一种基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及真菌毒素快速检测技术领域。更具体地，涉及一种基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.真菌毒素是真菌在生长繁殖过程中产生的次级代谢产物,广泛存在于粮食及其制品中，可以在粮食作物生长、收获、储存和加工中的各个环节中产生，对人体健康具有极大的危害。目前，真菌毒素的快速定量检测方法主要是基于免疫分析技术的酶联免疫吸附法和免疫层析试纸条法，一般用于快速检测和大批量样品的初筛，容易出现假阴性和假阳性结果，存在准确度和灵敏度不足的缺陷。粮油品种较多，基质复杂，快速检测结果容易受到杂质干扰，因此稳定性有待提升。由于抗体不耐受高浓度的有机试剂，样品中毒素经有机试剂的提取后，需要进行大幅度稀释，导致检测方法灵敏度进一步降低。因此提高快速检测方法的准确度和稳定性，对真菌毒素的检测分析十分重要。
3.化学发光免疫分析是将免疫分析技术与化学发光结合的分析方法，是继酶联免疫分析之后的又一新型免疫标记技术。该方法由于不需要外界光源，减少了背景干扰，能检测到低信号强度下信号的微小变化，灵敏度非常高，在环境检测、临床检测、食品和药物分析等领域得到广泛应用。化学发光免疫分析比其他免疫分析方法更敏感，与传统的酶联免疫吸附法相比，灵敏度高10倍，线性范围也更宽。酶促化学发光免疫分析是以酶标记抗原或抗体上，经过特异性反应后，形成抗体复合物。常用的标记物质的酶是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。常用的化学发光底物有吖啶酯类化合物、氨基苯二酰肼类化合物、咪唑类化合物、苯酚类化合物和二氧杂环丁烷类化合物等，具有灵敏度高、稳定性好、线性好等优点，但是该方法在实际应用于检测真菌毒素时，存在稳定性差、灵敏度低的问题。
4.因此，建立一种适用于粮油中真菌毒素快速定量化学发光免疫分析检测材料和方法是一个亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒。该试剂盒可以高效快速定量检测样本中的真菌毒素。
6.本发明的第二个目的在于提供一种利用上述试剂盒检测真菌毒素的方法，该方法灵敏度高、稳定性好。
7.为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒，该试剂盒包括：介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体，生物素标记的真菌毒素抗原、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，以及底物液。
9.进一步的，所述介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体是通过如下方法制备获得：
10.(1)介孔二氧化硅的合成：室温条件下，将0.2-1.0g十六烷基三甲基溴化铵溶解于蒸馏水中，搅拌状态下加入0.1-1.0g聚丙烯酸，然后搅拌状态下加入1.0-4.0g浓度为25％的氨水，继续搅拌，再加入1.0-5.0g正硅酸乙酯，搅拌后，密封，100-130℃静置反应24-48h，反应结束后离心、洗涤，然后50℃烘干，最后550℃焙烧6h，得到介孔二氧化硅；
11.(2)介孔二氧化硅的氨基化：将步骤(1)制备的介孔二氧化硅置于蒸馏水中，加热至沸腾，然后恒温保持0.5-4h，离心，烘干，得到活化后的介孔二氧化硅；将活化后的介孔二氧化硅分散于甲苯中，在搅拌条件下加入硅烷偶联剂，然后110℃冷凝回流10-20h，冷凝回流结束后离心，无水乙醇清洗，烘干，得到氨基化介孔二氧化硅；
12.(3)介孔二氧化硅负载纳米金的合成：将步骤(2)制备的氨基化介孔二氧化硅置于蒸馏水中，然后加入氯金酸溶液，搅拌后超声分散，再加入硼酸氢钠溶液，继续搅拌，最后离心、蒸馏水洗涤，得到介孔二氧化硅负载纳米金；
13.(4)介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体制备：取步骤(3)制备的介孔二氧化硅负载纳米金加入真菌毒素抗体，再加入mes缓冲溶液，室温条件下混匀2-4h后，离心去上清，然后用pbs溶液清洗，再用1％bsa溶液封闭2-4h，然后依次用0.1％pbst溶液和pbs溶液清洗，最后置于pbs溶液中即得。
