基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用

1.本发明属于生物检测技术领域，特别是涉及到一种基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用。


背景技术：

2.核酸是一种重要的生物成分，在生命过程中起着至关重要的作用。每个物种都有自己特定的核酸序列。许多研究人员认为，核酸作为生物标志物的检测是生命科学领域最重要的工具之一，特别是在核酸相关疾病的临床研究中。然而，具有显著检测能力的核酸方法太少，仍然需要大量扩增。
3.在现有技术中，各种扩增方法已被用于核酸靶标的检测。其中，基于经典聚合酶链式反应(pcr)的扩增被广泛使用。然而，聚合酶链式反应强烈依赖于精确的热循环程序，这需要昂贵而笨重的仪器。核酸的等温扩增由于其固有的优势，包括快速扩增、简单的反应程序和进行扩增所需的小型化设备，已显示出作为传统基于pcr的扩增的替代品的巨大前景。这些功能对于资源有限的环境中的护理点测试或现场分子诊断至关重要化学和生物分子工程系。
4.因此，现有技术亟需一种新的方案来解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用，能够精确扩展短起始寡核苷酸重复元件，可以用于精确的mirna扩增检测，用更简单的部件实现显著而快速的信号放大。
6.基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法，采用倒数双单链dna探针介导的等温扩增tpia，tpia由bst dna聚合酶、短ssdna探针a和长ssdna探针b在37℃下进行；经过循环聚合和置换后形成具有重复气泡结构单元发夹的长单链dna。
7.所述ssdna探针a的3
′
端与ssdna探针b的3
′
末端高度互补，用于初始连续dna延伸。
8.所述重复气泡结构单元发夹的长单链dna的形成过程为：
9.ssdna探针a和ssdna探针b相互依赖作为延伸模板，在bst dna聚合酶的辅助下传递双链dna结构；ssdna探针a的3
′
端延伸到与ssdna探针b的5
′
端相同的长度时，聚合停止；高温下氢键稳定性减弱，使dna末端瞬时熔化解开dsdna链；
10.dsdna链被重新匹配后，新形成的dsdna的a链5
′
端和b链3
′
端均形成折回结构；以dsdna链b为模板，进一步延长链b的3
′‑
端，形成自头dna发夹，脱离循环反应体系；
11.a链被新形成的dsdna取代，形成具有气泡结构的较长ssdna；新合成的ssdna延伸探针a链的3'端包含一个b
–
，和一个与ssdna探针b的3'末端结合的序列；
12.新合成的链的3'端将在另一个延伸周期中再次用作新探针a，在bst dna聚合酶的作用下，两者将能够相互依赖作为延伸模板，形成更长的dsdna；然后反应进行到下一个循环产生具有气泡结构的串联重复的超长ssdna产物。
13.基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法的应用，应用基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法制备生物传感器用于诊断mirna。
14.通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用，仅使用一个引物进行等温扩增，具有较高的扩增效率，并使用37℃作为恒温。相对设计的模板形成了hp，它只能通过与靶核酸的特异性结合来打开。tpia系统允许以等温方式对mirna进行便携式和超灵敏的检测。通过自由改变互补靶标配对片段核酸序列，该策略可以被探索为在等温条件下检测其他核酸靶标的通用用户友好平台。通过重新设计模板以在等温条件下靶向感兴趣的分子，预计tpia策略将用于进一步扩增和高效可靠地检测其他生物分子，如小分子和蛋白质。
附图说明
15.以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：
16.图1为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用泡泡图。
17.图2为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用探针b的a/b/c区域长度示意图。
18.图3为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用探针a和探针b的浓度示意图。
19.图4为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用tpia实验反应条件优化示意图。
