一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法。


背景技术：

2.大果沙枣(elaeagnus moorcroftii wall.ex schlecht)，别名：新疆大沙枣，大沙枣；胡颓子科胡颓子属，是集多种功能为一体的经济型生态树种，具有抗旱、耐风沙、抗盐碱等特性，具有比沙枣(elaeagnus angustifolia linn.)更强的抗盐碱能力、更高的产量、果实比沙枣大、口感更佳等优良特性。同时，大果沙枣的果实、花和叶均具有较高的经济开发潜力，符合名特优树种基本特征，可作为农村产业结构调整主栽树种进行推广发展。
3.大果沙枣采用种子繁殖，易发生劣变，果实退化，成为小果沙枣，品质降低。目前，大果沙枣主要采用扦插和嫁接两种无性繁殖方法，但这两种方法需要耗费大量财力、物力和人力，而且受天气、土壤等自然条件影响较大，对穗条的处理及保存要求也较高，穗条质量直接影响大果沙枣的繁育成活率。因此，亟需采取新的无性繁殖的方法来解决这一问题。
4.组织培养是近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术，不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征。组织培养能够通过人工控制培养条件，不会被天气、季节等难控因素限制，能够有效减少人力、财力的支出，极利于高度集约化和工厂化育苗生产，是未来农业工厂化育苗的发展方向。
5.大果沙枣和沙枣属于同一科属不同种植物，大果沙枣果实形态变异较大，繁育中果实更易退化，品质降低。国外对于沙枣组培的研究仅见叶片获再生芽、未成熟子叶形成愈伤获高效再生植株，未见对大果沙枣组培的研究；国内对于沙枣组培的研究主要是选用种子培养无菌苗、叶片和芽作为外植体进行培养，因采用种子繁殖，大果沙枣会变异为沙枣，该方法不适用于大果沙枣繁育，而国内对于大果沙枣组培方法的研究仅见组培实验性报导，未提大规模工厂化繁育流程及相应技术指标。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明通过利用无性繁殖领域的组织培养方法，解决了大果沙枣传统无性繁殖方法中受地理环境和季节等外界条件限制的问题，解决了利用现有沙枣组培方法繁殖大果沙枣易褐化、污染，生根率低的问题，解决了现有大果沙枣组培技术仅在试验阶段，未进行工厂化试验的问题。本发明的方法具有繁殖速度快、增殖倍数高、管理方便、生产成本低、成株率高、培养周期短、可周年生产和实现规模化、工厂化生产等特性，可以使植物在室内模拟光照条件下在较短时间内达到快速、高效繁殖的目的，创造出较高的经济效益。本发明的方法可以推动大果沙枣规模化生产和产业化发展进程，满足市场对大果沙枣的需求，而且随着规模的不断扩大，还可满足国内及周边国家的需求。
7.本发明的方法通过选用当年生未木质化的嫩梢为外植体，接种于诱导培养基，通
过丛生芽的诱导
‑‑
植株的培养
‑‑
茎段增殖(微扦插)途径进行增殖培养，待培养瓶内生长的根、茎、叶俱全的完整植株时进行瓶内炼苗、温室炼苗及苗圃移栽。本发明确定了最佳的诱导、继代增殖和生根培养基及激素组合，并且本发明提供的方法更适用于工厂化生产大果沙枣苗木，具有繁殖速度快、繁殖系数大、管理方便、生产成本低、成苗率高、培养周期短、可周年生产和实现规模化、工厂化生产的效果，具有广泛的实用性。本发明的方法克服了已有的沙枣组培方法效率不高，外植体材料获取和保存不易，操作繁杂，易褐化、污染，且仅适用于试验研究的技术现状，本发明提供的方法更适用于大果沙枣苗木的工厂化生产。
8.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
9.本发明的技术方案之一：一种大果沙枣苗木组织培养的方法，包括以下步骤：
10.(1)外植体的建立：将大果沙枣外植体灭菌后接种在诱导培养基中培养，得到萌发不定芽的组织；
11.更进一步地，所述培养的条件为：温度26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间12～14h，培养时间45～60d；
12.诱导培养：
13.(2)将萌发不定芽的组织转入植株分化培养基中继续培养，得到半木质化的植株(高度为2～2.5cm)；
14.更进一步地，所述培养的条件为：温度26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间12～14h，培养时间30d；
