胃泌酸调节素结合分子及其用途的制作方法

胃泌酸调节素结合分子及其用途
1.胃泌酸调节素是胰高血糖素样肽-1(glp-1)和胰高血糖素受体两者的胰高血糖素原(proglucagon)衍生肽激动剂，并且是胃酸分泌和能量消耗的关键调节剂。胃泌酸调节素是关于治疗干预的潜在靶标(pocai a，mol.metab.2014；3：241-51)，并且已被提议为潜在的生物标记物，用于预测受试者在急性胰腺炎后是否处于发展2型糖尿病的风险中(bharmal，sh等人，clin.transl.gastroenterology 2020；11：第e00132页，doi：10.14309/ctg.00000000 00000132)。
2.人胰高血糖素原以组织特异性方式切割成许多不同的肽(holst jj等人，peptides 2018；100：48-53)，并且在胰高血糖素原切割肽之间的序列相似性已使得难以定量胃泌酸调节素的内源水平。在历史上，针对胰高血糖素的特定区域(33-61)或c末端八肽(62-69)的多克隆抗体已用于定量各种组织和血浆中的胃泌酸调节素样免疫反应性(oli)组分。最初，两步扣除放射免疫测定用于估计在胰腺胰高血糖素水平的特异性扣除后的oli(kervran a等人，endocrinology 1987；121：704-1)。后续测定使用针对c末端八肽的多克隆抗体来直接测量oli组分(blache p等人，anal biochem 1988；173：151-9；collie nl等人，proc natl acad sci u s a 1994；91：9362-6；le quellec a等人，j.clin.endocrinol.metab1992；74：1405)，并且基于该方法的测定目前是商购可得的。
3.尽管如此，人血浆中的内源性oli的估计值在禁食状态下从60到5000ng/l广泛变化(laferrere b等人，j.clin.endocrinol.metab.2010；95：4072-6；le quellec a等人，j.clin.endocrinol.metab 1992；74：1405-9)。此外，以肠高血糖素为代表的oli的比例混淆了准确的胃泌酸调节素定量，并且掩盖了胃泌酸调节素的生理作用(bak mj等人，eur.j.endocrinol.2014；170：529-3)。可以使用hplc或lc-ms将胃泌酸调节素与肠高血糖素区分开，但这些方法缺乏足够的分析灵敏度来定量血浆中的胃泌酸调节素的内源水平(lee ay等人，clin.chem.2015；62：227-235)。夹心测定已得到报道(albrechtsen，nj等人，ebiomedicine2016；7：112-120)，但它缺乏特异性，因为它的特征在于与肠高血糖素的10％交叉反应性(holst jj等人，peptides 2018；100：48-53)。
4.因此，在胃泌酸调节素发现后的几十年，研究界一直无法选择性地和可靠地测量人血浆样品中的胃泌酸调节素的内源水平，并且仍然需要不仅是选择性和灵敏的、而且还顺应高通量应用的测定。
5.夹心免疫测定是一种利用结合目的抗原上不同位点的两种抗体的测定。然而，为了实施胃泌酸调节素夹心免疫测定，需要这样的抗体，其(a)结合分别胰高血糖素原片段的不同表位，并且(b)仅当在测定中一起使用时才检测胃泌酸调节素。本发明提供了这样的抗体和方法，其促进了用于定量胃泌酸调节素的夹心测定方法、以及用于确定受试者是否处于发展糖尿病的风险中的预测方法。
6.本发明提供了结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域的多肽分子，其中所述多肽分子包含seq id no：1-6中所示的互补决定区(cdr)。在一个实施方案中，多肽分子是抗体。在另一个实施方案中，多肽分子是抗体片段，其中所述抗体片段结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：
30)各自的n末端区域，并且包含seq id no：1-6。在另一个实施方案中，抗体片段是scfv。在另一个实施方案中，抗体片段是fab。
7.在另一个实施方案中，多肽分子是含有包含seq id no：7的重链可变区(hcvr或vh)以及包含seq id no：8的轻链可变区(lcvr或vl)的抗体。在另一个实施方案中，多肽分子是含有包含seq id no：9的重链以及包含seq id no：10的轻链的抗体。在另一个实施方案中，多肽分子是包含由seq id no：9组成的重链以及由seq id no：10组成的轻链的抗体。本发明还提供了包含多肽分子的组合物。
8.本发明还提供了核酸分子，其包含编码seq id no：9的第一核酸序列和编码seq id no：10的第二核酸序列之一或两者。在另一个实施方案中，编码seq id no：9的第一核酸序列包含seq id no：11的核酸，并且编码seq id no：10的第二核酸序列包含seq id no：12的核酸。本发明还提供了载体，其包含编码seq id no：9的第一核酸序列和编码seq id no：10的第二核酸序列之一或两者。本发明还提供了包含该载体的组合物。本发明还提供了包含该载体的细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本发明还提供了生产多肽分子的方法，其包括在使得多肽分子表达的条件下培养细胞，并且从培养基中回收所表达的多肽分子。本发明还提供了通过该方法产生的多肽分子。
9.本发明还提供了结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域的多肽分子，其中所述多肽分子包含seq id no：13-18中所示的互补决定区。在一个实施方案中，多肽分子是抗体。在另一个实施方案中，多肽分子是抗体的片段，其中所述片段结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域。在另一个实施方案中，多肽分子的片段是scfv。在另一个实施方案中，多肽分子的片段是fab。
10.在另一个实施方案中，多肽分子是含有包含seq id no：19的vh以及包含seq id no：20的vl的抗体。在另一个实施方案中，多肽分子是含有包含seq id no：21的重链以及包含seq id no：22的轻链的抗体。在另一个实施方案中，多肽分子是包含由seq id no：21组成的重链以及由seq id no：22组成的轻链的抗体。本发明还提供了包含多肽分子的组合物。
11.本发明还提供了核酸分子，其包含编码seq id no：21的第一核酸序列和编码seq id no：22的第二核酸序列之一或两者。在一个实施方案中，编码seq id no：21的第一核酸序列包含seq id no：23的核酸，并且编码seq id no：22的第二核酸序列包含seq id no：24的核酸。本发明还提供了载体，其包含编码seq id no：23的第一核酸序列和编码seq id no：24的第二核酸序列之一或两者。本发明还提供了包含该载体的组合物。本发明还提供了包含该载体的细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本发明还提供了生产多肽分子的方法，其包括在使得多肽分子表达的条件下培养细胞，并且从培养基中回收所表达的多肽分子。本发明还提供了通过该方法产生的多肽分子。
12.本发明还提供了组合物，其包含(a)结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域的第一多肽分子，其中所述第一多肽分子包含seq id no：1-6，以及(b)结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域的第二多肽分子，其中所述第二多肽分子包含seq id no：13-18。
