的制备方法均为将原料进行气爆处理后进行酸碱改性。
9.优选的，所述改性蛭石为将蛭石酸洗后进行微波膨胀处理得到。
10.所述改性淀粉的制备方法为将淀粉加水溶解后升温半糊化，后冻干粉碎，再采用220-250℃的高温热蒸汽快速处理60-80s，最后干燥制得。
11.所述多级粒径生物炭由粒径分为分别为(0.1-2mm)、(10-20mm)、(30-50mm)的生物炭颗粒按照质量比4∶5∶1组成。
12.优选的，所述微生物菌剂中各菌种均为由原菌种在含四环素的基础固体培养基中连续传代驯化所得。
13.优选的，所述连续传代驯化过程为分别将各原菌种接种到含100mg/l四环素的基础固体培养基上，25-37℃下培养2-4d，再筛选出耐受活菌，转入200mg/l四环素的基础固体培养基中进行传代培养，重复5次，每次使四环素的浓度递增100mg/l，使得最后一次培养时四环素的浓度达到500mg/l，完成传代驯化。
14.优选的，所述微生物修复剂的制备方法包括以下步骤：
15.(1)将微生物菌剂加水混合制成前驱体溶液备用；
16.(2)将煅烧硅藻土加入前驱体溶液中搅拌15-20min，后再加入改性淀粉、甲壳素、纳米二氧化硅和十二烷基磺酸钠，继续搅拌10-15min得预处理液；
17.(3)待预处理液静置2-3h后向内加入改性木质素、改性蛭石、改性甘蔗渣和多级粒径生物炭加压搅拌均匀，后干燥固结，得微生物修复剂。
18.优选的，所述步骤(2)中搅拌的转速为800-1000r/min。
19.优选的，所述步骤(3)中加压搅拌的方式为，升压至2-4mpa，以400-600r/min的转速搅拌10-15min。
20.本发明提供土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，与现有技术相比优点在于：
21.(1)本发明采用煅烧硅藻土、改性木质素、改性蛭石、改性甘蔗渣、改性淀粉、多级粒径生物炭等原料为吸附载体料，能够有效对微生物原料进行负载，后使用时保证微生物的成活率，同时进一步提升微生物对四环素的降解效率，保证其在土壤中的长效降解性。
22.(2)本发明通过对烟草节杆菌、枯草芽孢杆菌、木糖氧化无色杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌进行四环素传代驯化，获得对四环素具有良好降解效果的菌株，能够有效对土壤中的四环素进行高效全面的降解，并且通过吸附载体料进行负载，保证其在土壤中的修复效率。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1：
25.各菌种的传代培养：
26.1、将烟草节杆菌arthrobacternicotianae otc-16接种到含100mg/l四环素类抗生素基础固体培养基上，32℃下培养3d，再筛选出耐受活菌，接种至含200mg/l四环素类抗生素的基础固体培养基中进行传代培养，30℃下培养3d，继续筛选出耐受活菌按上述方式进行重复，每次重复时基础固体培养基中四环素类抗生素的含量增加100mg/l，直至基础固体培养基中四环素类抗生素的含量达到500mg/l，完成传代驯化；
27.2、枯草芽孢杆菌bacillus subtilis接种到含100mg/l四环素类抗生素基础固体
培养基上，32℃下培养3d，再筛选出耐受活菌，接种至含200mg/l四环素类抗生素的基础固体培养基中进行传代培养，30℃下培养3d，继续筛选出耐受活菌按上述方式进行重复，每次重复时基础固体培养基中四环素类抗生素的含量增加100mg/l，直至基础固体培养基中四环素类抗生素的含量达到500mg/l，完成传代驯化；
28.3、木糖氧化无色杆菌achromobacter xylosoxidans接种到含100mg/l四环素类抗生素基础固体培养基上，32℃下培养3d，再筛选出耐受活菌，接种至含200mg/l四环素类抗生素的基础固体培养基中进行传代培养，30℃下培养3d，继续筛选出耐受活菌按上述方式进行重复，每次重复时基础固体培养基中四环素类抗生素的含量增加100mg/l，直至基础固体培养基中四环素类抗生素的含量达到500mg/l，完成传代驯化；