20.图5为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用实施方式tpia检测系统的实时荧光光谱图。
21.图6为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用hela和mcf-7细胞中提取不同浓度的总rna样品直方图。
22.图7为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用tpia系统荧光标记图。
23.图8为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用发夹hp茎环结构示意图。
24.图9为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用tpia检测系统的灵敏度分析图。
25.图10为本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用tpia选择性分析示意图。
具体实施方式
26.基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法，如图所示，tpia由bst dna聚合酶、短ssdna探针a(5
′
b-a)和长ssdna探针b(5
′
a*-b*-c-b-a*)在37
°
c下进行。然后在循环聚合和置换后形成具有重复单元发夹(气泡结构)的长单链dna，如方案1所示，用与相应的未标记字母匹配的*结构域字母标记。ssdna探针a的3
′
端与ssdna探针b的3
′
末端高度互补，是实现初始连续dna延伸所必需的重要成分。dna延伸的过程很简单。它只涉及自发的dna重折叠和延伸，可以分为许多重复周期。首先，探针a和b可以相互依赖作为延伸模板，在bst dna聚合
酶的帮助下传递双链dna(dsdna
①
)结构。当探针a的3
′
端延伸到与探针b的5
′
端相同的长度(b-a-b*-c*-b-a)时，聚合停止。然后，由于在高温下氢键稳定性的减弱，使用dna末端的瞬时熔化可以容易地解开dsdna链。由于这些探针的高度互补结构，当解链的dsdna被重新匹配时，新形成的dsdna的a链5
′
端和b链3
′
端都倾向于形成折回结构(
②
)。在这种情况下，以dsdna链b为模板，可以进一步延长链b的3
′‑
端，形成自头dna发夹(b*-a*-b-c-b*-a*)，脱离循环反应体系。a链被新形成的dsdna取代，形成具有气泡结构的较长的ssdna(
③
)。新合成的ssdna延伸探针a链的3'端包含一个b
–
一个与另一个ssdna探针b的3'末端结合的序列。因此，新合成的链的3'端将在另一个延伸周期中再次用作新探针a。在bst dna聚合酶的作用下，两者将能够相互依赖作为延伸模板，形成更长的dsdna(
①
)。然后反应进行到下一个循环。ssdna探针a可以使用相互启动和延伸的多个循环以可编程和自主的方式产生具有气泡结构的串联重复的超长ssdna产物。这些ssdnab探针形成不同长度的dsdna发夹。聚合和置换反应可以在聚合酶的存在下重复进行。通过利用这种新机制，可以用更简单的部件实现显著而快速的信号放大。同时，tpia系统可以用作自主模块，通过自由集成目标识别模式和信号输出，为生物传感程序和相关程序提供通用的实现。这种方法被成功地用于诊断不同的mirna(mir-21和221)，以证明其普遍适用性。
27.以下通过具体实验验证本发明设计方案的可行性。
28.1、试剂和材料
29.本验证过程中使用的所有dna和rna寡核苷酸(寡核苷酸)均由sangon biotech co.，ltd.(中国有限公司)商业化制造和纯化。详细的序列信息如表1所示，表1中斜体的寡核苷酸代表优化的结构域和突变位点；hp中的下划线字母表示与目标dna互补的序列；a,b和c表示探针的不同区域。将寡聚物预悬浮在1
×
bst反应缓冲液(20mm tris-hcl、10mm(nh4)2so4、10mm kcl、2mm mg so4和0.1％x-100)中，ph为8.8，浓度为100μm，温度为25℃。sybr green i(1000x)和sybr safe dna从赛默飞世尔科学公司(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)获得。脱氧核苷酸溶液混合物(dntp)和甜菜碱来购自中国。bst2.0dna聚合酶购自新英格兰生物实验室股份有限公司(美国马萨诸塞州贝弗利)。人血清购自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。所有其他化学品均为分析试剂级，并在整个工作过程中与超纯水(》18.3mw)一起使用。
30.表1