13.本发明还提供了用于确定液体样品中的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的量的
夹心测定方法，其包括：(a)使包含人胃泌酸调节素的液体样品与第一多肽分子接触，所述第一多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域，其中所述第一多肽分子包含seq id no：13-18，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物；(b)接触结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域的第二多肽分子，其中所述第二多肽分子包含seq id no：1-6，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物；和(c)通过针对已知量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的标准曲线比较，来定量第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物中的胃泌酸调节素的量。
14.在本发明的方法的另一个实施方案中，第一多肽分子是抗体，并且第二多肽分子是抗体。在另一个实施方案中，第一多肽分子是含有包含seq id no：19的vh以及包含seq id no：20的vl的抗体，并且第二多肽分子是含有包含seq id no：7的vh以及包含seq id no：8的vl的抗体。在另一个实施方案中，第一多肽分子是含有包含seq id no：21的重链以及含有包含seq id no：22的轻链的抗体，并且第二多肽分子是含有包含seq id no：9的重链以及包含seq id no：10的轻链的抗体。在另一个实施方案中，第一多肽分子是包含由seq id no：21组成的重链且包含由seq id no：22组成的轻链的抗体，并且第二多肽分子是包含由seq id no：9组成的重链以及由seq id no：10组成的轻链的抗体。
15.本发明还提供了预测受试者是否处于发展2型糖尿病的风险中的方法，其包括确定来自受试者的血清样品或血浆样品中的胃泌酸调节素浓度，其包括：(a)使包含人胃泌酸调节素的血清样品或血浆样品与第一多肽分子接触，所述第一多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端，其中所述第一多肽分子包含seq id no：13-18，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物；(b)接触结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域的第二多肽分子，其中所述第二多肽分子包含seq id no：1-6，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物；和(c)通过针对已知量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的标准曲线比较，来定量第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物中的胃泌酸调节素的量。在该方法的一个实施方案中，受试者已诊断有急性胰腺炎。
16.本发明还提供了第一多肽分子和第二多肽分子在确定液体样品中的胃泌酸调节素浓度中的用途，所述第一多肽分子结合存在于人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自中的c末端八肽，所述第二多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域。
17.在本发明的方法的一个实施方案中，液体样品是血清。在另一个实施方案中，液体样品是血浆。
18.在本发明的方法中，第一多肽分子可以附着到固体支持物。在一个实施方案中，固体表面是板。在另一个实施方案中，固体表面是多个珠。此类固体支持物包括例如但不限于玻璃、纤维素、塑料、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
19.在本发明的方法的另一个实施方案中，第一多肽分子直接附着到固体表面。在另一个实施方案中，第一多肽分子用附着剂间接附着到固体表面。在一个实施方案中，附着剂是在固体表面上包被的链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，并且多肽分子是生物素化的。
20.在本发明的方法的另一个实施方案中，在使液体样品与第一多肽分子接触之前，使固体表面与封闭溶液接触。在另一个实施方案中，在使液体样品与第一多肽分子接触后，使第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物与洗涤溶液接触，从而去除未复合的人胃泌酸调节素。
21.在本发明的方法的另一个实施方案中，使第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物与洗涤溶液接触，从而去除未复合的第二多肽分子。
22.在确定液体样品例如血浆中的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的量的方法的另一个实施方案中，该方法包括：
23.(a)使固体表面与封闭溶液接触，含有包含seq id no：21的重链以及包含seq id no：22的轻链的抗体与所述固体表面附着；
24.(b)使包含人胃泌酸调节素的液体样品与附着到固体表面的第一抗体接触，所述第一抗体含有包含seq id no：21的重链以及包含seq id no：22的轻链，从而形成第一抗体-人胃泌酸调节素复合物；
25.(c)使固体表面与洗涤溶液接触，从而去除未复合的人胃泌酸调节素；
26.(d)使固体表面与第二抗体接触，所述第二抗体含有包含seq id no：9的重链和包含seq id no：10的轻链，从而形成第一抗体-人胃泌酸调节素-第二抗体复合物；
27.(e)使固体表面与洗涤液接触，从而去除未复合的第二抗体；和
28.(f)通过针对已知量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的标准曲线比较，来定量第一抗体-人胃泌酸调节素-第二抗体复合物中的胃泌酸调节素的量。
29.在本发明的预测方法的另一个实施方案中，该方法包括：
30.(a)使固体表面与封闭溶液接触，含有包含seq id no：21的重链以及包含seq id no：22的轻链的抗体与所述固体表面附着；
31.(b)使包含人胃泌酸调节素的液体样品与附着到固体表面的第一抗体接触，所述第一抗体含有包含seq id no：21的重链以及包含seq id no：22的轻链，从而形成第一抗体-人胃泌酸调节素复合物；
32.(c)使固体表面与洗涤溶液接触，从而去除未复合的人胃泌酸调节素；
33.(d)使固体表面与第二抗体接触，所述第二抗体含有包含seq id no：9的重链和包含seq id no：10的轻链，从而形成第一抗体-人胃泌酸调节素-第二抗体复合物；
34.(e)使固体表面与洗涤液接触，从而去除未复合的第二抗体；和
35.(f)通过针对已知量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的标准曲线比较，来定量第一抗体-人胃泌酸调节素-第二抗体复合物中的胃泌酸调节素的量。
36.在本发明的方法的另一个实施方案中，第二多肽分子是标记的。在另一个实施方案中，第二多肽的量的定量通过对标记进行定量来执行。在另一个实施方案中，标记是放射性标记。在另一个实施方案中，放射性标记是钌。
