一种新型预防术后腹腔粘连药物及其制备方法与流程

1.本发明属于术后腹腔粘连治疗技术领域，具体涉及一种新型预防术后腹腔粘连药物及其制备方法。


背景技术：

2.术后腹腔粘连是常见的腹部外科手术后并发症之一，在腹部手术患者术后约有90-95％患者会并发术后腹腔粘连形成，所形成的异常粘连束带可引起一系列与之相关的并发症，包括肠梗阻、慢性腹部疼痛、女性不孕不育、便秘等，不仅增加手术再次腹部手术的难度及副损伤的可能，也增加了患者的额外医疗花费，目前对于术后腹腔粘连的治疗方式除外手术松解，尚无有效药物，但手术会造成更加严重的粘连，因此，预防术后腹腔粘连十分必要，但目前尚缺乏对于术后腹腔粘连形成过程的关键分子机制的研究，特别是缺乏有效的分子作用靶点，因此，继续积极探究术后腹腔粘连形成机理，阐明术后腹腔粘连形成的潜在分子机制十分必要。
3.术后腹腔粘连形成是一个十分复杂的生物过程，其中涉及到许多分子及信号通路，在局部腹膜组织受损后，受损部位会激发炎症反应，释放大量的炎症细胞和炎性分子，随后大量的渗出的富含纤维蛋白液体和局部凝血块会在局部形成稀薄的粘连带(术后3-5天内)，在粘连形成的同时纤维形成和纤维溶解系统均被激活，激活的纤溶系统可部分降解形成的纤维组织，但随后大量的成纤维细胞分泌形成不同类型的胶原蛋白，致使牢固的粘连带形成(腹膜损伤后5-7天)，在此期间腹膜间皮细胞会修复受损部位的腹膜组织(术后24小时内)，但如果局部组织有纤维组织阻隔，则腹膜间皮细胞会被覆在局部纤维组织的表面形成稳定的粘连，此外，在粘连组织中腹膜间皮细胞会在炎症因子的作用下转变为纤维细胞促进粘连的形成。
4.基于术后腹腔粘连形成的机理，目前预防术后腹腔粘连形成的主要措施如下：
5.1、减轻手术创伤，精细化手术操作；
6.2、使用物理屏障隔离受损的创面；
7.3、抑制炎症反应及其扩大；
8.4、促进纤维溶解系统激活；
9.5、抑制氧化应激反应；
10.6、促进腹膜修复等等，但是考虑到对于腹部患者手术后安全性及药物可及性，目前预防术后腹腔粘连的药物主要是以物理屏障隔离药物为主，其发挥的作用有限，其主要原因是忽视了腹膜间皮细胞在腹膜修复中的作用；
11.目前对于腹膜修复中的关键分子机制及基于上述理论的干预术后腹腔粘连药物都十分欠缺，因此，进一步积极探索术后腹腔粘连形成过程，并开发新型药物十分必要。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于提供一种新型预防术后腹腔粘连药物及其制备方法，本发明旨
在探究术后腹腔粘连形成机理并开发预防术后腹腔粘连药物，继而有效减轻腹部手术后患者痛苦，增加腹部手术后患者社会归属感，本发明有着重要的社会意义及应用前景。
13.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
14.一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：
15.pla纳米颗粒20-50份、和厚朴酚15-35份、透明质酸钠10-30份。
16.作为本发明一种优选的方案，一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：
17.pla纳米颗粒30-40份、和厚朴酚20-30份、透明质酸钠15-25份。
18.作为本发明一种优选的方案，一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：
19.pla纳米颗粒35份、和厚朴酚25份、透明质酸钠20份。
20.一种新型预防术后腹腔粘连药物的制备ddd方法，包括如下步骤：
21.s1、制备纳米材料：基于pla纳米颗粒以及和厚朴酚制得纳米材料；
22.s2、制备细胞外基质金属酶响应水凝胶：将纳米材料以及透明质酸钠进行合成，最终制得细胞外基质金属酶响应水凝胶。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.本发明旨在探究术后腹腔粘连形成机理并开发预防术后腹腔粘连药物，继而有效减轻腹部手术后患者痛苦，增加腹部手术后患者社会归属感，本发明有着重要的社会意义及应用前景。
