景洪哥纳香叶提取物及其在制药中的用途

1.本发明属化学制药
技术领域：
：，涉及景洪哥纳香叶提取物及其用途，尤其涉及景洪哥纳香叶提取物在制备抑制耐药质粒接合转移药物中的用途。
背景技术：
：：2.现有技术公开了细菌耐药质粒的传播及其结合抑制有关信息，抗菌素耐药性近年来已经成为阻碍细菌感染治疗的全球性问题，而细菌耐药上升和全球传播的一个关键因素是细菌质粒转移导致的耐药基因水平转移(lopatkinetal,2017)。3.资料公开了质粒是小型共价闭合环状双链dna分子，具有独立复制的能力，是细菌生存非必需的一种遗传因子，细菌的抗性、代谢能力和致病性等表型特征常由质粒控制。细菌耐药质粒可经接合(conjugation)方式从一个细菌传递到另一个细菌，因此抑制质粒接合转移是抑制耐药性在细胞之间和生命体之间扩散，是对抗细菌耐药性的一个重要途径。4.相关的研究公开了寻找质粒消除化合物的工作始于上20世纪60-70年代(hooperetal,1984)。多种类型物质具有质粒消除效果，包括吖啶橙、溴化乙锭、十二烷基磺酸钠、化学试剂如洗涤剂，和精神类药物氯丙嗪(molnar,2014)，干扰超螺旋扰乱质粒复制的抗生素如氨基香豆素，喹诺酮，利福平和植物来源的化合物。5.但是这些物质因为毒性或者不必要的副作用，没有被临床应用，接下来的研究兴趣和出版物随之减少。然而抗菌素耐药性特别是质粒介导的耐药性的增加，结合正在开发的相应的治疗感染新药开发不断减少，对质粒消除的研究又重新兴起(buckneretal,2018)。质粒消除策略涉及的方法从化学试剂、合成药物、天然产物，噬菌体疗法到基因编辑(crispr/cas)。新近研究表明，抑制质粒接合转移是消除细菌耐药质粒的有效方法(lopatkinetal,2017)。6.中国国内学者从上世纪八十年代开始用黄莲素消除细菌的耐药质粒，此后陆续有相关研究报道，但综合看来中药消除耐药细菌质粒存在问题：1)质粒清消除率低，多为10－20％。2)有报道中药对不动杆菌质粒具有50－61％的高消除率，但是复杂的多成分活性对药理作用机制的解释有待于进一步研究。3)目前的中药消除剂往往是根据经验――依照中药抗菌试验的结果来选择。所以多数中药消除剂为抗菌能力强的清热解毒或清热燥湿类中药。但由于抗菌与质粒消除的机理不相同，抗菌能力强的中药其对细菌的质粒消除率不一定高。因此，国内外亟待发现有效低毒的耐药细菌质粒消除剂，减少抗菌素耐药基因在人和动物中蔓延(buckneretal,2018)。7.肺炎克雷伯菌株hs11286，是一个st11型产kpc-酶的临床分离mdr菌株(alyshaetal,2016)具有六种天然质粒，含有多种耐药基因与结合初始基因-tra(表1hs中6种质粒信息),在本发明中作为供体菌实验；受体菌选择对nan3耐药菌株e.colij53。8.表1.肺炎克雷伯菌株hs11286中六种质粒信息[0009][0010]景洪哥纳香(goniothalamuscheliensishu)和大花哥纳香(g,griffithii)为番荔枝科(annonaceae)哥纳香属(goniothalamus)植物。在东南亚及我国南方省区常用作民间草药,用于镇痛和杀虫(吴征镒，1988)。[0011]基于现有技术的现状与基础，本发明拟提供景洪哥纳香叶提取物及其新的药用用途，尤其涉及景洪哥纳香叶提取物在制备抑制耐药质粒接合转移药物中的用途。[0012]与本发明相关的参考文献有，[0013]吴征镒.新华本草纲要[m].上海:上海科学技术出版社，1988:71.[0014]alyshag,elliott,etal.completegenomesequenceofklebsiellapneumoniaesubsp.similipneumoniaestrainatcc700603.genomeannouncements,2016,4(3):e000438-16.[0015]bucknermmc,ciusaml,piddockljv.2018.strategiestocombatantimicrobialresistance:anti-plasmidandplasmidcuring,femsmicrobiologyreviews42(6):781–804.[0016]hooperdc,wolfsonjs,mchughgl,swartzmd,tungc,swartzmn.1984.eliminationofplasmidpmg110fromescherichiacolibynovobiocinandotherinhibitorsofdnagyrase.antimicrobagentschemother.25:586-90.[0017]lopatkinaj,meredithhr,srimanijketal.persistenceandreversalofplasmid-mediatedantibioticresistance.natcommun2017；8:1689.[0018]molnarj,mandiy,splengerg,amarall,haszoni,turis,etal.2014.synergismbetweenantiplasmidpromethazineandantibioticsinvitroandinvivo.molbiol.4:1-6.。