29.4、嗜麦芽窄食单胞菌stenotrophomonas maltophilia strain dt1接种到含100mg/l四环素类抗生素基础固体培养基上，32℃下培养3d，再筛选出耐受活菌，接种至含200mg/l四环素类抗生素的基础固体培养基中进行传代培养，30℃下培养3d，继续筛选出耐受活菌按上述方式进行重复，每次重复时基础固体培养基中四环素类抗生素的含量增加100mg/l，直至基础固体培养基中四环素类抗生素的含量达到500mg/l，完成传代驯化；
30.实施例2：
31.微生物修复剂的制备：
32.(1)将木质素和甘蔗渣分别在2mpa的压强下采用160℃的高温蒸汽气爆处理1min，后再依次于ph值为4和ph为7.5的溶液中浸泡15min，且在浸泡结束后调节ph至中性再干燥，得改性木质素和改性甘蔗渣；
33.(2)将蛭石于ph为6的酸液中酸洗20min，后调节ph至中性再干燥，再采用微波功率600w，膨胀处理70s，后取出粉碎过20目筛，得改性蛭石；
34.(3)将红薯淀粉加水溶解后，升温至62℃搅拌半糊化处理15min，后冻干粉碎，采用240℃的高温热蒸汽快速处理70s，干燥得改性淀粉；
35.(4)按照质量比4∶5∶1将粒径分别为(0.1-2mm)、(10-20mm)、(30-50mm)的生物炭颗粒混合，得到多级粒径生物炭；
36.(5)将实施例1中驯化的烟草节杆菌、枯草芽孢杆菌、木糖氧化无色杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌收集后混合制得微生物菌剂，且微生物菌剂中的活菌量≥200亿活菌量/g；
37.(6)取上述微生物菌剂10g加入1000ml水中，混合均匀后制成前驱体溶液，将14.5g煅烧硅藻土加入前驱体溶液中，以800r/min搅拌15min，后再加入2.9g改性淀粉、1.74g甲壳素、1.16g纳米二氧化硅和0.58g十二烷基磺酸钠，继续搅拌15min得预处理液；
38.(7)待预处理液静置3h后向内加入2.32g改性木质素、2.9g改性蛭石、6.38g改性甘蔗渣和7.52g多级粒径生物炭加压至2mpa后以500r/min的转速搅拌15min，后干燥固结，得微生物修复剂。
39.实施例3：
40.针对实施例2中的微生物修复剂的制备方法，选择性的采用未改性的木质素、甘蔗渣、淀粉以及粒径范围为30-50mm的生物炭分别代替改性木质素、改性蛭石、改性甘蔗渣、改性淀粉和多级粒径生物炭，其余制备步骤与实施例2相同，具体如下表1所示：
41.表1
[0042][0043]
上表1中“√”为添加，
“‑”
为不添加。
[0044]
检测：
[0045]
以土霉素为例，对于实施例1中各菌种的传代培养添加土霉素为四环素类抗生素，并实验室配置含土霉素100g/kg的土壤为实验土壤，
[0046]
按照质量比1∶2000将实施例2中实验组1-5制得的微生物修复剂分别与实验土壤混合，同时采用实施例2中制得的微生物菌剂按照质量比1∶4000的质量比混合于实验土壤中形成对照组，在25
±
2℃的温度下模拟室外光照时间，检测24h、48h、72h和168h后各组土壤中土霉素的含量，计算降解率，具体结果如下表2所示：
[0047]
表2
[0048][0049][0050]
由上表2可知，实验组1制备的微生物修复剂其虽然在24h内对土霉素的降解相较于对照组较低，但是其能够在48h之后有效提升降解效率，相对于对照组其降解效率大大增
强，即采用吸附载体料能够微生物菌剂的定殖效果，同时在后续长时间的观察中(168h)，实验组其降解效率还在稳定的增长，而对照组整体增长变化不大，即采用本技术实验组1的微生物修复剂能够稳定长效的对土壤中的四环素类抗生素污染进行修复。
[0051]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0052]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于，土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法主要为采用微生物修复剂对土壤进行修复，所述微生物修复剂由吸附载体料和微生物菌剂按照质量比6-8∶1-3复配组成；所述吸附包裹料由以下重量份原料制成：煅烧硅藻土20-30份、改性木质素3-5份、改性蛭石4-6份、改性甘蔗渣10-12份、改性淀粉4-6份、多级粒径生物炭10-15份、甲壳素2-4份、纳米二氧化硅1-3份、十二烷基磺酸钠0.6-1.2份；所述微生物菌剂由烟草节杆菌、枯草芽孢杆菌、木糖氧化无色杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌组合制成。