37.本发明的多肽分子、方法和用途促进定量胃泌酸调节素，其为选择性和灵敏的。在一个实施方案中，该方法导致以下中的一种或多种：0.4ng/l的胃泌酸调节素定量下限(lloq)、不检测胰高血糖素、和/或与肠高血糖素的小于0.5％交叉反应性。本发明的方法的另一个益处在于它促进胃泌酸调节素的餐前和餐后水平的定量，其结果与使用常规正交ia-lc-ms测定获得的结果高度相关联。
38.人胰高血糖素原(seq id no：36)含有180个氨基酸残基，并且由gcg基因(gcg-胰高血糖素原前体-智人(homo sapiens)(人)-gcg基因和蛋白质，unprot.org/uniprot/p01275#sequences(2007))编码。这种多肽前体以组织特异性方式区别地切割成许多不同的肽，以生成一组具有不同生物活性的肽：信号肽(氨基酸残基1-20)；人肠高血糖素(氨基酸残基21-89)；人肠高血糖素相关胰多肽(氨基酸残基21-50)；人胃泌酸调节素(氨基酸残基53-89)；人胰高血糖素(氨基酸残基53-81)；人胰高血糖素样肽1(glp-1)(氨基酸残基92-128)；人glp-1(7-37)(氨基酸残基98-128)；人glp-1(7-36)(氨基酸残基98-127)；以及人胰高血糖素样肽2(glp-2)(氨基酸残基146-178)。来自常见多肽前体(seq id 36)的组织特异性切割模式的一个后果是具有一些序列重叠的生物活性肽的生成。例如，人胃泌酸调节素(氨基酸残基53-89)含有人胰高血糖素(氨基酸残基53-81)中包含的所有序列，加上延伸超过氨基酸残基81的8个氨基酸。作为另一个实例，存在于人胃泌酸调节素(氨基酸残基53-89)和人胰高血糖素(氨基酸残基53-81)中的序列也包含在人肠高血糖素(氨基酸残基21-89)中；然而，人肠高血糖素(氨基酸残基21-89)含有在人胃泌酸调节素(氨基酸残基53-89)和人胰高血糖素(氨基酸残基53-81)两者中的残基53之前的另外32个氨基酸。
39.本文提及的序列在表1中阐述。表1中的某些序列名称中的括号里的编号指包括信号肽序列(残基1-20)的人胰高血糖素原中的分别氨基酸残基。例如，在术语“人胃泌酸调节素(53-89)”中，术语“(53-89)”指人胰高血糖素原中的氨基酸残基53-89。表1中提供了不含术语“人”的人序列的缺失版本。例如，术语“胃泌酸调节素(55-89)”指人胃泌酸调节素片段，其序列对应于人胰高血糖素原的氨基酸残基55-59，并且不包含在人胃泌酸调节素中发现的前两个n末端氨基酸残基。
40.[0041][0042]
如本文使用的，术语“人胰高血糖素和人胃泌酸调节素各自的n末端区域”指那些肽各自中的前三个氨基酸残基，其中存在n末端组氨酸。
[0043]
如本文使用的，术语“结合人胰高血糖素和人胃泌酸调节素各自的n末端区域”指(a)与其各自具有n末端组氨酸残基的人胃泌酸调节素(53-59)(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自结合，(b)并不与胃泌酸调节素(55-89)或胃泌酸调节素(56-89)结合，因为胃泌酸调节素(55-89)和胃泌酸调节素(56-89)并不含有在人胃泌酸调节素(53-59)和人胰高血糖素(seq id no：30)中发现的n末端组氨酸残基，并且(c)并不与肠高血糖素区段(49-89)结合，因为尽管肠高血糖素区段(29-69)含有组氨酸，但它不存在游离胺末端。
[0044]
如本文使用的，术语“人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域”指人胃泌酸调节素中的氨基酸残基30-37和人肠高血糖素(seq id no：28)中的氨基酸残基61-69。
[0045]
如本文使用的，术语“结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域”指结合人胃泌酸调节素中的氨基酸残基30-37中的一个或多个、以及人肠高血糖素(seq id no：28)中的氨基酸残基61-69的一个或多个。
[0046]
如本文使用的，术语“n末端抗体”指具有seq id no：9的重链氨基酸序列和seq id no：10的轻链氨基酸序列的抗体。
[0047]
如本文使用的，术语“c末端抗体”指具有seq id no：21的重链氨基酸序列和seq id no：22的轻链氨基酸序列的抗体。
[0048]
如本文使用的，术语“多肽分子”指包含氨基酸残基的聚合物的分子。在一个实施方案中，多肽分子由氨基酸残基的聚合物组成。
[0049]
如本文使用的，术语“接触”指一种物质暴露于另一种物质。例如，在允许多肽分子结合样品中存在的人胃泌酸调节素的时间和条件下，样品可以暴露于本发明的多肽分子。此类时间和条件是本领域技术人员已知的，和/或可以根据本文引用的参考文献，通过本领域已知的方法常规进行确定。
[0050]
如本文使用的，术语“复合物”指在例如多肽分子和人胃泌酸调节素(seq id no：25)之间的蛋白质-蛋白质相互作用。如本文使用的，“第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物”指在本发明的多肽分子的分子和人胃泌酸调节素(seq id no：25)的分子之间的蛋白质-蛋白质相互作用。如本文使用的，“第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物”指在以下之间的伴随蛋白质-蛋白质相互作用：(a)本发明的第一多肽分子的分子和人胃泌酸调节素(seq id no：25)的分子，以及(b)本发明的第二多肽分子的分子和人胃泌酸调节素分子(seq id no：25)的同一分子。
[0051]
如本文使用的，术语“定量胃泌酸调节素的量”指测量样品例如液体样品中的胃泌酸调节素的量。合适的测定是本领域普通技术人员已知的，例如elisa。
[0052]
本发明的多肽分子可以与酶缀合并且用于酶联免疫吸附测定(elisa)中。此类测定在例如butler(1994)“elisa”(第29章)，in：van oss，c.j.等人，编辑，immunochemistry，marcel dekker，inc.，new york，第759-803页中进行详细描述。本文的多肽分子还可以用于胃泌酸调节素表达的放射免疫测定和荧光激活细胞分选(facs)分析中。
[0053]
可以通过各种免疫测定方法来测量特定蛋白质如人胃泌酸调节素，所述方法包括例如但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用技术例如但不限于蛋白质印迹、放射免疫测定、elisa(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白a免疫测定。关于一般而言的免疫学和免疫测定程序的综述，参见例如stites和terr(编辑)，basic and clinical immunology(第7版)(1991)。此外，免疫测定可以以如本领域已知的许多配置执行(参见例如maggio(编辑)，enzyme immunoassay crc press，boca raton，florida(1980)；gosling jp，immunoassays：a practical approach (practical approach series)，oxford univ press(2000)；diamandis&christopoulus，immunoassay，academic press(san diego，ca)(1996)。
[0054]
如本文使用的，术语“抗体”指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性或多特异性抗体、或缀合抗体。抗体可以属于任何类别(例如igg、ige、igm、igd、iga)和任何亚类(例如iggl、igg2、igg3、igg4)。