技术实现要素：[0019]本发明的目的在于，基于现有技术的现状与基础，提供景洪哥纳香叶提取物及其新的药用用途，尤其涉及景洪哥纳香叶提取物在制备抑制耐药质粒接合转移药物中的用途。[0020]本发明通过对植物的筛选结果显示，景洪哥纳香叶提取物含有抗细菌耐药质粒结合的成分，在实验中表现为降低肺炎克雷伯菌的耐药性，所述景洪哥纳香叶提取物物具有抗细菌耐药质粒结合的作用。[0021]本发明经试验证实，景洪哥纳香叶和茎提取物对供体菌和受体菌的生长均没有显著的抑制作用；景洪哥纳香叶提取物gcl在2.5mg/ml浓度下能够降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子的数目。所述景洪哥纳香叶提取物通过降低供体菌的结合子数，降低耐药菌的总转移率，与空白对照相比，降低接近一个数量级，显示较强的耐药质粒结合抑制作用。所述的景洪哥纳香叶和茎提取物可用于制备降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合的药物，进一步抑制质粒接合转移，消除细菌耐药质粒。[0022]本发明的洪哥纳香叶和茎提取物通过下述方法制备，[0023]1.哥纳香植物抗耐药质粒结合组分的制备[0024]称取采集到的番荔枝科哥纳香属植物景洪哥纳香，大花哥纳香的茎和叶，晾干，粉碎，加入100ml95％乙醇室温下浸泡，提取3次，合并提取液，在45摄氏度下减压蒸馏得浸膏gcl,gcb,ggl和ggb。样品溶解于dmso后用培养基稀释，终浓度为2.5mg/ml。[0025]2.抗耐药质粒结合实验[0026]2.1.实验菌株和实验材料[0027]肺炎克雷伯菌株hs11286，以下简称hs，对多种抗生素不敏感，实验中作为耐药质粒供体菌；大肠杆菌株j53，对nan3不敏感，实验中作为耐药质粒受体菌。[0028]lb培养基：20ml；15mlep*10；ni(100μg/ml叠氮化钠nan3+1μg/ml亚胺培南ipm),2块；la板，4块；1μg/mlipmla板，4块；100μg/mlkan卡那霉素la板，4块；100μg/mlnan3la板，4块；[0029]3.实验方法[0030]3.1细菌培养[0031]hs于含有ipm的lb(两个重复)中振摇过夜；j53在含有nan3的培养基中振摇过夜(两个重复)；[0032]分别取过夜生长的菌液加入含ipm与nan3lb培养基中振摇6小时(三个重复)，离心去上清，三组重复合并为一管，加入适量新lb培养基吹打混匀。[0033]3.2接合培养[0034]各取hs，j53混匀为混合菌液备用；hs，j53分别加入含样品的培养基中单独培养，观察样品对供受体菌的影响；37℃，培养24h。[0035]3.3供受体菌计数[0036]各吸取50μl供受体菌，等10倍稀释，培养过夜。[0037]3.4计数[0038](1)transconjugants计数[0039]实验组6组(四个重复)，除transconjugants(接合转移菌)外，donors(供体菌)与recipients(受体菌)均不可生长。[0040](2)donors计数[0041]实验组6组(四个重复)，除donors(供体菌)外，recipients(受体菌)与transconjugants(接合转移菌)均不可生长。[0042](3)recipients+transconjugants计数[0043]实验组6组(两个重复)，recipients(受体菌)与transconjugants(接合转移菌)均可生长，donors(供体菌)不可生长。[0044](4)样品对j53生长的影响[0045]实验组6组(两个重复)，取稀释倍数的菌液涂于130cm的不含抗生素的la板；[0046](5)样品对hs生长的影响[0047]实验组6组(三个重复)，取稀释倍数菌液涂于130cmipm(5μg/mlipm)板。[0048]以供体细胞数计算，接合转移率(d转移率)＝transconjugants数/donors数[0049]以受体细胞数计算，接合转移率(r转移率)＝transconjugants数/recipients数[0050]以总细胞计数接合转移率(a转移率)＝transconjugants数/(allcells)[0051]4.实验结果[0052]4.1实验初始菌浓度[0053]对供受体菌在620nm下对od进行测量以及细胞计数，结合实验使用的hsod值为1.319，平均菌浓度为9e+10cfu/ml，结合实验使用的j53od值为1.307，平均菌浓度为7e+10cfu/ml(表2)。[0054]根据表3至表8数据，得到图1-4。[0055]与空白对照相比，哥纳香叶和茎提取物对供体菌和受体菌的生长均没有显著的抑制作用。[0056]景洪哥纳香叶和茎提取物gcl和gcb在2.5mg/ml浓度下能够降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子的转移率(表4-6及图1)。[0057]景洪哥纳香叶提取物gcl在2.5mg/ml浓度下能够降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子的数目(表3及图1)。