一种与哮喘相关的生物标志物及其应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种与哮喘相关的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.哮喘是一种慢性呼吸道炎症性疾病，全球有超过3亿人受到影响。哮喘症状是由气道炎症引起的，它引发了粘液的产生、气道壁重塑和气道高反应性。高达10％的成人和2.5％的儿童哮喘患者尽管接受了大剂量吸入性糖皮质激素、长效β2受体激动剂和长效毒蕈碱拮抗剂的充分治疗，仍有持续的症状或频繁的恶化。严重的哮喘伴随着反复发作的过敏原暴露和失调的粘膜表面炎症，可导致胶原蛋白沉积、肌成纤维细胞数量增加、血管生成，最终导致上皮下纤维化。特发性肺纤维化(ipf)患者的预后很差，5年生存率不到40％。因此，开发能够准确预测治疗反应的新生物标志物(预测性生物标志物)和治疗反应的早期标志物(监测性生物标志物)对重症哮喘的治疗非常重要，这些标志物是否能够早期识别预后较差的ipf患者。
3.发明cn110396537a提出了用于哮喘或相关疾病的生物标志物，包括选自下列中的至少一种：粪便拟杆菌(bacterodiesstercoris)和/或其类似物，迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)和/或其类似物和华德萨特菌(sutterellawadsworthensis)和/或其类似物。该发明提出了用于早期诊断哮喘或相关疾病的生物标志物、哮喘或相关疾病的诊断以及预测患病风险的方法，可以解决现有哮喘诊断方法不能做到早期预警、不能预测哮喘发病等缺点。
4.发明cn108676872b公开了一种与哮喘相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物为rp11-461a8.4。该发明通过高通量测序首次发现了rp11-461a8.4在哮喘患者中呈现差异表达，并通过qpcr进一步证实rp11-461a8.4可以有效的区分难治性哮喘、普通哮喘与正常人，提示其作为生物标志物应用于哮喘临床诊断。
5.发明cn 115521369 a公开了一种生物标志物nrp1及其在诊断、预防、治疗肺纤维化(包括但不限于特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，ipf)和因感染、炎症、肿瘤等引起的肺纤维化)和/或哮喘中的应用，其用于诊断和/或治疗肺纤维化和/或哮喘，和/或预测肺纤维化和/或哮喘的严重程度。该发明还提出nrp1拮抗剂、抑制剂、调节剂、抗体、药物组合物及其应用。该发明还提出含有生物标志物nrp1的检测试剂/试剂盒。该发明还提出il5crenrp1f/f和id2cre-ert2nrp1f/f小鼠肺炎症性疾病模型及其应用。该发明在肺纤维化和/或哮喘治疗领域具有广泛的应用前景。
6.与上述发明不同的是，本发明提出的生物标志物是基于olink蛋白质组学在血浆样品中检测的蛋白质，基于本技术检测的蛋白质表现出良好的重复性和稳定性，用于探索新的哮喘生物标志物促进了哮喘发病机制的深入了解和指导哮喘治疗。基于本发明提出的生物标志物在蛋白和rna水平均能够准确预测重症哮喘的治疗反应，且这些标志物在rna水平能够早期识别预后较差的ipf患者。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种与哮喘相关的生物标志物及其应用，基于olink蛋白质组学检测血浆样品中的蛋白质开发了一种能够准确预测重度哮喘治疗反应的预测性生物标志物和治疗反应的检测性标志物，并且识别早期识别预后较差的特发性肺纤维化(ipf)患者。
8.第一方面，本发明提供一种与哮喘相关的蛋白质组生物标志物，所述生物标志物包括il18r1、l18、tnfsf1、osm和s100a12。
9.第二方面，本发明中生物标志物在判断诊断对象是否患有哮喘或相关疾病，或者预测对象是否患有哮喘或相关疾病的风险方面，或者监测诊断对象是否患有严重哮喘或相关疾病方面，或制备预测肺纤维化和/或哮喘发生和/或严重程度的试剂方面，或制备肺纤维化和/或哮喘预后评价试剂方面的应用。
10.第三方面，本发明提供一种筛选判断诊断对象是否患有哮喘或相关疾病，或者预测对象是否患有哮喘或相关疾病的风险方面，或者监测诊断对象是否患有严重哮喘或相关疾病方面，或制备预测肺纤维化和/或哮喘发生和/或严重程度的试剂方面，或制备肺纤维化和/或哮喘预后评价试剂方面药物的方法，步骤包括：
11.s1、对哮喘患者和无哮喘的受试者进行olink多重阵列分析；
12.s2、对上述方法获得的蛋白质标志物使用差异分析软件分析哮喘患者和对照组差异表达的蛋白；
13.s3、使用公共数据库中哮喘患者单细胞rna测序数据和rna测序数据分析与炎症相关的生物标志物；
14.s4、取s2和s3共同发现的生物标志物作为最终哮喘标志物。
15.进一步的，所述s3包括如下步骤：
16.1)细胞过滤；
17.2)高变异基因识别；
18.3)基因集在特定细胞亚群的富集分析。