15.(3)将半木质化的植株接入生根促长培养基中培养，得到大果沙枣组培苗(植株高度为4～5cm，植株节间4～5节)；大果沙枣组培苗生根后，根长1.0～1.5cm时，可进行炼苗移栽。
16.更进一步地，所述培养的条件为：温度26
±
2℃，光照时间14h，培养时间20d；
17.(4)将大果沙枣组培苗炼苗后移栽，得到大果沙枣苗木。
18.更进一步地，所述炼苗具体包括：将大果沙枣组培苗(瓶装)放置在温室自然散射光下，温度控制在25℃
±
3℃，封口炼苗3～5d，然后逐渐打开瓶盖继续炼苗5～10d。
19.更进一步地，所述移栽具体包括温室移栽和苗圃移栽；
20.更进一步地，所述温室移栽具体包括：将炼苗后的大果沙枣组培苗连同培养基一同取出，洗净根部培养基，分级后移栽至装有混合基质(细园土：草炭土：珍珠岩按5：3：2的体积比配制)的营养钵中，并置于温室大棚内，用25％的多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液喷撒幼苗，透光率40％的遮阳网遮光。适时适量喷水，使温室大棚内的相对湿度保持在80％以上，温度控制在24～26℃。每天早晚掀开遮阳网透光。当第一片新叶完全张开后，可撤去遮阳网，并逐渐打开温室大棚透风，降低湿度。
21.更进一步地，所述苗圃移栽具体包括：将经过温室移栽获得的幼苗连同基质取出在苗床上移栽，株行距15cm
×
20cm，及时浇足定根水，用透光率60％遮阳网遮盖5～7d。适时对苗床进行浇水，除草。苗木移栽培养至休眠期，苗高≥80cm，地径≥0.7cm，生长健壮，根系发达，苗木基部及根系木质化，获得所述大果沙枣苗木(可出圃)。
22.本发明的技术方案之二：一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法，包括以下步骤：
23.(1)外植体的建立：将大果沙枣外植体灭菌后接种在诱导培养基中培养，得到萌发
不定芽的组织；
24.更进一步地，所述培养的条件为：温度26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间12～14h，培养时间45～60d；
25.诱导培养：
26.(2)将萌发不定芽的组织转入植株分化培养基中继续培养，得到半木质化的植株(高度为2～2.5cm)；
27.更进一步地，所述培养的条件为：温度26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间12～14h，培养时间30d；
28.(3)将半木质化的植株接入生根促长培养基中培养，得到组培苗(植株高度为4～5cm，植株节间4～5节)；
29.更进一步地，所述培养的条件为：温度26
±
2℃，光照时间14h，培养时间20d；
30.(4)继代增殖培养(茎段增殖-微扦插)：将组培苗剪成带有1～2个腋芽的茎段(长度1～1.5cm的茎段)，然后转接到增殖培养基中培养，得到芽苗(生长健壮、叶色正常，高度为4～5cm)；
31.更进一步地，所述培养的条件为：先在温度为22～24℃，光照强度为3200lx，光照时间为16h的条件下培养15～20d，然后在温度为27℃，光照时间为14h的条件下培养25d。
32.采用微扦插途径进行增殖培养，可以减少工厂化生产过程中品种的变异，保证品种的种性和每一代稳定的增殖率。
33.(5)生根培养：将芽苗剪成带有1～2个腋芽的茎段，然后接种在生根培养基中培养，得到大果沙枣组培植株(根、茎、叶俱全的完整植株，基部有3～5条1～1.5cm长的白色不定根，株高3.0～4.0cm，3～5片叶的组培瓶苗)；
34.更进一步地，所述培养的条件为：温度22～24℃，光照强度3600lx，光照时间＞16h，培养时间20d。
35.(6)将大果沙枣组培植株炼苗后移栽，得到大果沙枣苗木。
36.更进一步地，所述炼苗和移栽的具体方法同上。
37.进一步地，步骤(1)中，所述诱导培养基，成分包括：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l。
38.诱导培养基中的细胞分裂素(6-ba)使用浓度较高，大部分萌发的不定芽植株形态异常，肉质茎，不易生根。必须将不定芽培养成完整的植株，才能诱导生根。
39.进一步地，步骤(1)中，所述大果沙枣外植体为大果沙枣当年生未木质化的嫩梢(枝条)茎段。
40.当年生未木质化的嫩梢(枝条)茎段作为外植体，可减少培养过程中的褐化和污染，不定芽的诱导率较高。