[0031][0032]
2、tpia反应的条件优化
[0033]
如图4所示，图中a为bst dna聚合酶浓度优化，b为甜菜碱浓度优化，c为温度优化，此过程验证了本发明tpia方法的可行性。系统地优化了该方法的参数，包括结构域长度a
–
c、甜菜碱浓度、bst dna聚合酶量、mg2+剂量和反应温度，以确保tpia的成功反应效果。使用荧光值来测量扩增产物的最终结果。tpia在30μl的总体积中进行90分钟，其中包括3μl探针a、3μlb探针、10μl mirna、2μl dntp、2μ
lb
st dna聚合酶、5μl 5
×
bst缓冲液和1μl 20
×
sybr green i。
[0034]
3、实时tpia检测
[0035]
反应在steponeplus应用的生物系统上进行，该生物系统具有探针a(0.4μm)、hp dna模板(0.1ng/μl)、bst dna聚合酶(8u/μl)，dntp(2mm)、5
×
bst缓冲液和20
×
sybr green i。热循环条件为37℃，持续2小时，然后进行高分辨率熔融分析。
[0036]
4、荧光检测性能和测量
[0037]
如图5所示，为用bst dna聚合酶检测靶标mir-21存在和不存在时tpia检测系统的实时荧光光谱，所有反应均在总体积为30μl的条件下进行，一式三份进行测定。每个反应体积包含10μl的mirna、3μl的hp(500nm)、1μl的探针a-hp(100nm。用dna片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)实验时，双链浓度为5μm。使用nanodrop 3300荧光分光光度计(thermo scientific，waltham，ma，usa)在室温下监测所有所需的荧光光谱。发射和激发狭缝的宽度
被设置为10nm。通过将激发波长固定在527nm，从500nm到700nm扫描荧光发射光谱。然后使用荧光分光光度计测量荧光强度。
[0038]
5、凝胶电泳
[0039]
对于page，将含有2μl 6
×
负载缓冲液的10μl等份反应溶液在12％聚丙烯酰胺凝胶上溶解。该程序在150v的恒定电压下，在1
×
tbe运行缓冲液(89mm三硼酸和2mm edta，ph 8.3)中进行90分钟。在某些情况下，还通过page分析扩增结果，然后进行sybr安全dna染色20分钟。使用凝胶成像系统(azure biosystems c600，ca，usa)获得扩增产物图像。
[0040]
6、细胞培养和rna提取
[0041]
如图6所示，为从hela和mcf-7细胞中提取不同浓度的总rna样品直方图，mcf-7(人类乳腺腺癌)和hela癌细胞系在37℃的加湿5％二氧化碳培养箱中用10％的胎牛血清在补充杜尔贝克改良鹰培养基(dmem，gibco)中培养。在细胞培养48小时后释放了媒体。根据制造商的说明，mir-21是使用人类mirneasy迷你试剂盒从细胞中提取的。mcf-7和hela细胞用冰-冷磷酸盐缓冲盐缓冲液洗涤，然后在冰上再悬浮1ml qiazol裂解试剂和20u rna酶抑制剂20min。然后大力旋转混合物，彻底裂解细胞，获得均匀的裂解物。其次，用移液管混合0.2ml细胞溶液，然后在室温下用4个5-s脉冲超声5分钟以分解核蛋白复合物。产生的超级游泳池被转移到一个新的收集管中，然后与1.5体积的100％乙醇完全混合。最后，根据标准协议，使用自旋柱纯化了microrna。用超纯水洗脱后，制备的rna样本立即用于细胞裂解物中的这一分析或储存在-80℃下。
[0042]
7、细胞和临床样本中的mirna图谱
[0043]
接下来，将10％的人血清添加到上述tpia反应混合物中，以便在复杂基质中监测该测定的灵敏度。简言之，在该系统的反应缓冲液中混合不同浓度的靶mirna、探针a-hp、hp(探针b)和bst dna聚合酶。具体而言，将0.1单位/ml rnase抑制剂添加到用于在加标血清样品中检测mirna的测定中，以消除rnase干扰。
[0044]
为了检测细胞和临床样品中的多种mirna，将0.25纳克/μl从mcf-7和hela细胞中提取的mirna与500nm引物溶液、500nm模板溶液、8u bst dna聚合酶、40u rnase抑制剂和10mm甜菜碱溶液混合在30μl反应缓冲液中。癌症细胞样本在使用前储存在-80℃的冰箱中。
[0045]
8、统计分析
[0046]
使用graphpad prism 7(graphpad software，la jolla，ca，usa)进行实验的统计分析。所有数据均以平均值
±
标准差(sd)的形式报告。p值《0.05表示有统计学意义的差异。
[0047]
上述实验过程的结果验证如下：
[0048]
1、tpa机理和表征
[0049]