2.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于：所述改性木质素和改性甘蔗渣的制备方法均为将原料进行气爆处理后进行酸碱改性。3.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于：所述改性蛭石为将蛭石酸洗后进行微波膨胀处理得到。4.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于：所述改性淀粉的制备方法为将淀粉加水溶解后升温半糊化，后冻干粉碎，再采用220-250℃的高温热蒸汽快速处理60-80s，最后干燥制得。5.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于：所述多级粒径生物炭由粒径分为分别为(0.1-2mm)、(10-20mm)、(30-50mm)的生物炭颗粒按照质量比4∶5∶1组成。6.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于：所述微生物菌剂中各菌种均为由原菌种在含四环素的基础固体培养基中连续传代驯化所得。7.根据权利要求6所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于，所述连续传代驯化过程为分别将各原菌种接种到含100mg/l四环素的基础固体培养基上，25-37℃下培养2-4d，再筛选出耐受活菌，转入200mg/l四环素的基础固体培养基中进行传代培养，重复5次，每次使四环素的浓度递增100mg/l，使得最后一次培养时四环素的浓度达到500mg/l，完成传代驯化。8.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于，所述微生物修复剂的制备方法包括以下步骤：(1)将微生物菌剂加水混合制成前驱体溶液备用；(2)将煅烧硅藻土加入前驱体溶液中搅拌15-20min，后再加入改性淀粉、甲壳素、纳米二氧化硅和十二烷基磺酸钠，继续搅拌10-15min得预处理液；(3)待预处理液静置2-3h后向内加入改性木质素、改性蛭石、改性甘蔗渣和多级粒径生物炭加压搅拌均匀，后干燥固结，得微生物修复剂。9.根据权利要求8所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌的转速为800-1000r/min。10.根据权利要求8所述的土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，其特征在于，所述步骤(3)中加压搅拌的方式为，升压至2-4mpa，以400-600r/min的转速搅拌10-15min。

技术总结
本发明提供土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法，涉及污染土壤修复技术领域。所述土壤四环素类抗生素污染的微生物修复方法主要为采用微生物修复剂对土壤进行修复，所述微生物修复剂由吸附载体料和微生物菌剂按照质量比6-8∶1-3复配组成，其中吸附包裹料由煅烧硅藻土、改性木质素、改性蛭石、改性甘蔗渣、改性淀粉、多级粒径生物炭、甲壳素、纳米二氧化硅、十二烷基磺酸钠组成，微生物菌剂由烟草节杆菌、枯草芽孢杆菌、木糖氧化无色杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌组合制成，本发明克服了现有技术的不足，通过吸附载体料和微生物菌剂复合的微生物修复剂对土壤进行修复，在有效提升修复效率的同时保证长期对土壤修复的效果，提升实际使用的便捷性。用的便捷性。


技术研发人员：李培岭 李转玲 谢扬皇 张艺宝 罗思敏
受保护的技术使用者：广东石油化工学院
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/9/22