附图说明
25.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
26.图1为本发明的流程图；
27.图2为本发明中sirt3抑制氧化应激的分子机制图；
28.图3为本发明中透明质酸钠包被的pla和厚朴酚纳米水凝胶抑制术后腹腔粘连效果示意图；
29.图4为本发明中的第一技术路线图；
30.图5为本发明中的第二技术路线图；
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1：
33.一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒20份、和厚朴酚15份、透明质酸钠10份；
34.在术后腹腔粘连形成多种机制种，氧化应激损伤是造成腹膜损伤引起粘连形成的
关键，氧化应激反应是指体内活性氧的产生和清除失衡，造成大量活性氧的累积了造成局部组织损伤，在手术后，局部腹部组织受损，造成大量炎性细胞募集，局部受损的细胞、缺氧的环境等均会释放大量活性氧物质，包括o2
–
、h2o2,ho-、hocl等，这些活性氧物质或造成局部细胞特别是腹膜修复关键细胞腹膜间皮细胞的凋亡坏死，造成局部炎症反应放大，并进一步导致纤维形成和腹膜间皮细胞间质转化，因此减轻氧化应激损伤是抑制术后腹腔粘连形成的关键环节；
35.请参阅图2，sirt3是体内依赖于烟酰胺嘌呤二核苷酸的ⅲ类去乙酰化修饰酶，该分子有两种分子量，一种为43kd主要分布在线粒体，另外一种则为28kd可如何进行组蛋白乙酰化修饰，sirt3在体内发挥着极为重要的作用，可以保护线粒体功能、改变能量代谢、减轻氧化应激反应、促进细胞自噬、抑制纤维化形成等等，研究表明sirt3在组织修复过程中能发挥着广泛的作用，可通过多种途径减轻氧化应激损伤，可通过去乙酰化修饰活性氧清除物质sod，增强其酶活性，减轻线粒体氧化应激损伤；同时还可以通过激活lkb1/ampk通路保护线粒体功能，促进线粒体融合，其次，sirt3可以减轻纤维化形成，可抑制缺氧状态下hif1α的表达，调控通路tgf-β1/smads通路活性进而抑制纤维化形成，由于在术后腹腔粘连形成过程中，纤维形成和氧化应激发挥着至关重要的作用，而sirt3同时可通过多种途径抑制氧化应激反应及抑制纤维形成，提示sirt3可以作为预防术后腹腔粘连形成的作用靶点进一步研究；
36.和厚朴酚是传统中药厚朴的提取物，作为sirt3的激动剂，和厚朴酚可通过多种途径减轻组织氧化应激损伤，促进组织修复，和厚朴酚可以通过减少β-淀粉样蛋白表达减轻阿尔兹海默病症状，可通过调节线粒体动力学和肾脏nf-κb-tgf-β1/smads信号通路减少单侧输尿管梗阻诱导的肾脏炎症和纤维化，可减轻脑缺血损伤，可减轻心脏毒性损伤和心肌肥大等等，和厚朴酚可以通过激活sirt3的减轻氧化应激损伤，抑制术后腹腔粘连形成，然而，由于和厚朴酚是天然植物提取物，其溶解性制约进一步临床应用，并且由于在粘连形成过程中局部粘连组织造成的空间阻隔作用，导致其作用相对有限，因此，进一步改变剂型，基于和厚朴酚开发一款新型药物，对于术后腹腔粘连的防治十分有利；
37.聚乳酸(polylacticacid，pla)又称为聚丙交酯，即pla纳米颗粒是以乳酸为原料聚合而成的聚酯，pla纳米颗粒是一种无毒、无刺激的合成高分子材料具有优良的生物可降解性、相容性和吸收性，目前广泛应用于纳米材料制备中，通过pla纳米颗粒可实现很好的水溶性，特别是通过pla纳米颗粒以及和厚朴酚制备的纳米材料对于脂溶性药物特别有利，可有助于药物的吸收和释放，本发明通过pla纳米颗粒以及和厚朴酚，制备成为纳米材料，提高了其亲水性，然而，由于腹膜受损后早期渗出的纤维物质造成的空间阻隔作用，单纯使用pla纳米颗粒以及和厚朴酚的作用有效，需进一步改进其作用方式，进而增强其预防术后腹腔粘连的作用；