探针a和b的扩增序列是两个重要成分，它们在5
′
端被标记，分别用荧光物质cy5和cy3进行表征，以验证tpia系统反应。探针a和b与大片段bst聚合酶一起在55℃下孵育2小时，如图1所示，表示通过cy5和cy3通道的输出荧光信号。泳道1和2分别代表探针b和a，而泳道3和4代表tpia非扩增和扩增产物。已经证明这两个片段都被扩增了。nature page凝胶验证了在探针a和探针b序列的孵育溶液中具有不同荧光修饰的tpia程序。第1行：cy3标记的探针b；第2行：cy5标记的探针a；第3行：不含bst聚合酶的cy3标记的探针b和cy5标记的探针a的混合物；第4行：cy3标记的探针b和cy5标记的探针a与bst聚合酶的混合物。将反应物与2mm dntp在55℃下孵育2小时。当tpia系统与所有元素混合时(泳道4)，探针a和b的序列如
预期的那样成功扩展。在没有任何因素的情况下混合溶液时，不存在产物片段(泳道1-3)。通过同时扩增探针a和b片段来指示tpia构建体的扩增。
[0050]
2、tpia反应优化
[0051]
对相关实验条件进行了优化，以提高生物传感器的检测性能。还优化了各种化验测试条件以获得最佳性能。dna探针优化似乎是影响靶序列测定效率提高的关键变量。因此，使用探针b核苷酸的不同结构域长度(a、b和c)来扩增探针a。为了简洁起见，表1中示出了不同结构域长的性能分析的子集。在该测定中，需要探针b的3
′
端的环结构域a*和5
′
端的干结构域“a”来证明扩增反应的可能性。这些结构域(a、b和c)在每个步骤都代表了本研究的合成测定，尽管它们不一定显示出最佳的扩增效果。
[0052]
结构域“a”的碱基数在长度《6nt时具有相对较弱的荧光信号。在6
–
14个nt碱基的情况下，荧光信号处于相对稳定和较强的水平。结构域“b”的荧光强度与4-14nt碱基的结果相似。模板探针b中结构域“c”的优化显示，除2nt外，从5到35nt的所有长度都具有相似且强的信号。因此，选择了结构域a、b和c，在随后的实验中，6
–
14nt、4
–
14nt和5
–
35nt作为模板探针b的长度，如图2所示，试图将tpia机制与核酸检测区分开来。
[0053]
理论上，tpia机制的扩增效率依赖于一个长的ssdna模板探针b和一个短的ssdna引物a序列。因此，引物和模板序列的浓度也得到了优化。f/f0值在0.1到1的范围内增加，在1到3的范围内减少，如图3a和3b所示。因此，探针a的最佳体积的值为1。此外，对0.1至4范围内的不同探针b体积进行了分析。结果表明，在探针b的体积为3。
[0054]
在1和10u之间的范围内检测bst dna聚合酶效应。当bst dna多聚酶浓度为4u时，f/f0达到相对稳定的状态，如图4a所示，其被选为该方法的合适含量。甜菜碱的用量也需要优化。f/f0值稳步上升，直到甜菜碱达到4mm的浓度(图4b)。因此，在优化的剂量下，甜菜碱的浓度为4mm。还进行了延伸和置换反应的温度分析(图4c)，以确定25℃、37℃、45℃、50℃和55℃的孵育温度下的测定性能。当温度为37℃时，f/f0值明显增加，这表明dna探针足以与靶标杂交并进行延伸。虽然高温水平证明了优选的结果，但为了降低现场测定要求的测定条件。因此，选择37℃的培养温度。恒定的rt温度也优化了样品检测步骤，该步骤可以在现场执行。
[0055]
3、可行性研究
[0056]
使用bst dna聚合酶的填充延长了原始种子(探针a)，同时准确地维持了重复单元(气泡结构)并有效地延长了引物种子。探针a结构域“b”是自折叠的并且高度互补。它是实施连续dna延伸程序的核心。相比之下，只需要无震碱基配对的结构域“a”的排列就不那么严格了。模板探针b中间的域“c”可以设计为信号输出片段，用于几个生物分析平台。总之，重复原始种子(探针a)循环的伸长步骤接近pcr扩增程序。然而，在这个过程中没有温度变化。因此，tpia系统能够将短dna链扩增为涉及周期性序列重复的长链，并允许在37℃下进行有效的自发解离。这种提出的方法能够精确扩展短起始寡核苷酸重复元件，可以作为dna纳米工程师工具箱中的一种有价值的补充。
[0057]
生成的产物片段足够长，可以使用实时荧光分析进行进一步验证。靶mirna-21被设计为引物探针a，以利用这一新的设计原理。dna序列探针b列于表s1中(探针b-21)。结果表明，tpia可以用于精确的mirna扩增检测。当添加靶引物时，观察到显著的荧光信号(图5)，表明通过引物-探针重新设计的靶核酸检测是成功的，并说明了该策略的实用诊断能
力。据我们所知，这是第一项使用ssdna模板进行ssdna引物延伸的研究，其中模板被编辑以嵌入dna发夹中，这只能在特定的引物核酸特异性触发后进行。
[0058]
4、用于mirna检测的tpia
[0059]