19.进一步的，所述olink多重阵列分析的目标为血清样本。
20.第四方面，本发明提供一种试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明公开了使用olink分析法测量哮喘血清中的92种炎症相关蛋白。gene expression omnibus(geo)数据库下载单细胞rna测序数据(scrna-seq)和转录组数据采用person相关系数、功能富集分析和生存分析(kaplan-meier)等方法，确定il18r1及相关基因在哮喘和ipf中的作用。
23.此外，血清中il18r1相关分子对哮喘的诊断效力很高，aucs(area under the curve:roc曲线下面积)在0.839-0.921之间。
24.il18r1在血清中、未受控制或严重哮喘的诱导痰中上调，il18r1及其显著共表达的基因(l18、tnfsf1、osm和s100a12)对哮喘有很高的诊断价值。
25.高表达的il18r1、tnfsf1、osm和s100a12的患者与低表达的患者相比，生存时间明显缩短。
附图说明
26.图1是哮喘组和正常组之间所有差异表达的炎症相关生物标志物；
27.图2是il18r1在不同类型的哮喘中的表达情况；
28.图3是血清中il18r1相关分子对哮喘的诊断效力
29.图4是il18r1、tnfsf1、osm和s100a12对生存的影响
具体实施方式
30.下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.本发明中筛选判断诊断对象是否患有哮喘或相关疾病，或者预测对象是否患有哮喘或相关疾病的风险方面，或者监测诊断对象是否患有严重哮喘或相关疾病方面，或制备预测肺纤维化和/或哮喘发生和/或严重程度的试剂方面，或制备肺纤维化和/或哮喘预后评价试剂方面药物的方法，步骤包括：
32.s1、对哮喘患者和无哮喘的受试者进行olink多重阵列分析；
33.s2、对上述获得的蛋白质标志物使用差异分析软件分析哮喘患者和对照组差异表达的蛋白；
34.s3、使用哮喘患者单细胞测序数据分析与炎症相关的生物标志物。具体步骤如下描述：
35.1)细胞过滤；
36.2)高变异基因识别；
37.3)基因集在特定细胞亚群的富集分析；
38.s4、取2)和3)共同发现的生物标志物作为最终哮喘标志物。
39.用更为详细的实施例进行解释本发明的内容如下：
40.实施例1：哮喘标志物的筛选和鉴定
41.使用olink多重阵列分析哮喘病人的炎症相关生物标志物，具体包括以下步骤：
42.s1、招募志愿者，包含哮喘患者24例和无哮喘的受试者29例，其中无哮喘的受试者作为对照组；
43.s2、每位志愿者采集约2ml血液，然后，在1500rpm下离心10分钟提取血清；并在-80℃冰箱中冷冻，直到检测；
44.s3、对每位志愿者进行olink蛋白质组分析：血清样本使用olink蛋白质组分析，这使得92种炎症相关的蛋白质可以在一次测试中得到分析。每个炎症相关蛋白被抗体识别，并与其特定的互补寡核苷酸条码相连接，随后使用pcr仪器进行检测和定量。最终的检测结果以归一化的蛋白表达值表示，并进行对数转换；
45.s4、对olink数据中差异表达的蛋白质进行功能富集分析：
46.使用r中的limma软件包对olink数据的差异表达蛋白进行分析，筛选阈值为p《0.0；使用基因本体论(go)和京都基因和基因组百科全书(kegg)进行对差异蛋白进行功能富集分析；计算了差异表达蛋白的spearman(斯皮尔曼相关性系数)相关性。
47.s5、使用哮喘患者单细胞测序数据分析与炎症相关的生物标志物。具体步骤如下
描述：
48.1)细胞过滤：使用r软件包“seurat”筛选出基因数《200个、特征rna数》2500个或线粒体基因数》20％的细胞；
49.2)高变异基因识别：使用r包中的lognormalize函数对基因表达进行归一化；利用pca(主成分分析)分析识别显著主成分；使用r包中findclusters函数将细胞划分为26个主要的不同簇；分辨率为0.25；
50.3)基因集在特定细胞亚群的富集分析：基于集群特定的细胞标记，其中9个集群被识别出来。使用irgsea(https://github.com/chuiqin/irgsea)评估基因集是否在特定细胞亚群中富集；使用cellchat
51.(https://htmlpreview.github.io/？https://github.com/sqjin/cellchat/blob/master/tutori al/cellchat-vignette.html)评估细胞亚群之间的细胞交流。
52.s6、取2)和3)共同发现的生物标志物il18、il18r1、tnfsf1、osm和s100a12作为最终哮喘标志物。
53.实施例2
54.比较哮喘患者和无哮喘对照组中血清蛋白il18、il18r1、tnfsf1、osm和s100a12，如图1所示：il18、il18r1、tnfsf1、osm和s100a12在哮喘组中显著上调。