14.本发明设计合成介孔二氧化硅，介孔二氧化硅的多孔结构具有良好的传质作用有利于减少检测时的孵育时间，克服常规酶联免疫吸附法中固/液接触面积小，反应速度慢且不彻底的缺点，从而增加检测准确性。本发明在介孔二氧化硅表面负载纳米金，所得纳米金更加稳定，再利用纳米金对抗体的物理吸附作用偶联抗体，避免常规化学偶联方法对抗体结构的破坏，维持抗体的高活性，从而增强检测的灵敏度。此外，介孔二氧化硅对抗体也有保护作用，使抗体表现出良好的稳定性，从而增加检测方法的稳定性。
15.本发明的检测原理是待测样本中的真菌毒素抗原和生物素标记的真菌毒素抗原同时竞争反应介孔二氧化硅负载纳米金上的抗体，然后与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素反应，通过生物素和链霉亲和素亲和反应，形成介孔二氧化硅负载纳米金抗体-生物素标记的真菌毒素抗原-碱性磷酸酶标记的链霉亲和素蛋白复合物，复合物上的碱性磷酸酶催化底物发光，产生检测信号，从而实现样本中真菌毒素的高效检测。
16.根据本发明的具体实施方式，本发明所述介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体是通过如下具体方法制备获得：
17.(1)介孔二氧化硅的合成：室温条件下，将0.2-1.0g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于25-50ml蒸馏水中，搅拌状态下把加入0.1-1.0g聚丙烯酸；在快速搅拌状态下加入1.0-4.0g浓度为25％的氨水；此时原来澄清的溶液变为乳白色悬浮液；搅拌后，加入1.0-5.0g正硅酸乙酯，剧烈搅拌后，转移到比色管中，密封，100-130℃静置反应24-48h；反应结束后离心、洗涤，然后烘干，最后550-600℃焙烧3-6h，得到介孔二氧化硅；
18.(2)介孔二氧化硅的氨基化：将0.1-2.0g步骤(1)制备的介孔二氧化硅置于100-500ml蒸馏水中，加热至沸腾，然后恒温保持0.5-4h，然后离心、烘干，得到活化后的介孔二氧化硅；将活化后的介孔二氧化硅置于10-50ml甲苯中，超声使之充分分散，在搅拌条件下加入0.1-2ml硅烷偶联剂，然后110℃冷凝回流10-20h；冷凝回流结束后离心、无水乙醇清洗，然后烘干，得到氨基化介孔二氧化硅；
19.(3)介孔二氧化硅负载纳米金的合成：将10
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20mg步骤(2)制备的氨基化介孔二氧
化硅置于1-2ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，然后加入10-200μl0.01mol/l的氯金酸溶液，搅拌后超声分散，然后加入新鲜制备的100-500μl0.01mol/l硼酸氢钠溶液，再继续搅拌2-3h，最后离心、蒸馏水洗涤，得到介孔二氧化硅负载纳米金；
20.(4)介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体制备：取步骤(3)制备的介孔二氧化硅负载纳米金加入0.01-1.0mg真菌毒素抗体，再加入mes缓冲溶液，室温下混匀2-4h后，离心去上清，然后用pbs溶液清洗，再用1％bsa溶液封闭2-4h，然后依次用0.1％pbst和pbs溶液清洗，最后置于pbs溶液中，4℃保存备用。
21.进一步的，该试剂盒还包括稀释液和清洗液。
22.示例性的，所述稀释液为包含0.01％-1.0％ tween-20或triton-100的pbs缓冲液、包含0.01％-0.5％tween-20或triton-100的tbs缓冲液、包含0.01％-0.5％tween-20或triton-100的去离子水中的一种；所述清洗液为包含0.01％-2.0％tween-20或triton-100的tbs缓冲液。
23.进一步的，在本发明实际盒中，所述底物液为含(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐的缓冲液；优选的，所述底物液中，(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐的浓度为1-2mmol/l。
24.所述生物素标记的真菌毒素抗原以及碱性磷酸酶标记的链霉亲和素均可以依据本领域中已知的方法来制备。
25.第二方面，本发明提供了一种利用上述试剂盒检测真菌毒素的方法，该方法包括：
26.(1)取介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体溶液，加入稀释液，混合均匀；
27.(2)加入待测样本，孵育5-10min，然后加入生物素标记的真菌毒素抗原工作液，孵育5-10min；
28.(3)离心去上清，然后用清洗液清洗，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液，孵育5-10min；