从另一个角度来看，该策略中使用的设计模板探针b可以形成精心设计的发夹干环结构，该结构可以通过特异性整合靶核酸来识别和打开，如图2所示。因此，合成了一种高度特异性的发夹结构作为mirna识别的发夹型装置，这是一种基于靶点重新设计的探针b-hp模板(a*-b-c-b*-a)。探针b-hp干区在hp被mirna靶标打开后被揭示，活化d作为模板。探针a的引物特异性地结合到模板上，并开始延伸用于tpia反应。下一个延伸步骤置换结合的靶核酸mirna，然后将其循环使用另一个hp。延伸的单链dna与连续重复的延伸和置换反应有关。
[0060]
该方法的具体原理如下：作为一个关键部件，设计的hp由环区和茎区探针a识别位点的靶标和引物组成，如图8所示，茎环结构(发夹，hp)，可以通过匹配hp环结构中的靶mir-21核苷酸来识别和打开。然后，探针a的引擎引物与作为模板的开放mir-21hp杂交，使用bst dna聚合酶启动重复的延伸和置换tpia反应。所设计的hp-tpia系统由两个放大阶段组成。首先，hp通过粘附在hp内靶识别位点的靶mir-21传播，形成mirna/hp异源二聚体，这揭示了互补的引物结构域。hp在hp打开时被重新排列，作为探针b的模板，并在bst聚合酶的存在下启动tpia系统。在那之后，mir-21链释放并启动了另一个hp开放周期，引物延伸。因此，重复使用靶mir-21序列来实现信号扩增。第二，hp开放产生触发器，该触发器进入并启动tpia反应的扩增。将延伸的引物链进行连续重复的延伸和置换反应。最后，许多含有周期性序列重复的长链dna样本被包括在形成中，这是使用荧光信号进行监督的。
[0061]
hp在没有靶mir-21序列的情况下维持其发夹环结构，并且互补引物结构域在茎区保持部分封闭。随后的tpia反应不会进行。因此，不能形成产物并且不能产生荧光扩增。
[0062]
当mirna-21和mirna-221靶点的量从0增加到500nm时，存在显著的荧光信号，如图9所示，图中tpia检测系统的灵敏度分析。(a)mirna-21量的荧光光谱范围为0-500nm；(b)荧光信号(f/f0)与mirna-21数量的对数之间的线性关系。mirna-221的线性拟合方程：y＝0.4188*x+0.4709，r2＝0.972。(c)mirna-221量的荧光光谱范围为0至500nm；(d)荧光信号(f/f0)与mirna-221数量
的
对数之间的线性关系。mirna-221的线性拟合方程：y＝0.5203*x+0.4867，r2＝0.938。标准偏差至少基于三个独立的实验。
[0063]
f/f0荧光值在10至107和108fmol的范围内显示出与靶mirna浓度(x＝lg-cmirna)的良好线性关系，其分别使用方程y＝0.4188*x+0.4709(r2＝0.972)和y＝0.5203*x+0.4867(r2＝0.938)表示。基于这些结果，根据3σ/斜率的公式计算出检测限为10fm和1fm，其中σ是空白偏差，斜率是校准曲线。该检测极限与现有技术中其他核酸扩增分析的检测极限对比如表2所示。此外，该检测值的极限是使用tpia扩增系统在2小时内以良好的灵敏度获得的，并且不需要任何逆转录步骤。
[0064]
表2、不同mirna检测方法的比较
[0065][0066]
进一步研究了超灵敏核酸分析对所开发的tpia扩增系统的特异性。特异性是引物生物传感器实用性的另一个主要因素，尤其是对多种mirna的同时检测。为了验证本方法的特异性，用人工不匹配的靶标对tpia生物传感器进行了挑战。sm和tm合成分别代表单个和三个碱基错配的靶标。还分析了其他mirna，如mir-210和错配序列。每个mirna的量约为100nmol。如图10所示，图中，用于(a)靶mirna21和无靶材料以及(b)靶mirna221和无靶物质的tpia检测的hp生物传感器。所有mirna的量均为100nm。sm：单基地不匹配目标，tm，三基不匹配目标。f和f0分别表示靶mirna存在和不存在时的荧光强度。图中可见，靶mir-21和mir-221的条带是清晰的。对于非靶核酸没有明显的信号。这表明tpia生物传感器可以识别单碱基错配的靶核酸，在mirna检测中显示出tpia策略对不同序列的良好选择性。
[0067]
为了评估mirna检测生物传感器在复杂生物样品测试中的适应性，用10％的人血清(depc处理的水)掺入稀释10倍(1pm、10pm和100pm)的不同量的mirna-221作为模拟患者样品。这是由于血清作为一种现实的复杂物质，涉及多种蛋白质和其他复杂基质。高度复杂的血清基质能够限制所提出的生物传感器直接检测血清中mirna的能力。回收率(％)定义为通过tpia测定的平均测试浓度与mirna-221的加标稀释含量的比率图表3所示。这些结果表明，血清样品的干扰平均回收率(％)在105％-108％之间。相对标准偏差为2.78-11.13％。这些结果表明，当检测模拟基质样品中的目标核酸时，tpia生物传感器具有可接受的再现性。