41.进一步地，步骤(1)中，所述灭菌的方法，具体包括：将大果沙枣嫩梢表面的白色鳞片刷干净，再用洗洁精将嫩梢表面清洗干净，将嫩梢剪成1～1.5cm茎段，得到大果沙枣外植体；将大果沙枣外植体放入浓度为70vol.％的酒精溶液中浸泡30s，然后放入浓度为0.1wt.％的氯化汞溶液中浸泡4min，最后再用无菌水冲洗3～5次，置于无菌滤纸上晾干。
42.进一步地，步骤(2)中，所述植株分化培养基，成分包括：ms+6-ba0.2mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l。
43.进一步地，步骤(3)中，所述生根促长培养基，成分包括：b5+iba0.8mg/l+蔗糖30g/l。
44.进一步地，步骤(4)中，所述增殖培养基包括以下任意一种：
45.第1种，成分包括：b5+iba0.8mg/l+蔗糖20g/l；
46.第2种，成分包括：ms+iba0.8mg/l+蔗糖20g/l。
47.增殖培养基的基础培养基采用ms和b5轮换使用，保证一节一芽，茎段长度为1～1.2cm，同时可保证每一代的增殖率。ms高氮培养基植株易徒长，影响生根率。b5高钾培养基植株易老化矮化，影响增殖率。
48.进一步地，步骤(5)中，所述生根培养基，成分包括：1/2b5+iba0.5mg/l+6-ba0.1mg/l+蔗糖15g/l。
49.进一步地，步骤(5)中，所述培养的温度为22～24℃(高于此温度界限，无法诱出根系)。
50.本发明公开了以下技术效果：
51.(1)本发明通过利用无性繁殖领域的组织培养方法，解决了大果沙枣传统无性繁殖方法中受地理环境和季节等外界条件限制的问题，解决了利用现有沙枣组培方法繁殖大果沙枣易褐化、污染，生根率低的问题，解决了现有大果沙枣组培技术仅在试验阶段，未进行工厂化试验的问题。
52.(2)现有技术主要为沙枣组织培养方法，选用外植体为种子培养无菌苗、叶片、顶芽和腋芽，不易大量获取及保存，易褐化，诱导率低；本发明选用当年生未木质化嫩梢为外植体，更易获取及保存，更适用于大果沙枣。
53.(3)现有技术植物组织培养工厂化生产，木本植物主要选用愈伤组织途径，增殖率高，但变异率也较高，不能保证品种的种性。愈伤组织分化出的不定芽，成苗率较低，生根率低，增殖率不稳定，不宜用于工厂化生产。本发明采用植株培养(微扦插)，无性繁殖，保证种苗的种性，增殖率稳定，可用于多代繁殖的工厂化生产。
54.(4)本发明确定了最佳的诱导、继代增殖和生根培养基及激素组合，诱导分化快，生长快，组织培养出的生根苗移栽成活率高，适用于工厂化生产大果沙枣苗木。
55.(5)本发明突破了在大果沙枣在无性繁殖过程中仅采用扦插和嫁接繁殖的方法，解决大果沙枣传统繁育方法中受地理环境和季节等外界条件限制的问题，具有繁殖速度快、繁殖系数大、管理方便、生产成本低、成苗率高、培养周期短、可周年生产和实现规模化、工厂化生产的效果，具有广泛的实用性。
56.(6)本发明通过研究确定采用大果沙枣当年生未木质化的嫩梢(枝条)茎段为外植体，相比选取叶片、芽作为外植体，更易大量获取及保存，相比选取一年生枝条进行水培催芽，其萌发力更强，存活率更高。依托组织培养的方法进行工厂化生产，建立了大果沙枣组培快繁的技术平台，确定了最佳的诱导、继代增殖和生根培养基及激素组合，相比已有的沙枣组培方法，其诱导分化较快，增殖倍数较高高，生长快，成株率、生根率、根数及根长更高，更适合用于大果沙枣工厂化生产；提出了工厂化繁育技术规程及技术指标，突破了大果沙枣在无性繁殖过程中仅采用扦插和嫁接繁殖的方法，大大提高了该树种的繁殖速度和效果。
附图说明
57.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
58.图1为本发明实施例1获得的组培植株的实物图，其中，a为组培苗的生长情况，b为组培苗的生根情况；
59.图2为本发明实施例2丛生芽诱导及增殖培养获得的组织培养得到的组培苗的实物图，其中，a为组培苗的生长情况，b为组培苗的生根情况；
60.图3为本发明实施例3获得的组培苗的实物图，其中，a为组培苗的生长情况，b为组培苗的生根情况。
具体实施方式
61.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
62.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
63.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