29.(4)用清洗液清洗，然后加入底物液，混匀，取样至酶标板，然后通过酶标仪读取发光值；
30.(5)样本的发光值与真菌毒素的含量呈负相关，样本中的真菌毒素浓度依据由真菌毒素标准品浓度和对应的发光值建立的四参数数学模型进行定量，从而检测样本中的真菌毒素含量。
31.在本发明的方法中，示例性的，所述生物素标记的真菌毒素抗原工作液是将生物素标记的真菌毒素抗原用0.01mol/l磷酸盐缓冲液和0.5％牛血清白蛋白溶液按1:10-1:1000比例稀释得到生物素标记的真菌毒素抗原工作液。
32.示例性的，所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液是将碱性磷酸酶标记的链霉亲和素用0.01mol/l磷酸盐缓冲液和0.5％牛血清白蛋白溶液按1:10-1:1000稀释得到碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液。
33.进一步的，所述待测样本选自粮食、食用油、食品或饲料。检测时，需要将粮食等样本先进行提取，具体可按照gb5009.22—2016中的条件对样本中的待测真菌毒素进行提取。
34.进一步的，所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素a和t-2毒素中的一种或多种。
35.另外，如无特殊说明，本发明中所用原料均可通过市售商购获得，本发明所记载的
任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。所述百分比如无特殊说明均为体积百分比，所述溶液若无特殊说明均为水溶液。
36.本发明的有益效果如下：
37.与现有技术相比，本发明利用介孔二氧化硅负载纳米金然后物理吸附的方式偶联抗体，避免化学偶联方法对抗体结构的破坏，同时起到良好的保护抗体作用；介孔二氧化硅的多孔结构有利于传质，克服常规酶联免疫吸附法中固/液接触面积小，反应速度慢且不彻底的缺点，因此，本发明提供了一种灵敏稳定的快速定量检测真菌毒素方法。
附图说明
38.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
39.图1为本发明检测真菌毒素的原理图。
40.图2为介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体的tem图。
具体实施方式
41.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
42.实施例1介孔二氧化硅负载纳米金的制备
43.(1)介孔二氧化硅的合成：室温条件下，将0.6g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于25ml蒸馏水中，搅拌状态下把加入0.8g paa。在快速搅拌状态下加入2g氨水(浓度25％)。此时原来澄清的溶液变为乳白色悬浮液。搅拌20min后，加入2.0g正硅酸乙酯，剧烈搅拌20min后，转移到比色管中，密封，120℃静置反应48h。反应结束后离心、洗涤，然后50℃烘干，最后550℃焙烧6小时，即得到介孔二氧化硅。
44.(2)介孔二氧化硅的氨基化：称取1g的二氧化硅于烧杯中，加入200ml蒸馏水，加热至沸腾，然后恒温保持2h，然后离心、80℃烘干，即得活化的介孔二氧化硅。将活化的介孔二氧化硅置于圆底烧瓶中，加入50ml甲苯，超声使之充分分散，在搅拌条件下加入1ml硅烷偶联剂，然后110℃冷凝回流20h。冷凝回流结束后离心、无水乙醇清洗3-5次，然后80℃烘干，即得氨基化介孔二氧化硅。
45.(3)介孔二氧化硅负载纳米金的合成：称取10mg的氨基化介孔二氧化硅于2ml蒸馏水中，充分搅拌均匀。然后加入100μl 0.01mol/l的氯金酸溶液，搅拌10min后超声分散10min，然后加入新鲜制备的200μl 0.01mol/l硼酸氢钠溶液，再继续搅拌2h。最后离心、蒸馏水洗涤3次，即得介孔二氧化硅负载纳米金。
46.实施例2介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体的制备
47.取实施例1中的介孔二氧化硅负载纳米金加入0.01mg黄曲霉毒素b1抗体，再加入mes缓冲溶液补齐至2ml，室温下混匀4h后，离心去上清液，用pbs溶液清洗3次，然后用1％bsa溶液封闭2h，最后分别用0.1％pbst和pbs溶液清洗2次，1ml pbs溶液定容，4℃保存备用，见图2。
48.取100μl上述溶液，加入过量黄曲霉毒素b1标准溶液，充分混合均匀，再经过离心、