55.实施例3：il18r1在不同类型的哮喘患者中的表达分析
56.(1)下载并分析了自诱导痰液样本4个rna表达数据集(gse137268，gse41863，gse45111和gse76262)及其临床特征。
57.(2)分析不同类型的哮喘患者和对照组之间il18r1的差异性表达性。
58.(3)如图2-3所示，与健康对照组相比，哮喘患者诱导痰液中il18r1的mrna水平明显上调(图2)。此外，il18r1的表达在未受控制的哮喘或中度哮喘中略有增加(图2)，而在重度哮喘中与健康对照组相比il18r1的表达则明显增加(图2)。本发明中还比较了这5种生物标志物和il18r1在哮喘病人血清中的诊断价值，如图3显示，il18r1、il18、tnfsf1、osm和s100a12在哮喘患者中明显升高，aucs范围为0.839-0.921。
59.实施例4：il18r1作为ipf中特征性哮喘分子对预后影响
60.(1)下载分析来自哮喘患者的支气管肺泡灌洗液rna表达数据集(gse70866)的il18r1、tnfsf1、osm和s100a12对哮喘患者生存率的影响；
61.(2)根据il18r1、tnfsf1、osm和s100a12基因表达的最佳截止值将哮喘患者分为高表达患者和低表达患者；
62.(3)使用r包“survival”比较高表达患者和低表达患者组间的生存率；
63.(4)如图4所示，il18r1、tnfsf1、osm和s100a12高表达哮喘患者的生存时间明显短于低表达患者。
64.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

技术特征：
1.一种与哮喘相关的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括il18r1、l18、tnfsf1、osm和s100a12。2.如权利要求1所述的生物标志物在判断诊断对象是否患有哮喘或相关疾病，或者预测对象是否患有哮喘或相关疾病的风险方面，或者监测诊断对象是否患有严重哮喘或相关疾病方面，或制备预测肺纤维化和/或哮喘发生和/或严重程度的试剂方面，或制备肺纤维化和/或哮喘预后评价试剂方面的应用。3.一种筛选判断诊断对象是否患有哮喘或相关疾病，或者预测对象是否患有哮喘或相关疾病的风险方面，或者监测诊断对象是否患有严重哮喘或相关疾病方面，或制备预测肺纤维化和/或哮喘发生和/或严重程度的试剂方面，或制备肺纤维化和/或哮喘预后评价试剂方面药物的方法，其特征在于，步骤包括：s1、对哮喘患者和无哮喘的受试者进行olink多重阵列分析；s2、对上述方法获得的蛋白质标志物使用差异分析软件分析哮喘患者和对照组差异表达的蛋白；s3、使用公共数据库中哮喘患者单细胞rna测序数据和rna测序数据分析与炎症相关的生物标志物；s4、取s2和s3共同发现的生物标志物作为最终哮喘标志物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述s3包括如下步骤：1)细胞过滤；2)高变异基因识别；3)基因集在特定细胞亚群的富集分析。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述olink多重阵列分析的目标为血清样本。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞过滤方法包括：使用r软件包“seurat”筛选出基因数<200个、特征rna数>2500个或线粒体基因数>20％的细胞。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高变异基因识别步骤包括：使用r包中的lognormalize函数对基因表达进行归一化；利用pca分析识别显著主成分；使用r包中findclusters函数将细胞划分为26个主要的不同簇；分辨率为0.25。8.一种试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。

技术总结
本发明一种与哮喘相关的生物标志物，所述生物标志物包括IL18R1、L18、TNFSF1、OSM和S100A12。基于本发明中高表达的IL18R1、TNFSF1、OSM和S100A12的患者与较短的生存时间和较差的肺功能，包括FVC％预测值、Dlco％预测值和FEV1％预测值显著相关，因此IL18R1相关分子可以作为未受控制或严重哮喘监测的生物标志物和IPF的预后标志物。该生物标志物应用于判断诊断对象是否患有哮喘或相关疾病，或者预测对象是否患有哮喘或相关疾病的风险方面，或者监测诊断对象是否患有严重哮喘或相关疾病方面，或制备预测肺纤维化和/或哮喘发生和/或严重程度的试剂方面，或制备肺纤维化和/或哮喘预后评价试剂方面。喘预后评价试剂方面。喘预后评价试剂方面。


技术研发人员：梁玉婷 乔龙威 张胜 邱骏
受保护的技术使用者：苏州大学附属第一医院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/25