64.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
65.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
66.实施例1
67.一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法：
68.(1)外植体的选择
69.春天在生长健壮、无病虫害树体上，选择当年生未木质化的嫩梢(枝条)为外植体来源。
70.(2)外植体灭菌
71.将步骤(1)上叶片剪去，用软刷将嫩梢表面的白色鳞片刷干净，再用洗洁精将嫩梢表面清洗干净，将嫩梢剪成1.0～1.5cm茎段(外植体)。
72.在超净工作台上将外植体放入70vol.％的酒精溶液中浸泡30s，然后放入
0.1wt.％的氯化汞溶液浸泡4min进行消毒，再用无菌水冲洗3～5次，置于无菌滤纸上晾干，得到灭菌的外植体。
73.(3)诱导培养
74.培养途径：丛生芽的诱导和植株分化培养。
75.丛生芽诱导培养：将步骤(2)中灭菌的外植体接种在诱导培养基(诱导培养基由ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l组成)上进行初代培养(培养室温度设置26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间14h，培养时间为50d左右)，每瓶接种1～2个外植体，并进行标记，培养结束后得到萌发不定芽的组织。
76.植株分化培养：将萌发不定芽的组织转入到分化培养基(分化培养基由ms+6-ba0.2mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l组成)中培养(培养室温度设置26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间14h，培养时间为30d左右)，得到半木质化的植株(高度为2～2.5cm)。
77.生根促长培养：将半木质化的植株接入生根促长培养基(生根促长培养基由b5+iba0.8mg/l+蔗糖30g/l组成)中培养(温度26
±
2℃，光照强度3200lx，光照时间14h，培养时间20d萌发根系)，得到组培苗(株高4～5cm，植株节间4～5节)。
78.(4)继代增殖培养
79.培养途径：茎段增殖-微扦插。
80.将组培苗剪成带有1～2个腋芽，长度1～1.5cm的茎段，然后将茎段转接到增殖培养基(增殖培养基由b5+iba0.8mg/l+蔗糖20g/l组成)中培养(先在温度为22～24℃，光照强度为3200lx，光照时间为16h的条件下培养20d诱导生根，然后将生根苗转入温度为27℃，光照强度3200lx，光照时间为14h的条件下培养25d左右)，得到芽苗(生长健壮、叶色正常，高度为4～5cm)。
81.(5)生根培养
82.将芽苗剪成带有1～2个腋芽的茎段，然后接种在生根培养基(生根培养基1/2b5+iba0.5mg/l+6-ba0.1mg/l+蔗糖15g/l)中培养(温度22～24℃，光照强度3600lx，光照时间16h(长日照能够促进茎段生根)，培养时间20d左右，芽根同步萌动生长)，得到大果沙枣组培植株(根、茎、叶俱全的完整植株，基部有3～5条1～1.5cm长的白色不定根，株高3.0～4.0cm，3～5片叶的组培瓶苗)，组培植株的实物图见图1。
83.(6)炼苗
84.将步骤(5)中的大果沙枣组培植株的组培瓶放置在温室自然散射光下，温度控制在25℃
±
3℃，封口炼苗5d，然后逐渐打开瓶盖继续炼苗5d。
85.(7)温室移栽
86.将炼苗后的大果沙枣组培植株连同培养基一同取出，洗净根部培养基，分级后移栽至装有的混合基质(细园土：草炭土：珍珠岩按5：3：2的体积比配制)的营养钵中，并置于温室大棚内，用25％的多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液喷撒幼苗，透光率40％的遮阳网遮光。适时适量喷水，使温室大棚内的相对湿度保持在80％以上，温度控制在24～26℃。每天早晚掀开遮阳网透光。当第一片新叶完全张开后，可撤去遮阳网，并逐渐打开温室大棚透风，降低湿度，当第一片新叶完全张开后，继续培养一个月后进行苗圃移栽。
87.(8)苗圃移栽及苗木出圃
88.将经过温室移栽获得的幼苗连同基质取出在苗床上移栽，株行距15cm
×
20cm，及