38.水凝胶(hydrogel)是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，它在水中迅速溶胀并在此溶胀状态可以保持大量体积的水而不溶解，凝胶的固体行为是一定条件下可维持一定的形状与体积，液体行为是溶质可以从水凝胶中扩散或渗透，其作为一种新型材料，水凝胶不仅能通过物理屏障作用隔离受损的创面还可以包被不同的药物促进组织愈合、抑制组织氧化应激损伤，特别是生物响应水凝胶，该种水凝胶随着组织中特殊酶类的作用可缓慢降解，特别适合在应用于术后腹腔粘连的预防中，不仅可为腹膜间皮细胞修复提供潜在时间窗，
也可随着时间延长逐步降解病释放出所包载的药物，有很好的生物兼容性并不影响腹腔组织功能。透明质酸钠是是一种葡聚糖醛酸，没有种属特异性，它广泛存在于胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织；器官中它分布在细胞质、细胞间质中，对其中所含的细胞和细胞器官本身起润滑与滋养作用。透明质酸钠具有很好的组织兼容性，被广泛应用于材料制备用，组织中金属酶mmps可以通过多种途径降解透明质酸钠，目前已有较多研究将其制备成为mmps酶响应水凝胶；
39.本发明首先通过pla纳米颗粒以及和厚朴酚制备纳米材料，再将透明质酸钠以及上述纳米材料合成，继而制成细胞外基质金属酶响应水凝胶，通过水凝胶材料实现物理屏障隔离受损创面，并包载目标药物，而pla纳米颗粒则可增加药物生物可吸收性，由其制备成功的纳米材料以及和厚朴酚有助于和厚朴酚在组织中的溶解性，利于其发挥生物作用，以期实现在物理屏障隔离的基础上使用促进腹膜修复的药物。
40.实施例2：
41.一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒30份、和厚朴酚20份、透明质酸钠15份。
42.实施例3：
43.一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒35份、和厚朴酚25份、透明质酸钠20份。
44.实施例4：
45.一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒40份、和厚朴酚30份、透明质酸钠25份。
46.实施例5：
47.一种新型预防术后腹腔粘连药物，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒52份、和厚朴酚35份、透明质酸30份。
48.实施例6：
49.请参阅图1，本实施例提供一种新型预防术后腹腔粘连药物的制备方法：包括如下步骤：
50.s1、制备纳米材料：基于pla纳米颗粒以及和厚朴酚制得纳米材料；
51.s2、制备细胞外基质金属酶响应水凝胶：将纳米材料以及透明质酸钠进行合成，最终制得细胞外基质金属酶响应水凝胶。
52.实施例7：
53.本实施例基于实施例1-7制备的药物，拟进一步通过体内动物实验、体外细胞实验验证本发明的技术效果，继而为术后腹腔粘连防治提供新型药物，并进一步丰富术后腹腔粘连形成机理；
54.(1)、sirt3在术后腹腔粘连中发挥的作用及其机制：
55.①
小鼠术后腹腔粘连模型建立及粘连评分：
56.采用盲肠搔刮摩擦法造模，方法如下：小鼠麻醉成功后取仰卧位，取下腹正中开口长约2cm，提出盲肠，使用干纱布摩擦肠壁约30次，直至针尖状出血点，同样方法摩擦腹壁，至出血，将受损的盲肠及腹壁相对放置，逐层关腹，在术后在不同时间节点(术后第1、3、5、7、14天)，再次麻醉大鼠，取下腹倒“u”型切口开腹。粘连程度评分采用nair’s评分系统：腹
壁与盲肠无粘连评0分；在腹壁与盲肠之间或盲肠与盲肠之间有1条粘连束带评1分；在腹壁与盲肠之间或腹腔内脏器之间有两条粘连带评2分；在腹壁与盲肠之间或腹腔内脏器之间有两条以上的粘连带评3分；盲肠直接与腹壁粘连，粘连致密，粘连带无法评估评4分；各组小鼠无粘连率即为各组小鼠中完全无粘连小鼠占据总小鼠数目，本发明已成熟构建该模型，请具体参阅图3；
57.②