清洗、洗脱步骤，并使用高效液相色谱按照gb5009.22—2016中的条件对洗脱液中的黄曲霉毒素b1进行分析测试，结果为100μl介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体溶液对黄曲霉毒素b1的最大特异性吸附量为6.9ng。
49.实施例3基于介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体的化学发光免疫分析方法
50.(1)取实施例2中介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体溶液50μl于离心管中，加入0.1％ pbst溶液100μl，充分混合均匀。
51.(2)加入20μl待测玉米样本提取液(84％乙腈水提取)，孵育5min，然后加入100μl生物素标记的黄曲霉毒素b1工作液，孵育5min。
52.(3)孵育结束后，离心去上清液，然后用0.1％tbst溶液清洗两次，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液，孵育5min。
53.(4)孵育结束后，用0.1％tbst溶液清洗两次，然后加入150μl底物液，混匀60s，取100μl至96孔酶标板，检测酶标板各孔在430nm处的发光值。根据标准品做出标准曲线，被测样本数据带入标准曲线可得到样本的检测值。
54.(5)该方法准确性和重复性考查，结果如表1所示。
55.表1.化学发光免疫方法检测玉米中afb1准确性和重复性考查
[0056][0057][0058]
实施例4基于介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体的化学发光免疫分析方法的检出限和定量限
[0059]
取空白玉米样品5g，加20ml 84％乙腈水，涡旋混匀，置于涡旋振荡器上振荡20min，然后离心5min得到提取液备用。其他操作步骤与实施例3中步骤一致，将所得发光值代入标准曲线得到检测数值，如此操作重复20次，得到20个数值，计算其均值和标准偏差，检出限为均值加上3倍标准偏差，定量限为均值加上10倍标准偏差，结果为检出限0.8μg/kg，定量限1.5μg/kg。对比例1本对比例提供介孔二氧化硅化学偶联抗体的方法
[0060]
称取10mg的氨基化介孔二氧化硅于1ml mes缓冲溶液中，充分搅拌均匀。然后加入100μl 10mg/ml 1-乙基-(3-二甲基氨丙基)-碳酰二亚胺溶液反应10min，然后100μl 2mg/ml n-羟基丁二酰亚胺溶液加入溶液反应10min。活化完成后离心去掉上清液，并用mes缓冲溶液清洗两次。加入1mg黄曲霉毒素b1抗体，并用mes缓冲溶液补齐至2ml，室温下混匀2h后，离心去上清液，用pbs溶液清洗3次，然后用1％bsa溶液封闭2h，最后分别用0.1％pbst和pbs溶液清洗2次，1ml pbs溶液定容，4℃保存备用。
[0061]
取100μl上述溶液，加入过量黄曲霉毒素b1标准溶液，充分混合均匀，再经过离心、清洗、洗脱步骤，并使用高效液相色谱按照gb5009.22—2016中的条件对洗脱液中的黄曲霉毒素b1进行分析测试，结果为100μl介孔二氧化硅化学偶联抗体溶液对黄曲霉毒素b1的最大特异性吸附量为1.0ng，且表现出非常强的非特异性吸附。
[0062]
与实施例2对比，由此可见，本发明的介孔二氧化硅负载纳米金物理吸附偶联抗体的方式表现出明显优势。
[0063]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

技术特征：
1.一种基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体，生物素标记的真菌毒素抗原，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，以及底物液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体是通过如下方法制备获得：(1)介孔二氧化硅的合成：室温条件下，将0.2-1.0g十六烷基三甲基溴化铵溶解于蒸馏水中，搅拌状态下加入0.1-1.0g聚丙烯酸，然后搅拌状态下加入1.0-4.0g浓度为25％的氨水，继续搅拌，再加入1.0-5.0g正硅酸乙酯，搅拌后，密封，100-130℃静置反应24-48h，反应结束后离心、洗涤，然后烘干，最后550-600℃焙烧3-6h，得到介孔二氧化硅；(2)介孔二氧化硅的氨基化：将步骤(1)制备的介孔二氧化硅置于蒸馏水中，加热至沸腾，然后恒温保持0.5-4h，离心，烘干，得到活化后的介孔二氧化硅；将活