来源于乳铁蛋白的抗氧化肽及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及来源于乳铁蛋白的抗氧化肽及其应用。


背景技术：

2.随着自由基生物学及医学的发展，自由基及抗氧化剂的研究日益引起人们的重视。活性氧是人体细胞生理代谢副产物，包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧和过氧化氢等，会被细胞抗氧化系统及时清除(guo y,zhang t,jiang b,et al.the effects of an antioxidative pentapeptide derived from chickpea protein hydrolysates on oxidative stress in caco-2 and ht-29 cell lines[j].journal of functional foods,2014,7:719-726.)。在某些情况下，自由基过量积累会在体内引发氧化应激反应，造成细胞内生物大分子如蛋白质、脂质、dna等的氧化损伤，从而加速机体衰老，引发神经退行性疾病、动脉粥样硬化、慢性炎症、癌症等多种疾病(garc
í
a-nebot m j,recio i,hern
á
ndez-ledesma b.antioxidant activity and protective effects of peptide lunasin against oxidative stress in intestinal caco-2cells[j].food and chemical toxicology,2014,65:155-161.)。研究表明，体外摄入抗氧化剂可以清除体内过多的自由基、降低机体氧化应激水平，可以起到预防、甚至治疗某些疾病的作用(he r,ju x,yuan j,et al.antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation[j].food research international,2012,49(1):432-438.)。氧化也是造成食品变质，降低营养价值甚至产生有害物质的重要原因之一，因此抗氧化剂在保健品、食品、医药和化妆品领域有广泛的需求。由于合成抗氧化剂的长期摄入对人体健康存在潜在危害，天然食源性抗氧化剂越来越受到青睐(liu c,ren d,li j,et al.cytoprotective effect and purification of novel antioxidant peptides from hazelnut(c.heterophylla fisch)protein hydrolysates[j].journal of functional foods,2018,42:203-215.)。在天然抗氧化剂中，动植物食物蛋白来源抗氧化肽由于其分子量低、活性高、易于吸收、无色无味、无副作用等优点受到广泛关注(mahgoub s,alagawany m,nader m,et al.recent development in bioactive peptides from plant and animal products and their impact on the human health[j].food reviews international,2021:1-26.)。抗氧化肽种类众多，分子大小各不相同，溶解性各有差异，为其开发利用提供了更多选择。
[0003]
抗氧化肽的获得主要有以下途径：一是直接从动植物细胞裂解物中筛选；二是以动植物蛋白为原料，选择适当的酶进行水解，采用超滤、色谱等方法对一定分子量的多肽进行分离纯化，并测定对应的分离组分的抗氧化活性；在明确抗氧化肽的序列后可通过分离纯化或合成技术得到大量抗氧化肽；三是采用生物信息学方法对动植物已知序列的蛋白进行分析，预测高活性的多肽片段，并通过化学合成的方法合成，进行活性验证(抗氧化肽的研究现状.)。
[0004]
乳铁蛋白(lactoferrin,lf)是一种由哺乳动物粘膜上皮细胞分泌的非血红素铁
结合糖蛋白(mayeur s,spahis s,pouliot y,et al.lactoferrin,a pleiotropic protein in health and disease[j].antioxidants&redox signaling,2016,24(14):813-836.)，分子量约为80kda，广泛存在于眼泪，唾液，汗液，胃肠液，牛乳和人初乳中，被认为是人和抗感染防御系统的基本要素之一(park j h,park g t,cho i h,et al.an antimicrobial protein,lactoferrin exists in the sweat:proteomic analysis of sweat[j].experimental dermatology,2011,20(4):369-371.&masson p,heremans j f,prignot j.immunohistochemical localization of the iron-binding protein lactoferrin in human bronchial glands[j].experientia,1965,21(10):604-605.)。据报道，lf具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗癌、抗氧化、抗过敏、消炎及免疫调节等生物学功能(张恩鹏.牛乳铁蛋白肽衍生肽设计及其在毕赤酵母中的表达研究[d].江苏大学,2019.