[0068]
表3、在10％的人类血清样品中回收mirna-221
[0069][0070]
为了在真实样本分析中进一步证明所提出的方法中生物样本的干扰，使用从hela和mcf-7细胞提取的总rna样本裂解物来实现所提出的生物传感器。使用分光光度计在260nm处使用吸光度来探索总rna的浓度。用depc处理过的水将制备的总rna样品稀释至所需密度。然后将rna样品加入到用于mirna-21检测的tpia系统中。总rna量从40ng增加到4ng，同时靶mirna-21表达水平和相应的荧光峰幅度增加(图6)。这些结果与使用tpia反应缓冲液获得的结果一致，表明所提出的tpia传感器在临床样本分析中具有潜力。
[0071]
通过具体实验验证，证明本发明基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用，探针b的模板和探针a的引物的独特设计使循环引物延伸成为可能。考虑到先前开发的等温扩增技术通常涉及复杂的多个引物组、高反应温度和低扩增效率，本发明方法仅使用一个引物进行等温扩增，具有较高的扩增效率，并使用37℃作为恒温。相对设计的模板形成了hp，它只能通过与靶核酸的特异性结合来打开。tpia系统允许以等温方式对mirna进行便携式和超灵敏的检测。通过自由改变互补靶标配对片段核酸序列，该策略可以被探索为在等温条件下检测其他核酸靶标的通用用户友好平台。通过重新设计模板以在等温条件下靶向感兴趣的分子，本发明可用于进一步扩增和高效可靠地检测其他生物分子，如小分子和蛋白质。

技术特征：
1.基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法，其特征是：采用倒数双单链dna探针介导的等温扩增tpia，tpia由bstdna聚合酶、短ssdna探针a和长ssdna探针b在37℃下进行；经过循环聚合和置换后形成具有重复气泡结构单元发夹的长单链dna。2.根据权利要求1所述的基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法，其特征是：所述ssdna探针a的3
′
端与ssdna探针b的3
′
末端高度互补，用于初始连续dna延伸。3.根据权利要求1所述的基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法，其特征是：所述重复气泡结构单元发夹的长单链dna的形成过程为：ssdna探针a和ssdna探针b相互依赖作为延伸模板，在bstdna聚合酶的辅助下传递双链dna结构；ssdna探针a的3
′
端延伸到与ssdna探针b的5
′
端相同的长度时，聚合停止；高温下氢键稳定性减弱，使dna末端瞬时熔化解开dsdna链；dsdna链被重新匹配后，新形成的dsdna的a链5
′
端和b链3
′
端均形成折回结构；以dsdna链b为模板，进一步延长链b的3
′‑
端，形成自头dna发夹，脱离循环反应体系；a链被新形成的dsdna取代，形成具有气泡结构的较长ssdna；新合成的ssdna延伸探针a链的3'端包含一个b
–
，和一个与ssdna探针b的3'末端结合的序列；新合成的链的3'端将在另一个延伸周期中再次用作新探针a，在bstdna聚合酶的作用下，两者将能够相互依赖作为延伸模板，形成更长的dsdna；然后反应进行到下一个循环产生具有气泡结构的串联重复的超长ssdna产物。4.基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法的应用，其特征是：应用基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法制备生物传感器用于诊断mirna。

技术总结
基于新型等温扩增的核酸超灵敏检测方法及应用，属于生物检测技术领域，本发明采用探针B的模板和探针A的引物使循环引物延伸，仅使用一个引物进行等温扩增，具有较高的扩增效率，并使用37℃作为恒温；相对设计的模板形成了HP，它只能通过与靶核酸的特异性结合来打开；TPIA系统允许以等温方式对miRNA进行便携式和超灵敏的检测；通过自由改变互补靶标配对片段核酸序列，该策略可以被探索为在等温条件下检测其他核酸靶标的通用用户友好平台；通过重新设计模板以在等温条件下靶向感兴趣的分子，本发明可用于进一步扩增和高效可靠地检测其他生物分子，如小分子和蛋白质。如小分子和蛋白质。如小分子和蛋白质。


技术研发人员：万家余 卜胜君 周虹羽 孙赫 孟鹤媛
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/9/23