时浇足定根水，用透光率60％遮阳网遮盖7d。适时对苗床进行浇水，除草。苗木移栽培养至休眠期，苗高≥80cm，地径≥0.7cm，生长健壮，根系发达，苗木基部及根系木质化，得到大果沙枣苗木(即可出圃)。
89.实施例2
90.现有大果沙枣组织培养及快速繁殖的方法(该方法与李康等大沙枣组织培养及快速繁殖技术研究相同)。
91.(1)外植体的选择
92.选择大果沙枣树体基部1年生萌芽前健壮枝条，在室内水培催芽，温度为20～25℃，30d后水培芽长1～4cm，剪取新发的芽和茎尖做外植体。
93.(2)外植体灭菌
94.用流水冲洗1h，70％酒精间歇处理2～3次后，放在净化工作台，用2～3滴吐温0.1％hgcl2灭菌6～8min。
95.(3)诱导及增殖培养
96.大果沙枣试管快繁途径有两种：丛生芽增殖和胚状体分化。
97.方法1：丛生芽诱导及增殖培养
98.丛生芽的诱导：将步骤(2)中灭菌外植体接种在丛生芽诱导培养基(丛生芽诱导培养基为ms+6-ba0.5mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖25g/l)上进行诱导培养(培养室温度设置24～28℃，湿度60～80％，光照强度3000lx，光照时间14h，培养时间为35d左右)，每瓶接种2个外植体，并进行标记，培养结束后得到丛生芽组织。
99.丛生芽继代增殖：将诱导出的丛生芽组织接种在丛生芽增殖培养基ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖25g/l上进行增殖培养。(培养温度24～28℃，湿度60～80％，光照强度3000lx，光照时间14h/d，培养时间30d左右)，如此反复，通过丛生芽倍增的方式，实现芽苗的大量增殖(继代增殖次数控制在15代以内)。
100.方法2：胚状体分化及再生培养
101.胚状体诱导：将步骤(2)中灭菌外植体接种到愈伤组织诱导培养基(愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25g/l)进行诱导培养，(培养室温度设置24～28℃，湿度60～80％，光照强度3000lx，光照时间14h，培养时间为35d左右)，每瓶接种2个外植体，并进行标记，诱导出黄绿色的愈伤组织。
102.胚状体植株再生：将步骤(3)获得的黄绿色的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基(愈伤组织分化培养基由ms+6-ba1.0mg/l+naa0.08mg/l+蔗糖25g/l组成)上培养(培养温度24～28℃，湿度60～80％，光照强度3000lx，光照时间14h/d，培养时间25d左右)，每块愈伤组织上可产生7～8个幼芽，其中长1～1.5cm以上的幼芽可供诱导生根。
103.(4)生根培养
104.将步骤(3)获得方法1和方法2的组培芽苗分别用iba50mg/l浸泡处理1～2h，然后分别接入无激素生根培养基1/2ms+蔗糖15g/l上进行诱导生根。
105.采用方法1组织培养获得的组培苗的实物图见图2。
106.实施例3
107.现有沙枣(小沙枣)组织培养的方法(该方法与刘力强等一种沙枣组织培养方法相同)
108.(1)外植体选择：选择当年生枝条进行水培，选取嫩芽叶柄为外植体。
109.(2)消毒方法：将外植体清水滴浇2h，浸入75％酒精中45s，无菌水冲洗3次，放入浓度为6wt.％naclo溶液中浸泡6min，再用无菌水清洗干净。
110.(3)无菌苗培养：将步骤(2)嫩芽的茎段剪成1.0cm，接种于ms+蔗糖30g/l培养基中进行初始培养，培养温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度为2000lx，培养10d左右。
111.(4)将步骤(3)培养出的无菌苗叶柄剪成0.5cm，转移至ms+6-ba0.5mg/l+naa1.5 mg/l+蔗糖30g/l培养基中，培养温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度为2000lx，培养60d左右，形成愈伤组织。
112.(5)将步骤(4)培养的愈伤组织切成0.2cm，转移至ms+6-ba0.5mg/l+naa1.0 mg/l+蔗糖30g/l培养基中，培养温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度为2000lx，培养30d，长出幼芽。