&fan f,shi p,liu m,et al.lactoferrin preserves bone homeostasis by regulating the rankl/rank/opg pathway of osteoimmunology[j].food&function,2018,9(5):2653-2660.)。由于lf的好处，常被添加到婴儿配方奶粉、保健品、化妆品、宠物护理补充剂、饮料、发酵乳、口香糖和牙膏等多种产品中，有助于调节铁吸收并保护新生儿胃肠道免受感染(brock j h.lactoferrin in human milk:its role in iron absorption and protection against enteric infection in the newborn infant[j].archives of disease in childhood,1980,55(6):417.)，用于增强机体免疫(wang b,timilsena y p,blanch e,et al.lactoferrin:structure,function,denaturation and digestion[j].critical reviews in food science and nutrition,2019,59(4):580-596.)。同时许多已被证明具有超过整个蛋白的活性，并兼具多种活性功能。例如，lf多肽具有血管紧张素转换酶抑制活性、抗氧化和抗炎活性(ruiz-gim
é
nez p,salom j b,marcos j f,et al.antihypertensive effect of a bovine lactoferrin pepsin hydrolysate:identification of novel active peptides[j].food chemistry,2012,131(1):266-273.&gu y,wu j.bovine lactoferrin-derived ace inhibitory tripeptide lrp also shows antioxidative and anti-inflammatory activities in endothelial cells[j].journal of functional foods,2016,25:375-384.)。虽然研究表明乳铁蛋白的降解产物保持了抗氧化等生物活性，但利用酶解方法制备活性肽工艺复杂、时间长、成本高、产物组成不均，不同批次质量难以控制，难对其作用机理进行深入研究(张强,李伟华.抗氧化肽的研究现状[j].食品与发酵工业,2021,47(2):298-304.)。因此，有必要使用生物信息学分析来补充研究抗氧化肽的传统方法。然而，基于计算机模拟筛选抗氧化肽，尤其来源于乳铁蛋白的抗氧化肽尚未报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明采用生物信息学的方法，基于重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库，借助anoxpepred-1.0预测和筛选具有较高活性抗氧化肽，可用作食品、化妆品或保健品的添加剂。其中，舍弃传统蛋白分离纯化生物活性肽的方法，采用生物信息学方法设计，从而大大节省实验时间成本和金钱成本。针对传统方法对于抗氧化活性肽缺乏有效发现手段，本发明涉及对具有抗氧化的多肽进行高通量筛选的方法简单而有效，具有独特优势。筛选到的本发明的抗氧化肽来源于乳铁蛋白序列，实现来源良好生物兼容性、绿色、安全的目标。
[0006]
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0007]
本发明提供来源于乳铁蛋白的抗氧化肽，氨基酸序列如seq id no：1至99任一所示。
[0008]
优选地，其氨基酸序列如seqid no:1-2、seqid no.8、seqid no.10、seqid no.15、seqid no.17、seqid no:23-26、seqid no.34、seqid no.37、seqid no.40、seqid no.43、seqid no.48、seqid no.50、seqid no:53-57、seqid no.61、seqid no.64-65、seqid no.68、seqid no:71-73、seqid no.75、seqid no.77、seqid no.79、seqid no:85-88、seqid no:92-94、seqid no.96和seqid no:98-99任一所示。
[0009]
更优选地，其氨基酸序列如其氨基酸序列如seqid no.1、seqid no.23、seqid no.24、seqid no.55、seqid no.61、seqid no.65、seqid no.68、seqid no.73、seqid no.79或seqid no.98。进一步优选地，其氨基酸序列如seqid no.24、seqid no.55、seqid no.73任一所示。
[0010]
本发明也提供编码所述的抗氧化肽的核酸、含所述的核酸的表达载体以及含有所述的表达载体的重组细胞。
[0011]
本发明还提供所述的抗氧化肽或其编码核酸在制备抗氧化产品中的应用。
[0012]
优选地，所述产品是指食品、化妆品或保健品，所述抗氧化肽作为活性成分或添加剂使用。
[0013]