[0055]
本公开内容的示例性抗体是免疫球蛋白g(igg)型抗体，其由四条多肽链构成：经由链间二硫键交联的两条重链(hc)和两条轻链(lc)。四条多肽链各自的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-125个或更多个氨基酸的可变区。四条多肽链各自的羧基末端部分含有主要负责效应子功能的恒定区。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区构成。igg同种型可以进一步分成亚类(例如igg1、igg2、igg3和igg4)。
[0056]
vh和vl区可以进一步细分成称为互补决定区(cdr)的高变区，其散布着称为框架区(fr)的更保守区域。cdr暴露在蛋白质的表面上，并且是关于抗原结合特异性的抗体的重要区域。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按下述次序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文中，重链的三个cdr被称为“hcdr1、hcdr2和hcdr3”，而轻链的三个cdr被称为“lcdr1、lcdr2和lcdr3”。cdr含有与抗原形成特异性相互作用的大多数残基。可以根据众所周知的方案来完成氨基酸残基对cdr的分配，所述方案包括以下中描述的那些方案：kabat(kabat等人，“sequences of proteins of immunological interest，”national institutes of health，bethesda，md.(1991))，chothia(chothia等人，“canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”，journal of molecular biology，196，901-917(1987)；al-lazikani等人，“standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”，journal of molecular biology，273，927-948(1997))，north(north等人，“a new clustering of antibody cdr loop conformations”，journal of molecular biology，
406，228-256(2011))，或imgt(在www.imgt.org；处可获得的国际immunogenetics数据库；参见lefranc等人，nucleic acids res.1999；27：209-212)。
[0057]
如本文使用的，“抗体片段”或“抗原结合片段”包含抗体的至少一部分，其保留与抗原或抗原的表位特异性相互作用的能力，例如fab、fab
′
、f(ab’)2、fv片段、scfv抗体片段、scfab、二硫键连接的fv(sdfv)、fd片段。
[0058]
除非另有说明，否则如本文使用的术语“结合(bind)”和“结合(binds)”预期意指蛋白质或分子与另一种蛋白质或分子形成化学键或吸引相互作用的能力，其导致如通过本领域已知的常见方法确定的两种蛋白质或分子的接近，例如在两种分子例如本发明的多肽分子和例如人胃泌酸调节素(seq id no：25)之间的分子相互作用。在一个实施方案中，本发明的多肽分子特异性结合人胃泌酸调节素。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子与人胃泌酸调节素的相互作用更频繁、更迅速、具有更长的持续时间、具有更大的亲和力或以上的一些组合。在另一个优选的实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.1mm或更小的kd结合人胃泌酸调节素。在另一个优选的实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.01mm或更小的kd结合人胃泌酸调节素。在另一个优选的实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约o.001mm或更小的kd结合人胃泌酸调节素。在另一个优选的实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.0001mm或更小的kd结合人胃泌酸调节素。
[0059]
通过将编码hcvr的多核苷酸可操作地连接到编码重链恒定区的另一个多核苷酸分子，可以将编码hcvr区的分离的多核苷酸分子转换为全长重链基因。人以及其它哺乳动物的重链恒定区基因的序列是本领域已知的。包含这些区域的多核苷酸片段可以例如通过标准pcr扩增来获得。
[0060]
通过将编码lcvr的多核苷酸可操作地连接到编码轻链恒定区的另一个多核苷酸分子，可以将编码lcvr区的分离的多核苷酸分子转换为全长轻链基因。人以及其它哺乳动物的轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。包含这些区域的多核苷酸片段可以通过标准pcr扩增来获得。
[0061]
如本文使用的，术语“灵敏度”指可以以可接受的准确度和精确度进行测量的分析物(在这种情况下，人胃泌酸调节素)的最低水平。灵敏度例如由定量下限(lloq)反映，根据本发明，所述定量下限通过获取胃泌酸调节素的样品，并且将其连续稀释直到％cv(变异系数)超过20％来确定。
[0062]
术语“可检测标记的”意指本发明的多肽分子或胃泌酸调节素和多肽分子的复合物具有与其共价或非共价地附着的有用的可检测标记。在直接缀合物标记的方法中，可以采用许多不同的有用标记，包括例如，辅基复合物、生色团、色原体(产色底物)、染料、荧光化合物、产荧光化合物(fluorogenic compound)、放射性同位素、顺磁性同位素、以及可以通过正电子发射断层扫描(pet)和磁共振成像(mri)进行成像的化合物。
[0063]
在序列可操作地连接到表达控制序列后，本发明的核酸分子可以在宿主细胞中进行表达。表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体dna的整合部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记物，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许用所需多核苷酸序列转化的那些细胞的检测。
[0064]
通过取决于宿主细胞的类型而变的已知方法，可以将含有目的核酸序列(例如，编
码本发明的一种或多种多肽分子的核酸序列和表达控制序列)的表达载体转移到宿主细胞内。
[0065]
本发明的多肽分子可以在哺乳动物宿主细胞中产生，所述哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括cho、ns0、hek293或cos细胞。宿主细胞可以使用本领域已知的技术进行培养。本发明的多肽分子可以基本上如下进行表达且纯化。适当的宿主细胞例如hek 293或cho，可以用表达系统进行瞬时或稳定转染，用于分泌多肽例如抗体，其使用最佳的预定重链：轻链载体比率或编码重链和轻链两者的单一载体系统。编码本发明的多肽分子的核酸可以用表达系统进行瞬时或稳定转染用于分泌多肽，其使用编码例如抗体重链和轻链的一种或多种dna分子。
[0066]
可以采用各种蛋白质纯化方法来纯化本发明的多肽分子，并且此类方法是本领域已知的，并且例如在deutscher，methods in enzymology182：83-89(1990)以及scopes，protein purification：principles and practice，第3版，springer，ny(1994)中进行描述。