构建sirt3基因敲除小鼠：
58.c57bl/6n-sirt3em1cyagen均有已构建成型模型，可购买后于本实验室繁殖并鉴定；
59.③
sirt3在术后腹腔粘连组织中的表达情况：
60.通过盲肠搔刮法制造小鼠术后腹腔粘连模型，在术后第1、3、5、10天分别处死小鼠并取正常腹膜及对应粘连部位腹膜组织，将组织进一步行免疫组化染色、免疫荧光染色(角蛋白19标记腹膜间皮细胞与sirt3同时行免疫荧光染色)检测不同时间段腹膜组织及腹膜间皮细胞中sirt3的表达情况；
61.④
敲除sirt3后检测对小鼠术后腹腔粘连形成的影响及其分子机制
62.将正常组小鼠、c57bl/6n-sirt3对照组、c57bl/6n-sirt3基因敲除鼠分别使用盲肠搔刮法造模，通过nair’s评分系统检测敲除sirt3后对小鼠粘连形成的影响，进一步通过he染色、天狼星红染色、免疫组化染色α-sma/ck19、免疫荧光染色ros、elisa检测mda/sod/gsh等检测敲除sirt3后对于小鼠炎症反应、纤维形成及腹膜修复的影响；
63.(2)、和厚朴酚通过激活sirt3抑制氧化应激反应减轻术后腹腔粘连形成(请参阅本发明中的第一技术路线图，即图4)：
64.①
动物模型及分组：使用盲肠搔刮法造模，将40只大鼠随机分为5组，每组8只，假手术组仅仅行开腹手术、对照组组行盲肠搔刮法造模、透明质酸钠组采用透明质酸钠凝胶涂抹受损创面、高低和厚朴酚治疗组术后予以不同剂量和厚朴酚作用，7天后处死大鼠，通过nair’s评分评估不同组别大鼠腹腔粘连情况，并取腹膜粘连组织或正常腹膜组织进行下一步检测；
65.②
炎症反应检测：使用he染色检测组织形态及炎症反应情况，进一步通过elisa检测粘连组织中il-6、il-1β、tgf-β1等明确组织炎症反应情况；
66.③
氧化应激相关指标检测：通过冰冻切片染色ros检测组织中活性氧水平，进一步通过elisa检测粘连组织中mda、gsh、sod等水平；
67.④
通过免疫组化染色检测组织中sirt3的表达情况，进一步通过免疫组化染色ck19检测腹膜修复情况；
68.⑤
构建并培养人腹膜间皮细胞间质株hmrsv5，检测和厚朴酚作用后腹膜间皮细胞对于h2o2诱导的氧化应激损伤的保护作用，包括流式细胞仪检测细胞凋亡情况、氧化应激相关水平ros/mda/gsh/sod等、westernbolt检测细胞凋亡相关蛋白水平，并进一步检测sirt3的表达情况；
69.(3)、透明质酸钠包被的pla和厚朴酚纳米水凝胶抑制术后腹腔粘连形成作用及其机制的研究(请参阅本发明中的第二技术路线图，即图5)：
70.①
材料合成：首先通过pla包被和厚朴酚将其制备成为纳米颗粒后进一步检测其物理性能，包括细胞毒性、可溶性、释放率等；进一步使用透明质酸钠凝胶将制备好的pla包
被的纳米颗粒制备成水凝胶并检测在该材料中和厚朴酚的释放率、材料毒性、刚度等；
71.②
体内动物实验检测新型材料生物作用：48只大鼠随机分为6组，假手术组仅行开关腹手术、对照组使用盲肠搔刮法造模不行任何治疗、透明质酸钠组使用透明质酸钠治疗、和厚朴酚治疗组使用和厚朴酚治疗、pla包被和厚朴酚治疗组用pla和厚朴酚颗粒溶于水后治疗、水凝胶组使用合成的酶响应水凝胶治疗，同上，7天后处死小鼠，使用nair’s评分评估粘连形成情况，并进一步取腹膜组织行下一步检测；
72.③
炎症反应检测：同前；
73.④
氧化应激相关指标检测：同前；
74.⑤
氧化应激相关指标检测：同前；
75.⑥
通过免疫组化染色检测组织中sirt3的表达情况，进一步通过免疫组化染色ck19检测腹膜修复情况；
76.⑦
材料降解性及毒性检测：将合成的水凝胶材料埋藏于皮下，检测不同时间段后水凝胶降解情况。将大鼠不同组别材料组和对照组肝脏及脾脏多处取材，通过he染色检测肝脏毒性等；
77.⑧
细胞生物学实验：培养人腹膜间皮细胞间质株hmrsv5，使用不同浓度的酶降解水凝胶、pla包被的和厚朴酚颗粒检测h2o2诱导的氧化应激损伤后新型材料对于腹膜间皮细胞氧化的保护作用，包括细胞凋亡、细胞氧化应激情况等；