本发明通过创新的采用了重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库，实现全序列建立乳铁蛋白肽库，节省了时间和成本，提高了水解产物序列组成的准确度，在生物信息学生物活性肽领域具有独创性。其中通过创新的采用了anoxpepred-1.0服务器预测和筛选具有较高活性乳铁蛋白抗氧化肽，实现了一个高通量筛选乳铁蛋白抗氧化肽的方法，节省了资金和人力，提高了效率，在生物活性肽领域具有独创性。本发明的特点是存在特定的氨基酸序列，其含有半胱氨酸，这些创新肽能很好地清除清除自由基，以提高抗氧化活性，且属于天然抗氧化剂，安全性好。
[0014]
具体地，本发明的提供的创新肽经检测具有优异的抗氧化活性，在本发明测定条件下其dpph自由基清除能力和abts自由基清除能力分别接近或优于谷胱甘肽和肌肽。
具体实施方式
[0015]
结合实施实例，进一步阐述本项发明。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。
[0016]
实施例1基于重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库和快速筛选方法
[0017]
一、乳铁蛋白肽文库的建立
[0018]
(1)在uniprot蛋白质数据库中查询获取乳铁蛋白氨基酸序列；
[0019]
(2)将上述氨基酸序列通过重叠肽库法设计得到1398个长度为11的重叠多肽段，相邻肽段重叠10个氨基酸。
[0020]
二、生物信息学预测抗氧化活性序列
[0021]
(1)将上述1398个肽序列分组，每组50个，一共28组，提交anoxpepred-1.0服务器(anoxpepred-1.0-services-dtu health tech)，多肽长度范围设定为2-30氨基酸，采用肽模式，得到上述预测肽的自由基清除(frs，free radical scavenger)或螯合(chel，
chelation)评分；
[0022]
(2)根据步骤(1)预测的frs评分阈值≥0.45，筛选得到179个肽序列；
[0023]
(3)将步骤(2)所有连续的部分氨基酸序列重叠的x个肽序列连接成一个长度为y个氨基酸残基组成的长肽链，连接的方式为第n条氨基酸序列的c端与第n+x-1条氨基酸序列的非重叠序列相连，得到53个肽序列；
[0024]
(4)将步骤(3)所得肽序列依照步骤(1)提交anoxpepred-1.0服务器，得到预测肽的frs评分，结果如表1所示。
[0025]
表1、53个肽的frs评分
[0026]
[0027][0028]
(5)以步骤(4)得到的新序列seqid no.1、seqid no.2、seqid no.3和seqid no.10为基础，增加n端部分氨基酸残基分别得到序列seqid no.26、seqid no.27、seqid no.28和seqid no.29，依照步骤(1)提交anoxpepred-1.0服务器，得到预测肽的frs评分，结果如表2所示；
[0029]
表2、4个肽的frs评分
[0030]
seqid no.肽序列长度frs评分54cvpnskekyygytgafrcl190.6070255cacssrepyfgysgafkclq200.5878756claklggrptyeeylgteyvta220.5628057adalnldggyiytagkcg180.53777
[0031]
(6)根据步骤(1)预测的chel评分阈值≥0.25，筛选得到97个肽序列；
[0032]
(7)将步骤(5)所得肽序列依照步骤(3)肽链连接方法得到42个肽序列；
[0033]
(8)将步骤(7)所得肽序列依照步骤(1)提交anoxpepred-1.0服务器，得到预测肽的chel评分，结果如表3所示。
[0034]
表3、42个肽的chel评分
[0035][0036][0037]
实施例2抗氧化肽的活性验证
[0038]
一、合成抗氧化肽
[0039]
根据实施例1中预测筛选的乳铁蛋白抗氧化肽序列，由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。
[0040]
二、抗氧化肽的活性验证
[0041]
(1)dpph自由基清除能力
[0042]
相关试剂配制：
[0043]
1)dpph溶液：0.2mm(无水乙醇溶解)。
[0044]
2)多肽溶液：从金斯瑞生物科技股份有限公司订制合成，冻干粉用纯水溶解。
[0045]
实验方案：
[0046]
sample#1
[0047]
分别吸取不同浓度的多肽溶液100μl，加入0.2mm dpph乙醇溶液100μl，摇匀后，在室温，黑暗处放置30min。测定517nm处的吸光值at。同时，测定100μl多肽溶液+100μl乙醇溶液在517nm处的吸光值ar，再测定100μl dpph溶液+100μl乙醇在517nm处的吸光值a0。同一测定设计3个平行。结果如表4和表5所示。
[0048]
dpph自由基清除率(％)＝[1-(as－ab)/ac]
×
100
[0049]ac
：100μl无水乙醇+100μl dpph溶液的吸光值；as：100μl样品溶液+100μl dpph溶液的吸光值；ab：100μl样品溶液+100μl无水乙醇的吸光值。
[0050]
实验结果：
[0051]