[0067]
例如，培养基可以方便地应用于mabselect柱(ge healthcare life sciences)或kappaselect柱(ge healthcare life sciences)，所述柱已用相容缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4)进行平衡。柱可以进行洗涤，以去除非特异性结合组分。结合的多肽分子可以例如通过ph梯度(例如20mm tris缓冲液ph 7.0至10mm柠檬酸钠缓冲液ph 3.0，或磷酸盐缓冲盐水ph 7.4至100mm甘氨酸缓冲液ph 3.0)进行洗脱。抗体级分可以例如通过uv吸光度或sds-page进行检测，然后可以合并。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。纯化的多肽分子可以使用常见技术进行浓缩和/或无菌过滤。可溶性聚集体和多聚体可以通过常见技术有效地去除，所述技术包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模式或羟磷灰石层析。纯化的多肽分子可以立即在-70℃下冷冻或可以是冻干的。
[0068]
通过检测血清或血浆中存在的胃泌酸调节素水平，本文公开的多肽分子可用于诊断、预后和/或患者监测程序。
[0069]
可以通过γ计数器、闪烁计数器或放射自显影术简单地检测的有用的放射性标记包括3h、
124
i、
125
i、
131
i、
35
s和
14
c。放射性核素可以使用螯合剂如dtpa和edta，与本文所述的多肽分子直接或间接地结合。此类放射性核素的实例包括
99
tc、
123
i、
125
i、
131
i、
111
in、
97
ru、
67
cu、
67
ga、
68
ga、
72
as、
89
zr、
90
y和
201
tl。
[0070]
其它合适的标记是本领域已知的或可以通过常规实验进行确定。例如，抗体例如t末端抗体可以与例如酶缀合。然后可以通过在适当条件下与酶的显色底物反应以产生可检测信号，来检测另一种抗体与人胃泌酸调节素的结合，所述人胃泌酸调节素本身还与第一一级抗体例如c末端抗体结合。
[0071]
可以使用采用显色化合物的比色检测，所述显色化合物具有或导致具有高消光系数的生色团，并且因此可容易检测到。当随后在适当的反应条件下暴露于其底物时，酶将与底物反应以产生化学标记，其可以例如通过分光光度计、荧光计或视觉手段进行检测。
[0072]
通常用于此目的的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
[0073]
合适的辅基复合物的非限制性实例包括例如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素和中性抗生物素蛋白/生物素。色原体的使用是优选的，因为采用其的测定可以在临床诊断实验室中容易地执行，并且通过病理学家用这些实验室中通常可获得的设备进行审查。常用的色原体包括二氨基联苯胺(dab)；具有增强的dab；3-氨基-9-乙基咔唑(aec)；4-氯-1-萘酚(4-cn)；hanker-yates试剂；α-萘酚焦宁；3，3
′
，5，5
′‑
四甲基联苯胺(tmb)；fast blue bb；fast red tr；新品红；bcip-nbt；四唑；四硝基蓝四唑鎓(tetranitoblue tetrazolium，tnbt)；以及具有银增强的免疫金。
[0074]
有用的荧光标记包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、二氯三嗪胺荧光素、罗丹明、丹酰基、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺和cy5(haugland((1996)handbook of fluorescent probes and research chemicals，第六版，molecular probes，eugene，or)。
[0075]
多肽分子或多肽分子-胃泌酸调节素复合物也可以通过使用荧光发射金属例如
152
eu+或镧系元素的其它成员，通过使用此类金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺-四乙酸(edta)将其附着，来进行可检测标记。
[0076]
多肽分子也可以通过将其与发磷光或化学发光化合物偶联进行可检测标记，所述发磷光或化学发光化合物然后可以通过在化学反应的过程期间出现的磷光或发光进行检测。有用的化学发光化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。同样地，生物发光化合物如萤光素、萤光素酶或水母发光蛋白可以用于标记抗体肽。生物发光蛋白的存在通过检测发光的存在进行确定。
[0077]
本发明还提供了含有可用于定量人胃泌酸调节素的组合物的制造物品和试剂盒。制造物品可以包含具有书面标签的容器。容器可以容纳包含本发明的多肽分子的组合物，所述多肽分子或可检测地标记或未标记。
[0078]
本发明的试剂盒还可以含有包含本发明的第一多肽分子和第二多肽分子的容器。第二多肽分子可以与酶或其它标记缀合。酶的显色底物也可以包括在试剂盒中。试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度期望的其它材料，包括用于体内、体外或两者使用的缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有说明书的包装插页。
[0079]
下述实施例仅提供用于说明用途，并不预期限制本发明的范围。
[0080]
实施例1
[0081]
抗体结合研究
[0082]
使用biacore t100(ge healthcare life sciences)，通过表面等离子体共振来确定n末端抗体和c末端抗体的动力学分析和结合特异性。将山羊抗小鼠igg抗体(southern biotech)固定到series s cm5传感器芯片上，并且用于捕获大约1500个响应单位的抗胃泌酸调节素igg。与在运行缓冲液(含有3mmol/l edta和0.05％tween的hepes缓冲盐水)中稀释的各种浓度的人胃泌酸调节素(seq id no：25)(1.1至90nmol/l)的一式两份注射液、以及22.5nmol/l人肠高血糖素区段(49-89)(seq id no：29)或人胰高血糖素(53-81)(seq id no：30)肽的结合用30μl/分钟的流速进行测量。使用1∶1结合模型与t 100评估软件来确定动力学常数。
[0083]
使用n末端抗体的biacore分析，平衡解离常数为1.5x10-10
mol/l(表2)。n末端抗体
显示出与肠高血糖素区段(48-89)肽(seq id no：29)的最低限度结合。
[0084][0085]
使用c末端抗体的biacore分析，c末端抗体解离常数为8.3x10-11
mol/l(表2)。c末端抗体显示出与人胰高血糖素(53-81)(seq id no：30)的最低限度结合。
[0086]
实施例2
[0087]
标准曲线
[0088]
关于该测定的最佳抗体配对利用c末端抗体作为捕获抗体以及n末端抗体作为检测抗体。标准曲线用合成人胃泌酸调节素(seq id no：25)进行制备，所述合成人胃泌酸调节素在测定缓冲液中从50,000ng/l的起始浓度进行连续稀释。基于来自零位校准器的3-sd评估，lloq确定为0.4ng/l。该测定证实了极佳的动态范围，具有2500ng/l的定量上限(uloq)(表3)。由于胃泌酸调节素是ddp-4的底物，并且这种切割将去除由报道试剂抗体识别的n末端新表位，因此比较了在p800或k2 edta收集管中收集的6组匹配的人血浆，以评估来自样品收集后的离体蛋白酶解降解的效应。观察到与p800管相比，用k2 edta中收集的血液测量的胃泌酸调节素的量的大约35-40％减少。