78.目前对于术后腹腔粘连的方式方法多数仅仅基于单纯物理屏障隔离为主，其作用效果有效，主要原因是忽视了腹膜修复在粘连形成中的作用，特别是腹膜间皮细胞修复的作用；本发明提出在使用透明质酸钠水凝胶隔离的基础上加用促进腹膜修复的药物和厚朴酚这一理论，将有助于从不同层次以不同机制预防术后腹腔粘连形成，目前鲜有相关研究报道，此为本发明理论创新；
79.目前虽然新型材料在术后腹腔粘连防治中的作用及机制的研究层出不穷，但是基于sirt3这一作用靶点的相关药物尚未见报道；此外，pla包被的和厚朴酚纳米材料及透明质酸钠水凝胶在术后腹腔粘连中的应用均少有研究，本发明将两种新型材料结合，以期实现促进腹膜有序修复，这种方法目前尚无有相关报道，此为本发明方法创新；
80.术后腹腔粘连形成是一个复杂的生物学过程，涉及众多分子机制，本研究中初步探究了sirt3在术后腹腔粘连形成中的作用特别是其减轻氧化应激损伤的作用目前尚无相关报道，此为本发明分子机制创新；
81.本发明的经济效益：
82.术后腹腔粘连是常见的外科手术后并发症，预防术后腹腔粘连几乎是所有腹部手术后必须进行的环节，目前常用的预防术后腹腔粘连形成的药物作用有限，本发明拟开发一款新型预防术后腹腔粘连药物，该药物如能顺利应用于临床将有着广大的市场，有着丰厚的经济效益。
83.本发明的社会效益：
84.术后腹腔粘连几乎发生于所有腹部手术后患者中，术后腹腔粘连可引起一系列与之相关的并发症，包括慢性腹部疼痛、女性不孕、肠梗阻、便秘再次手术困难等等，这些并发症的发展不仅增加患者手术痛苦，也会增加额外医疗花费，对人们健康造成严重威胁；因此，本发明拟探究术后腹腔粘连形成机理，并开发一种新型预防术后腹腔粘连药物，旨在减
轻腹部手术后患者痛苦，增加腹部手术后患者社会归属感，有着重要的社会意义及应用前景；
85.本发明的推广应用前景分析：
86.术后腹腔粘连发病率极高，所引起的并发症造成患者一系列痛苦，因此积极探索其防治办法十分必要。腹腔手术后预防术后腹腔粘连几乎是必要的环节，因此本发明的进行有着重要的社会意义，如本发明顺利实施，将有助于开发新型预防术后腹腔粘连药物，有着广泛的应用前景。
87.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种新型预防术后腹腔粘连药物，其特征在于，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒20-50份、和厚朴酚15-35份、透明质酸钠10-30份。2.根据权利要求1所述的一种新型预防术后腹腔粘连药物，其特征在于，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒30-40份、和厚朴酚20-30份、透明质酸钠15-25份。3.根据权利要求2所述的一种新型预防术后腹腔粘连药物，其特征在于，包括如下重量份原料：pla纳米颗粒35份、和厚朴酚25份、透明质酸钠20份。4.制备如权利要求1-3中任意一项所述的一种新型预防术后腹腔粘连药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、制备纳米材料：基于pla纳米颗粒以及和厚朴酚制得纳米材料；s2、制备细胞外基质金属酶响应水凝胶：将纳米材料以及透明质酸钠进行合成，最终制得细胞外基质金属酶响应水凝胶。

技术总结
本发明提供一种新型预防术后腹腔粘连药物及其制备方法，属于术后腹腔粘连治疗技术领域，该药物包括如下重量份原料：PLA纳米颗粒20-50份、和厚朴酚15-35份、透明质酸钠10-30份，本发明旨在探究术后腹腔粘连形成机理并开发预防术后腹腔粘连药物，继而有效减轻腹部手术后患者痛苦，增加腹部手术后患者社会归属感，本发明有着重要的社会意义及应用前景。本发明有着重要的社会意义及应用前景。本发明有着重要的社会意义及应用前景。


技术研发人员：吴云桦 刘栋 刘思达
受保护的技术使用者：陕西省人民医院
技术研发日：2022.11.21
技术公布日：2023/9/22