dpph自由基是一种紫色的稳定的氮中心自由基，而抗氧化剂能够将dpph自由基还原为黄色的化合物。这种现象出现的原因是dpph自由基能够接受一个电子或者氢原子形成稳定的抗磁性分子。在本研究中，将99种多肽和gsh统一进行dpph自由基清除活性测定，以便多方面评价其抗氧化活性，结果如表4所示。对于99种乳铁蛋白抗氧化肽，当浓度为0.5mg/ml时，它们的dpph自由基清除率为18.69％～94.64％。同样发现，含有cys氨基酸残基的多肽具有相对较高的dpph自由基清除活性，尤其是含有3个cys氨基酸残基的多肽seqid no.55。对于含有cys氨基酸残基的41个多肽seqid no:1-2、seqid no.8、seqid no.10、seqid no.15、seqid no.17、seqid no:23-26、seqid no.34、seqid no.37、seqid no.40、seqid no.43、seqid no.48、seqid no.50、seqid no:53-57、seqid no.61、seqid no:64-65、seqid no.68、seqid no.71-73、seqid no.75、seqid no.77、seqid no.79、seqid no:85-88、seqid no:92-94、seqid no.96和seqid no.98-99，它们的dpph自由基清除活性ic
50
为0.027～0.175mg/ml(见表5)。从此结果看出，除了cys氨基酸残基的数量不仅对dpph自由基清除率具有较高影响，cys氨基酸残基的位置对dpph自由基清除活性也有较大的影响。总体上，在以上41个多肽中，当cys氨基酸残基在肽的n端时候，如含有一个cys氨基酸残的seqid no.25、seqid no.48、seqid no.56、seqid no.68和seqid no.86，以及含有两个cys的seqid no.2、seqid no.54、seqid no.61和seqid no.79具有相对高的dpph自由基清除活性。从结构上看，它们的强抗氧化活性可能与肽链n端的cys残基有关，cys为含硫氨基酸，侧链中的巯基(-sh)为高反应性基团，显弱酸性(pk＝8.4)，易失去质子，因此cys易与dpph中的电子偶合。与此不同的是，cys氨基酸残基在c端末端以及处于序列中间的多肽dpph自由基清除活性相对较低。另外，gsh的dpph自由基清除活性为0.032mg/ml。显然，就dpph自由基清除活性而言，gsh具有非常高的活性。seqid no.1、seqid no.2、seqid no.48、
seqid no.55、seqid no.61、seqid no.68和seqid no.79的dpph自由基清除活性与gsh的活性相当，seqid no.2、seqid no.48、seqid no.55和seqid no.86的活性甚至高于gsh，且没有统计学显著性差异。可以清楚看出，以上多肽和gsh都有共同的cys氨基酸残基，而由于cys氨基酸残基巯基的存在，可与自由基直接进行反应的能力(jiang h,tong t,sun j,et al.purification and characterization of antioxidative peptides from round scad(decapterusmaruadsi)muscle protein hydrolysate[j].food chemistry,2014,154:158-163.)，从而该类多肽具备很强的dpph自由基清除活性。此外，对于不含cys氨基酸残基的多肽，如剩下的58种肽，则表现出低的dpph自由基清除活性。因此，不仅氨基酸残基组成，如cys氨基酸残基，而且活性氨基酸残基所处的位置，如c端或n端，均对多肽的dpph自由基清除活性有较大的影响。
[0052]
表4、0.5mg/ml的多肽对dpph自由基的清除能力
[0053]
[0054]
[0055][0056]
表5、含有cys氨基酸残基的多肽和谷胱甘肽对dpph自由基清除能力的ic
50
值
[0057]
样品 ic
50
值(mg/ml)样品ic
50
值(mg/ml)谷胱甘肽0.032seqid no.570.098seqid no.10.039seqid no.610.039seqid no.20.029seqid no.640.145seqid no.80.041seqid no.650.146seqid no.100.147seqid no.680.040seqid no.150.135seqid no.710.156seqid no.170.152seqid no.720.150seqid no.230.088seqid no.730.124seqid no.240.062seqid no.750.175seqid no.250.046seqid no.770.091seqid no.260.090seqid no.790.040seqid no.340.088seqid no.850.092seqid no.370.092seqid no.860.029seqid no.400.087seqid no.870.078seqid no.430.090seqid no.880.080seqid no.480.030seqid no.920.079seqid no.500.080seqid no.930.101seqid no.530.094seqid no.940.110seqid no.540.044seqid no.960.121seqid no.550.027seqid no.980.041seqid no.560.096seqid no.990.087
[0058]
(2)abts自由基清除能力
[0059]
相关试剂配制：
[0060]
1)abts溶液：7mm，称取19.2mg abts，加入5ml纯水溶解。
[0061]
2)过硫酸钾溶液：140mm，称取189mg过硫酸钾，加入5ml纯水溶解。
[0062]
3)abts储备液：5ml abts溶液和5ml过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜16h，形成abts储备液。
[0063]
4)多肽溶液：从金斯瑞生物科技股份有限公司订制合成，冻干粉用纯水溶解。