[0089]
表3中概述了免疫测定的另外关键属性。
[0090][0091][0092]
使用高(2500ng/l)、中(500ng/l)或低(100ng/l)胃泌酸调节素浓度，分批内和分批间变异性为≤10％。在测定缓冲液和掺杂有2500ng/l胃泌酸调节素标准品的人血浆池两
者的16倍稀释后，该测定证实了具有＜15％cv的极佳稀释线性。用两种不同的人血浆样品的稀释度观察到测定平行性，导致分析物的计算值中的＜20％cv。使用掺杂有2500、500、100或0ng/l胃泌酸调节素的合并p800人血浆的免疫测定的稳健性对于许多参数得到证实。对于所有运行范围为90-113％的回收率以及计算的胃泌酸调节素值中的≤11％变动在六次冻融循环后观察到。最后，在表3中概述的三种不同温度条件下，证实了具有＜25％cv的p800收集的血浆中的分析物稳定性。
[0093]
免疫测定的胃泌酸调节素选择性通过测试与一组胰高血糖素原或其它生物学相关的肠降血糖素肽的结合得到证实。测量了针对以下的范围为2500至100ng/l的三个超生理浓度的胃泌酸调节素免疫测定反应性：人肠高血糖素区段(49-89)(seq id no：29)、人胰高血糖素(53-81)(seq id no：30)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)(seq id no：33)、glp-1(98-128)(seq id no：34)、glp-1(100-128)(seq id no：35)、胃泌酸调节素(55-89)(seq id no：26)、胃泌酸调节素(56-89)(seq id no：27)。肠高血糖素区段(49-89)(seq id no：29)和gip(seq id no：33)肽是仅有的在最高浓度下测量到高于背景水平的分析物。500ng/l浓度的肠高血糖素区段(49-89)(seq id no：29)也提供了略高于对于缓冲液空白对照可见的信号。出于比较并与肠高血糖素区段结果形成鲜明对比，用2500、500和100ng/l的人胃泌酸调节素(53-89)(seq id no：25)分别观察到》170,000、＞30,000和＞8,000ecl单位。
[0094]
胃泌酸调节素免疫测定的交叉反应性是最低限度的；对于肠高血糖素区段(49-89)肽(seq id no：29)(其为肠高血糖素交叉反应性的替代物)为＜0.5％且对于gip肽(seq id no：33)为0.12％。用胃泌酸调节素(55-89)肽(seq id no：26)或胃泌酸调节素(56-89)肽(seq id no：27)(其分别为2或3个残基的人胃泌酸调节素的n末端截短)并未观察到信号。当对其中同种型匹配的无关抗体取代了捕获或检测试剂的人血浆进行取样时，并未观察到信号。
[0095]
实施例3
[0096]
夹心测定
[0097]
meso scale discovery(msd)streptavidin gold multi-array 96孔板(meso scale diagnostics)用含有10mmol/l tris ph 7.4、150mmol/l nacl与1ml tween 20/l的1x tris缓冲盐水(tbs)洗涤3次，并且用含有1％(w/v)bsa(sigma)的200μl tbs进行封闭。在一小时后，允许浓度为1mg/l的50μl生物素标记的c末端抗体在室温(rt)下与板结合另外一小时。将用由50mmol/l hepes ph7.4、150mmol/l nacl、10ml/l triton x-100、各5mmol/l的edta和egta、1％(w/v)bsa、蛋白酶(roche)和二肽基肽酶4(dpp-4)(millipore)抑制剂和100mg/l异嗜性封闭试剂1(scantibodies)组成的测定缓冲液稀释的胃泌酸调节素肽标准品添加到孔中，以生成标准校准曲线。在相同的测定缓冲液中，血浆样品进行1：2稀释，并且样品和标准品两者均在4℃下温育过夜。将板洗涤并且将50μl的1ng/ml钌标记的n末端抗体加入孔中，并且允许在rt下温育1小时。在最后的洗涤步骤之后，添加150μl的2x msd读取缓冲液，并且使用msd sector imager 600(meso scale diagnostics)读数器来测量钌电化学发光单位(ecl)。
[0098]
人血浆样品。伴随知情同意，将来自18-65岁的健康男性和女性的血液样品收集到p800 edta bd
tm vacutainer(bd biosciences)收集管内。将样品贮存于冰上，并且在收集
的一小时内在4℃下用台式离心机以2000g离心20分钟。在分析胃泌酸调节素水平之前，将所得的血浆样品贮存于-70℃下。k2和p800 edta血浆也得自在10小时禁食、5-10和90-120分钟餐后的条件下的另外19个健康志愿者。餐后收集在混合膳食挑战之后，所述混合膳食挑战由大约262脂肪卡路里、274碳水化合物卡路里和100蛋白质卡路里组成。
[0099]
正常人血浆中的胃泌酸调节素水平。夹心免疫测定用于确定营养挑战对健康个体中的胃泌酸调节素血浆水平的作用。在过夜禁食后，在p800和k2 edta管中收集来自19个志愿者的血液。样品还在标准化混合膳食食用后的几分钟内和2小时内进行收集。对于分析的所有三个时间点，与用p800收集管收集的那些样品相比，来自用k2 edta管收集的样品的胃泌酸调节素值更低。胃泌酸调节素的水平在进食之后立即增加。关于p800样品的基线、早期和晚期时间点的平均值分别为11
±
9ng/l、21
±
9ng/l和33
±
14ng/l。关于k2 edta样品的基线、早期和晚期时间点的平均值分别为8
±
7ng/l、14
±
6ng/l和23
±
11ng/l。
[0100]
所有数据都表示为平均值
±
sem。msd workbench软件用于4条pl拟合校准曲线中的每一条以及未知值的内插。用sigmaplot版本11.0绘制数据，并且microsoft office excel 2010或graphpad prism 6用于数据分析。在每种情况下，≤0.05的p值被视为指示统计显著性。百分比交叉反应性确定为对于测试的每个浓度，在扣除缓冲液空白ecl计数后，目的肽的ecl计数与参考人胃泌酸调节素(53-89)(seq id no：25)肽的ecl计数的比率。
[0101]
胃泌酸调节素抗体亲和力增加6至＞200倍。测定内和测定间cv分别为7-10％和3-10％。掺杂回收率范围为90-113％，线性直到16倍稀释度是显而易见的，并且肠高血糖素交叉反应性为0.5％。与p800血浆相比，胃泌酸调节素水平在k2 edta中更低。胃泌酸调节素的餐后增加在几分钟内出现，并且水平与使用ia-lc-ms获得的水平显著相关联。
[0102]
胃泌酸调节素夹心免疫测定是适当地灵敏的、选择性的，并且还顺应高通量应用，用于来自人样品的完整胃泌酸调节素的内源水平的可靠确定。
[0103]
结合特异性人胃泌酸调节素n和c末端表位(其仅存在于分别的胰高血糖素原片段上)的一对抗体的组合，促进了具有足够选择性和灵敏度的免疫测定的创建，以确定人胃泌酸调节素的内源水平。
[0104]
免疫测定的选择性最初用其它胰高血糖素原衍生的和目的肠降血糖素肽进行评价。在胃泌酸调节素夹心免疫测定中，用肠高血糖素区段(49-89)肽(seq id no：29)的最高掺杂观察到小信号；然而，该信号比用相同浓度的人胃泌酸调节素(seq id no：25)获得的信号低多于2个数量级。内源性肠高血糖素已报道以餐后方式增加，并且在130pmol/l达到峰值(naito h等人，regul.pept.1999；79：55-61)，并且该水平仍低于本文的研究中使用的高掺杂浓度(2500ng/l[560pmol/l])，指示了内源性肠高血糖素水平并不影响本文的人胃泌酸调节素夹心免疫测定。