113.(6)将步骤(5)幼芽移至培养基为1/2ms+naa1.0mg/l+多效唑10mg/l+蔗糖30g/l中培养20d，得到大果沙枣组培苗的实物图见图3。
114.效果例1
115.(一)不同外植体组织培养效果
116.将实施例1～3中三种不同大果沙枣外植体灭菌消毒后，接种在不加激素ms培养基上，进行无菌培养，每种外植体选取50个进行褐化数、污染数及存活率调查。结果见表1。
117.存活率＝存活数量/接种数量
×
100％。
118.表1大果沙枣不同外植体培养效果调查表
119.实施例外植体数量/个褐化数量/个污染数量/个存活率/％实施例1当年生枝条茎段505678实施例21年生枝条水培芽5020746实施例3当年生嫩芽叶柄50181151
120.由表1可以看出，在相同灭菌、相同培养基条件下实施例1选取的外植体褐化数量和污染数量均为最低，存活率最高；实施例2选取的外植体褐化数量最多，存活率最低；实施例3选取的外植体污染数量最多，存活率较低。
121.从试验中发现，实施例2、3中选取的外植体芽为植物较嫩组织，不易大量获取及保存，容易发生褐化现象，对药物和处理时间比较敏感，灭菌不当或会加重褐化现象，取材季节和时间也会对污染率有较大影响；而实施例1中选取当年生未木质化嫩枝作为外植体，易获取及储存，不易褐化及污染，且接种后萌发力强。
122.(二)不同消毒方法大果沙枣组织培养效果
123.实施例1、实施例2和实施例3分别运用不同消毒方法对外植体进行消毒，接种于培养基后10d调查污染率，45d调查萌动率。萌动率＝萌芽数/总接种数。
124.结果表明实施例1的污染率为20％，萌动率为65％；实施例2的污染率为34％，萌动率为45％；实施例3的污染率75％，萌动率为20％。
125.(三)不同培养基及培养途径对大果沙枣诱导及生根的影响
126.将实施例1、2、3中不同大果沙枣外植体分别接种于不同基质及激素配方下，通过不同的培养途径进行培养，对诱导结果、芽生长及生根情况进行调查。结果见表2。
127.表2不同培养基下大果沙枣诱导及生根情况调查表
[0128][0129]
由表2可以看出，实施例1诱导不定芽数量适中，苗较粗壮，成株率、生根率、生根数及根长均最高，利于驯化移栽。实施例2增殖倍数最低，诱导不定芽数量低，成株率最低，苗细弱，萌发力差，生根率、生根数及根长均较低。实施例3增殖倍数最高，诱导萌发最早，大量萌发，生长速度快，但较细弱，成株率较低，生根率、生根数及根长均为最低，且根易断。
[0130]
综上，本发明的组织培养方法中所选取的外植体、消毒方法及确定的诱导、继代增殖和生根培养基及激素组合，茎段增殖(微扦插)方法，诱导分化较快，生长快，生根率、根数及根长最高，组织培养出的生根苗移栽驯化成活率高，大量扩繁生产中更为经济适用，更适用于工厂化生产大果沙枣苗木。
[0131]
实施例4
[0132]
将实施例1中步骤(3)和步骤(5)所获得的组培苗经过炼苗(炼苗方法同实施例1)后分别移栽至基质配方为蛭石+珍珠岩(体积比为2:1)或细园土+草炭土+珍珠岩(体积比为5：3：2)的营养钵中，置于温室大棚内，用25％的多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液喷撒幼苗，透光率40％的遮阳网遮光。适时适量喷水，使温室大棚内的相对湿度保持在80％以上，温度控制在24～26℃。每天早晚掀开遮阳网透光。当第一片新叶完全张开后，可撤去遮阳网，并逐渐打开温室大棚透风，降低湿度。移栽30后，调查成活率。
[0133]
表3不同基质移栽成活率调查表
[0134]
序号组培苗蛭石+珍珠岩细园土+草炭土+珍珠岩1步骤(3)30.5％45％2步骤(5)57％87.5％
[0135]
对比例1
[0136]
同实施例1，区别仅在于，诱导培养基由ms+蔗糖30g/l组成。
[0137]
对比例2
[0138]
同实施例1，区别仅在于，分化培养基由ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l组成。
[0139]
对比例3
[0140]
同实施例1，区别仅在于，生根促长培养基由ms+iba0.8mg/l+蔗糖30g/l组成。
[0141]
对比例4
[0142]
同实施例1，区别仅在于，增殖培养基由ms+iba0.8mg/l+蔗糖20g/l组成。
[0143]
对比例5
[0144]
同实施例1，区别仅在于，生根培养基为1/2ms+iba0.50mg/l+多效唑10mg/l+蔗糖15g/l.