化后的介孔二氧化硅分散于甲苯中，在搅拌条件下加入硅烷偶联剂，然后110℃冷凝回流10-20h，冷凝回流结束后离心，无水乙醇清洗，烘干，得到氨基化介孔二氧化硅；(3)介孔二氧化硅负载纳米金的合成：将步骤(2)制备的氨基化介孔二氧化硅置于蒸馏水中，然后加入氯金酸溶液，搅拌后超声分散，再加入硼酸氢钠溶液，继续搅拌，最后离心、蒸馏水洗涤，得到介孔二氧化硅负载纳米金；(4)取步骤(3)制备的介孔二氧化硅负载纳米金中加入真菌毒素抗体，再加入mes缓冲溶液，室温条件下混匀2-4h后，离心去上清，然后用pbs溶液清洗，再用1％bsa溶液封闭2-4h，然后依次用0.1％pbst溶液和pbs溶液清洗，最后置于pbs溶液中即得。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括稀释液和清洗液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为包含0.01％-1.0％的tween-20或triton-100的pbs缓冲液、包含0.01％-0.5％的tween-20或triton-100的tbs缓冲液、包含0.01％-0.5％的tween-20或triton-100的去离子水中的一种；所述清洗液为包含0.01％-2.0％的tween-20或triton-100的tbs缓冲液。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物液为含(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐的缓冲液；优选的，所述底物液中，(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐的浓度为1-2mmol/l。6.一种利用权利要求1-5任一所述的试剂盒检测真菌毒素的方法，其特征在于，该方法包括：(1)取介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体溶液，加入稀释液，混合均匀；(2)加入待测样本，孵育5-10min，然后加入生物素标记的真菌毒素抗原工作液，孵育5-10min；(3)离心去上清，然后用清洗液清洗，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液，孵育5-10min；(4)用清洗液清洗，然后加入底物液，混匀，取样至酶标板，然后通过酶标仪读取发光值；(5)样本的发光值与真菌毒素的含量呈负相关，样本中的真菌毒素浓度依据由真菌毒素标准品浓度和对应的发光值建立的四参数数学模型进行定量，从而检测样本中的真菌毒素含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生物素标记的真菌毒素抗原工作液是将生物素标记的真菌毒素抗原用0.01mol/l磷酸盐缓冲液和0.5％牛血清白蛋白溶液按照1:10-1:1000的比例稀释得到生物素标记的真菌毒素抗原工作液。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液是将碱性磷酸酶标记的链霉亲和素用0.01mol/l磷酸盐缓冲液和0.5％牛血清白蛋白溶液按照1:10-1:1000的比例稀释得到碱性磷酸酶标记的链霉亲和素工作液。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本选自粮食、食用油、食品或饲料。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素a和t-2毒素中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒及检测方法。其中，该基于化学发光免疫分析法检测真菌毒素的试剂盒包括：介孔二氧化硅负载纳米金偶联抗体，生物素标记的真菌毒素抗原，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，以及底物液。本发明利用介孔二氧化硅负载纳米金然后物理吸附方式偶联抗体，避免化学偶联方法对抗体结构的破坏，同时起到良好的保护抗体作用；介孔二氧化硅的多孔结构有利于传质，克服常规酶联免疫吸附法中固/液接触面积小，反应速度慢且不彻底的缺点，提高了检测真菌毒素的灵敏度和准确性。测真菌毒素的灵敏度和准确性。测真菌毒素的灵敏度和准确性。


技术研发人员：倪保霞 刘洪美 轩志宏 郭宝元
受保护的技术使用者：国家粮食和物资储备局科学研究院
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/23