[0105]
人胃泌酸调节素具有在循环中的短半衰期(数分钟)(schjoldager bt等人，eur.j.clin.invest.1988；18：499-5)，并且已显示为通过dpp-4的蛋白酶解的底物(yi j等人，plos one 2015；10：e0134427；zhu l等人，j.biol.chem.2003；278：22418-23)，所述dpp-4去除前2个氨基末端残基。本文公开的新型n末端新表位抗体(seq id no：9和10)的选择性通过对缺少前2或3个残基的合成胃泌酸调节素肽(分别为seq id no：26和27)的反应性的完全缺乏得到确认。相对于p800管，在用k2 edta收集的血清中，观察到使用本文的夹心免疫测定所测量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)量的少量但可重现的减少，其确认了
内源性人胃泌酸调节素通过ddp-4或去除n末端氨基酸的一些其它相关蛋白酶进行加工，并且本文公开的夹心免疫测定选择性地仅测量完整的人胃泌酸调节素(seq id no：25)组分。
[0106]
人k2 edta和p800血浆(500μl)掺杂有人胃泌酸调节素(53-89)seq id no：25、胃泌酸调节素(55-89)seq id no：26和胃泌酸调节素(56-89)seq id：27稳定同位素标记的内部标准肽(cpc scientific)，并且用i缓冲液(25mmol/l tris-hcl、25mmol/l hepes、300mmol/l nacl、0.1％(v/v)辛基β-d-吡喃葡萄糖苷ph 7.5)进行稀释。在添加2μg生物素化的抗胰高血糖素抗体之后，允许免疫亲和富集在4℃下进行过夜(sloan jh等人，clin.biochem.2012；45：1640-4)。在温育后，将50μl的dynabeads
tm
myone
tm
链霉抗生物素蛋白t1磁珠(thermofisher scientific)加入混合物中，随后为在rt下的30分钟温育。将珠粒然后用各1ml的下述3种缓冲液序贯洗涤一次：放射免疫沉淀测定缓冲液(thermofisher scientific)，由25mmol/l tris-hcl、25mmol/l hepes、500mmol/l nacl、0.1％(v/v)辛基β-d-吡喃葡萄糖苷ph 7.5组成的缓冲液和去离子水。结合的分析物用50μl的0.2％(v/v)甲酸/1x invitrosol
tm
(thermofisher scientific)/10％(v/v)乙腈进行洗脱。使用thermo scientific qexactive质谱仪，经由高分辨率准确质量lc-ms实现蛋白质定量。
[0107]
取决于所采用的收集方法，发现健康人志愿者中的禁食胃泌酸调节素水平范围为7-11ng/l，并且在最新的收集时间点，在进食后的10分钟内上升至范围为23-33ng/l的水平。这些结果与使用下文讨论的ia-lc-ms测定以及通过lee等人(lee ay等人，clin.chem.2015；62：227-235)的lc-ms测定获得的结果一致。
[0108]
实施例4
[0109]
夹心测定结果与免疫测定-lc-ms测定结果的相关性
[0110]
胃泌酸调节素分析参考标准品目前无法用于衡量免疫测定的准确度。然而，免疫测定-lc-ms具有鉴定给定样品中存在的目的分析物的分子形式的明显优点(bouillon r等人，clin.chem.2016；62：6-8)。
[0111]
用夹心免疫测定获得的胃泌酸调节素水平的相关性由使用cox等人(cox jm等人，bioanalysis 2016；8：1579-95)的免疫测定-lc-ms方法对上述夹心测定中采用的同一组血浆样品获得的那些进行检查。在夹心测定和免疫测定-lc-ms方法之间的相关性很高(spearman系数0.9236；p＜0.0001)，并且确认了本发明的夹心免疫测定的选择性。
[0112]
此外，相对于免疫测定-lc-ms测定的使用，本发明的夹心免疫测定允许可扩展性和高通量应用、减少样品体积和测定时间，并且避免了对设备和专业知识的大量投入的需要。使用本文公开的灵敏且选择性的夹心免疫测定来测量人样品中的人胃泌酸调节素也可以促进对胃泌酸调节素生物学的改进的理解。
[0113]
序列
[0114]
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[0115]
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[0116]
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[0117]
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[0118]
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[0120]
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[0186]

技术特征：
1.一种结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域的多肽分子，其中所述多肽分子包含seq id no：1-6中所示的互补决定区(cdr)。2.权利要求1的多肽分子，其中所述多肽分子是抗体。3.权利要求1的多肽分子，其中所述多肽分子是scfv或fab。4.权利要求1或权利要求2的多肽分子，其中所述多肽分子是含有包含seq id no：7的重链可变区(vh)以及包含seq id no：8的轻链可变区(vl)的抗体。5.权利要求1、2或4中任一项的多肽分子，其中所述多肽分子是含有包含seq id no：9的重链以及包含seq id no：10的轻链的抗体。6.权利要求1、2、4或5中任一项的多肽分子，其中所述多肽分子是包含由seq id no：9组成的重链以及由seq id no：10组成的轻链的抗体。7.一种核酸分子，其包含编码seq id no：9的第一核酸序列和编码seq id no：10的第二核酸序列之一或两者。8.权利要求7的核酸分子，其中所述第一核酸序列包含seq id no：11，并且其中所述第二核酸序列包含seq id no：12。9.一种载体，其包含编码seq id no：9的第一核酸序列和编码seq id no：10的第二核酸序列之一或两者。10.一种组合物，其包含权利要求9的载体。11.一种细胞，其包含权利要求9的载体。12.权利要求11的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。13.一种生产多肽分子的方法，其包括在使得多肽分子表达的条件下培养细胞，所述细胞包含编码seq id no：9的第一核酸序列和编码seq id no：10的第二核酸序列之一或两者，并且从培养基中回收所表达的多肽分子。14.一种多肽分子，其通过权利要求13的方法产生。15.一种组合物，其包含权利要求1-6和14中任一项的多肽分子。16.一种结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自中的c末端区域的多肽分子，其中所述多肽分子包含seq id no：13-18中所示的互补决定区(cdr)。17.权利要求16的多肽分子，其中所述多肽分子是抗体。18.权利要求16的多肽分子，其中所述多肽分子是scfv或fab。19.权利要求16或权利要求17的多肽分子，其中所述多肽分子是含有包含seq id no：19的vh以及包含seq id no：20的vl的抗体。20.权利要求16、17或19中任一项的多肽分子，其中所述多肽分子是含有包含seq id no：21的重链以及包含seq id no：22的轻链的抗体。21.权利要求16、17、19或20中任一项的多肽分子，其中所述多肽分子是包含由seq id no：21组成的重链以及由seq id no：22组成的轻链的抗体。22.一种核酸分子，其包含编码seq id no：21的第一核酸序列和编码seq id no：22的第二核酸序列之一或两者。23.权利要求22的核酸分子，其中所述第一核酸序列包含seq id no：23，并且其中所述第二核酸序列包含seq id no：24。