[0145]
效果例2
[0146]
统计并计算每步培养的效果数据，结果见表3。
[0147]
萌发不定芽的组织的比例(％)＝萌发不定芽的组织数量/外植体数量
×
100％；
[0148]
半木质化的植株的比例(％)＝半木质化的植株数量/萌发不定芽的组织数量
×
100％；
[0149]
组培苗的比例(％)＝组培苗的数量/半木质化的植株数量
×
100％；
[0150]
芽苗的比例(％)＝芽苗的数量/茎段数量
×
100％；
[0151]
组培植株的比例(％)＝组培植株的数量/芽苗的数量
×
100％；
[0152]
温室移栽成活率(％)＝温室移栽成活数量/温室移栽数量
×
100％；
[0153]
苗圃移栽成活率(％)＝苗圃移栽成活数量/苗圃移栽数量
×
100％。
[0154]
表4大果沙枣不同外植体培养效果调查表
[0155][0156][0157]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种大果沙枣苗木组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大果沙枣外植体灭菌后接种在诱导培养基中培养，得到萌发不定芽的组织；(2)将萌发不定芽的组织转入植株分化培养基中继续培养，得到半木质化的植株；(3)将半木质化的植株接入生根促长培养基中培养，得到大果沙枣组培苗。2.一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大果沙枣外植体灭菌后接种在诱导培养基中培养，得到萌发不定芽的组织；(2)将萌发不定芽的组织转入植株分化培养基中继续培养，得到半木质化的植株；(3)将半木质化的植株接入生根促长培养基中培养，得到组培苗；(4)将组培苗剪成带有腋芽的茎段，然后转接到增殖培养基中培养，得到芽苗；(5)将芽苗剪成带有腋芽的茎段，然后接种在生根培养基中培养，得到大果沙枣组培植株。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述诱导培养基，成分包括：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大果沙枣外植体为大果沙枣当年生未木质化的嫩梢。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述灭菌的方法，具体包括：将大果沙枣外植体放入浓度为70vol.％的酒精溶液中浸泡30s，然后放入浓度为0.1wt.％的氯化汞溶液中浸泡4min。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述植株分化培养基，成分包括：ms+6-ba0.2mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述生根促长培养基，成分包括：b5+iba0.8mg/l+蔗糖30g/l。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述增殖培养基包括以下任意一种：第1种，成分包括：b5+iba0.8mg/l+蔗糖20g/l；第2种，成分包括：ms+iba0.8mg/l+蔗糖20g/l。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述生根培养基，成分包括：1/2b5+iba0.5mg/l+6-ba0.1mg/l+蔗糖15g/l。10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述培养的温度为22～24℃。

技术总结
本发明公开了一种适用于工厂化生产大果沙枣苗木组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。本发明的方法通过选用当年生未木质化的嫩梢为外植体，接种于诱导培养基，通过丛生芽的诱导


技术研发人员：刘巧玲 单奇 盛玮 王蓉 周斌 罗青红 蒋腾 刘丽燕
受保护的技术使用者：新疆农业职业技术学院
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/9/23