[0064]
实验方案：
[0065]
sample#1
[0066]
1)用纯水将上述abts储备液稀释成工作液，要求其在734nm波长的吸光度为0.7
±
0.02。
[0067]
2)分别吸取不同浓度的多肽溶液100μl，加入abts工作液100μl，震荡1～2min，于37℃下放置10min后，在734nm处测定吸光值as，以100μl abts工作液+100μl纯水)作空白吸光度ac。以100μl多肽溶液+100μl纯水混合均匀吸光度为ab。同一测定设计3个平行。结果如表6和表7所示。
[0068]
abts自由基清除率(％)＝[1-(a
s-ab)/ac]
×
100
[0069]as
：100μl样品溶液加入100μl abts溶液的吸光度；ab：100μl样品溶液加入100μl蒸馏水的吸光度；ac：100μl abts溶液加入100μl蒸馏水的吸光度。
[0070]
实验结果：
[0071]
在反应体系中，abts会被氧化生成abts自由基，它是一种稳定并可以溶于水的自由基，呈蓝绿色，在734nm处有最大吸光度值。abts自由基与抗氧化剂反应可以使前者的特征色褪去，进而使吸光度值降低。在同一条件下，生物样品的抗氧化活性强弱和反应溶液吸光度值下降程度成正比。不同序列乳铁蛋白多肽的abts自由基清除率如表6所示，在浓度为0.5mg/ml时，它们的abts自由基清除率为8.66％～99.96％。同样发现，含有cys氨基酸残基的多肽具有相对较高的abts自由基清除活性，对于含有cys氨基酸残基的41个多肽，它们的abts自由基清除率为80.99％～99.96％。其中它们的ic
50
为0.020～0.067mg/ml。同时，阳性对照肌肽的abts自由基清除活性为1.244mg/ml。显然，以上含有cys氨基酸残基的41种多肽的abts自由基清除活性ic
50
值均显著低于肌肽。研究表明，abts自由基与氨基酸的反应速率主要是由氨基酸侧链是否有不稳定的氢原子决定的，并且与溶液的ph和样品的浓度有关。在同一反应条件下，得到几种氨基酸清除自由基的活性大小排序为：cys》trp》tyr》his(aliaga c,lissi e a.reactions of the radical cation derived from 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(abts
·
+)with amino acids.kinetics and mechanism[j].canadian journal of chemistry,2000,78(8):1052-1059.)。和上述研究结论一致，abts自由基清除能力较强的乳铁蛋白多肽中，都含有易在反应中失去氢原子的cys氨基酸。由此可见，乳铁蛋白多肽的abts自由基清除活性和其氨基酸残基的种类有关，不同种类氨基酸残基和自由基反应的活性不同。
[0072]
表6、0.5mg/ml的多肽对abts自由基的清除能力
[0073]
[0074][0075]
表7、含有cys氨基酸残基的多肽和肌肽对abts自由基清除能力的ic
50
值
[0076][0077]

技术特征：
1.来源于乳铁蛋白的抗氧化肽，其特征在于，其氨基酸序列如seqid no：1至99任一所示。2.如权利要求1所述的抗氧化肽，其特征在于，其氨基酸序列如seqid no:1-2、seqid no.8、seqid no.10、seqid no.15、seqid no.17、seqid no:23-26、seqid no.34、seqid no.37、seqid no.40、seqid no.43、seqid no.48、seqid no.50、seqid no:53-57、seqid no.61、seqid no.64-65、seqid no.68、seqid no:71-73、seqid no.75、seqid no.77、seqid no.79、seqid no:85-88、seqid no:92-94、seqid no.96和seqid no:98-99任一所示。3.如权利要求2所述的抗氧化肽，其特征在于，其氨基酸序列如seqid no.1、seqid no.23、seqid no.24、seqid no.55、seqid no.61 、seqid no.65、seqid no.68、seqid no.73、seqid no.79或seqid no.98。4.如权利要求3所述的抗氧化肽，其特征在于，其氨基酸序列如seqid no.24、seqid no.55、seqid no.73任一所示。5.编码如权利要求1至4任一项所述的抗氧化肽的核酸。6.含如权利要求5所述的核酸的表达载体。7.含有如权利要求6所述的表达载体的重组细胞。8.如权利要求1至4任一项所述的抗氧化肽或其编码核酸在制备抗氧化产品中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品是指食品、化妆品或保健品。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，，所述抗氧化肽作为活性成分或添加剂使用。

技术总结
本发明涉及本发明属于生物医药领域，具体涉及来源于乳铁蛋白的抗氧化肽及其应用。所述来源于乳铁蛋白的抗氧化肽，其氨基酸序列如SEQID NO：1至99任一所示，其具有抗氧作用，可以用于制备抗氧化产品中的应用，例如用于食品、化妆品或保健品中作为活性成分。化妆品或保健品中作为活性成分。


技术研发人员：陈冰冰 李华珍 章家泉
受保护的技术使用者：百葵锐（深圳）生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/9/25