24.一种载体，其包含编码seq id no：23的第一核酸序列和编码seq id no：24的第二核酸序列之一或两者。25.一种组合物，其包含权利要求24的载体。26.一种细胞，其包含权利要求24的载体。27.权利要求26的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。28.一种生产多肽分子的方法，其包括在使得多肽分子表达的条件下培养细胞，所述细胞包含编码seq id no：21的第一核酸序列和编码seq id no：22的第二核酸序列之一或两者，并且从培养基中回收所表达的多肽分子。29.一种多肽分子，其通过权利要求28的方法产生。30.一种组合物，其包含权利要求16-21或29中任一项的多肽分子。31.一种组合物，其包含(a)结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自中的n末端区域的第一多肽分子，其中所述第一多肽分子包含seq id no：1-6中所示的cdr，以及(b)结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自中的c末端区域的第二多肽分子，其中所述第二多肽分子包含seq id no：13-18中所示的cdr。32.一种确定液体样品中的人胃泌酸调节素(seq id no：25)浓度的方法，其包括：(a)使包含人胃泌酸调节素的液体样品与第一多肽分子接触，所述第一多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自中的c末端区域，其中所述第一多肽分子包含seq id no：13-18的cdr，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物；(b)使第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物与第二多肽分子接触，所述第二多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域，其中所述第二多肽分子包含seq id no：1-6的cdr，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物；和(c)通过针对已知量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的标准曲线比较，来定量第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物中的胃泌酸调节素的量。33.权利要求32的方法，其中所述液体样品是血清或血浆。34.权利要求31-33中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是抗体，并且所述第二多肽分子是抗体。35.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是含有包含seq id no：19的vh以及包含seq id no：20的vl的抗体，并且所述第二多肽分子是含有包含seq id no：7的vh以及包含seq id no：8的vl的抗体。36.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是含有包含seq id no：21的重链且含有包含seq id no：22的轻链的抗体，并且所述第二多肽分子是含有包含seq id no：9的重链以及包含seq id no：10的轻链的抗体。37.权利要求30-34中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是包含由seq id no：21组成的重链且包含由seq id no：22组成的轻链的抗体，并且所述第二多肽分子是包含由seq id no：9组成的重链以及由seq id no：10组成的轻链的抗体。38.第一多肽分子和第二多肽分子在确定液体样品中的胃泌酸调节素的量中的用途，
所述第一多肽分子结合人胃泌酸调节素和人肠高血糖素各自中的c末端区域，所述第二多肽分子结合人胃泌酸调节素和人胰高血糖素各自的n末端区域。39.一种预测受试者是否处于发展2型糖尿病的风险中的方法，其包括通过以下确定来自受试者的血清样品或血浆样品中的胃泌酸调节素的量：(a)使包含人胃泌酸调节素的血清样品或血浆样品与第一多肽分子接触，所述第一多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人肠高血糖素(seq id no：28)各自的c末端区域，其中所述第一多肽分子包含seq id no：13-18，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物；(b)使第一多肽分子-人胃泌酸调节素复合物与第二多肽分子接触，所述第二多肽分子结合人胃泌酸调节素(seq id no：25)和人胰高血糖素(seq id no：30)各自的n末端区域，其中所述第二多肽分子包含seq id no：1-6，从而形成第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物；和(c)通过针对已知量的人胃泌酸调节素(seq id no：25)的标准曲线比较，来定量第一多肽分子-人胃泌酸调节素-第二多肽分子复合物中的胃泌酸调节素的量。40.权利要求37的方法，其中所述受试者已诊断有急性胰腺炎。41.权利要求39或权利要求40的方法，其中所述第一多肽分子是抗体，并且所述第二多肽分子是抗体。42.权利要求39-41中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是含有包含seq id no：19的重链可变区以及包含seq id no：20的轻链可变区的抗体，并且所述第二多肽分子是含有包含seq id no：7的重链可变区以及包含seq id no：8的轻链可变区的抗体。43.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是含有包含seq id no：21的重链且含有包含seq id no：22的轻链的抗体，并且所述第二多肽分子是含有包含seq id no：9的重链以及包含seq id no：10的轻链的抗体。44.权利要求39-43中任一项的方法，其中所述第一多肽分子是包含由seq id no：21组成的重链且包含由seq id no：22组成的轻链的抗体，并且所述第二多肽分子是包含由seq id no：9组成的重链以及由seq id no：10组成的轻链的抗体。

技术总结
本文提供了新型N末端和C末端胃泌酸调节素多肽结合分子及其用途，包括用于定量胃泌酸调节素的方法。调节素的方法。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：伊莱利利公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/9/23