[0058]与空白对照的1.4×10-5转移率相比，景洪哥纳香叶提取物gcl在2.5mg/ml浓度作用下，通过降低供体菌的结合子数，降低了肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子供体转移率至5.8×10-6，从而降低了耐药菌的总转移率至5.8×10-6，与空白对照的1.4×10-5相比，降低接近一个数量级，显示较强的耐药质粒结合抑制作用(表6及图2)。附图说明[0059]图1.景洪哥纳香与大花哥纳香不同部位对接合子数的影响。[0060]图2.景洪哥纳香与大花哥纳香不同部位对转移率的影响。[0061]图3.景洪哥纳香与大花哥纳香不同部位对细胞数的影响。[0062]图4.景洪哥纳香与大花哥纳香不同部位分别对供体菌与受体菌的影响。具体实施方式[0063]实施例1哥纳香植物抗耐药质粒结合组分的制备[0064]称取采集到的番荔枝科哥纳香属植物景洪哥纳香和大花哥纳香的茎和叶，晾干，粉碎，加入100ml95％乙醇室温下浸泡，提取3次，合并提取液，在45摄氏度下减压蒸馏得浸膏gcl,gcb,ggl和ggb。样品溶解于dmso后用培养基稀释，终浓度为2.5mg/ml。[0065]实施例2抗耐药质粒结合实验[0066]1.实验菌株和实验材料[0067]肺炎克雷伯菌株hs11286，以下简称hs，对多种抗生素不敏感，实验中作为耐药质粒供体菌；大肠杆菌株j53，对nan3不敏感，实验中作为耐药质粒受体菌。[0068]培养基lb：20ml；15mlep*10；ni(100μg/mlnan3+1μg/mlipm),2块；la板，4块；1μg/mlipmla板，4块；100μg/mlkanla板，4块；100μg/mlnan3la板，4块。[0069]2.实验方法[0070]2.1细菌培养[0071]hs于2.5ml含有2μg/mlipm的lb(两个重复)中振摇过夜；j53在含有100μg/mlnan3的培养基中振摇过夜(两个重复)；[0072]分别取25μl过夜生长的菌液加入2.5ml新lb培养基中振摇6h(4μg/mlipm与100μg/mlnan3，三个重复)，离心去上清，三组重复合并为一管，加入适量(3.0ml)新lb培养基吹打混匀。[0073]2.2接合培养[0074]各取1.8mlhs，j53混匀为混合菌液备用，在实验组加入混合菌液100μl；[0075]hs，j53分别加入含样品的培养基中单独培养，观察样品对供受体菌的影响；37℃，培养24h。[0076]2.3供受体菌计数[0077]各吸取50μl供受体菌，等10倍稀释，取稀释倍数为105，106，107，108，109，1010的菌液10μl点涂于不含抗生素的la板37℃，培养过夜。[0078]2.4计数[0079](1)transconjugants计数[0080]实验组6组(四个重复)，50μl等10倍稀释，取稀释倍数为101，102，103，104的菌液10μl点涂于130cm的ni(100μg/mlnan3+5μg/mlipm)板，除transconjugants(接合转移菌)外，donors(供体菌)与recipients(受体菌)均不可生长。[0081](2)donors计数[0082]实验组6组(四个重复)，50μl等10倍稀释，取稀释倍数为105，106，107，108，109，1010，1011，1012的菌液10μl点涂于130cm的100μg/mlkanla板，除donors(供体菌)外，recipients(受体菌)与transconjugants(接合转移菌)均不可生长。[0083](3)recipients+transconjugants计数[0084]实验组6组(两个重复)，50μl等10倍稀释，取稀释倍数为105，106，107，108，109，1010，1011，1012的菌液10μl点涂于130cm的100μg/mlnan3，recipients(受体菌)与transconjugants(接合转移菌)均可生长，donors(供体菌)不可生长。[0085](4)样品对j53生长的影响[0086]实验组6组(两个重复)，50μl等10倍稀释等10倍稀释，取稀释倍数为105，106，107，108，109，1010，1011，1012的菌液10μl点涂于130cm的不含抗生素的la板；[0087](5)样品对hs生长的影响[0088]实验组6组(三个重复)，50μl等10倍稀释等10倍稀释，取稀释倍数为105，106，107，108，109，1010，1011，1012的菌液10μl点涂于130cmipm(5μg/mlipm)板。[0089]以供体细胞数计算，接合转移率(d转移率)＝transconjugants数/donors数[0090]以受体细胞数计算，接合转移率(r转移率)＝transconjugants数/recipients数[0091]以总细胞计数接合转移率(a转移率)＝transconjugants数/(allcells)[0092]3.实验结果[0093]3.1实验初始菌浓度[0094]对供受体菌在620nm下对od进行测量以及细胞计数，结合实验使用的hsod值为1.319，平均菌浓度为9e+10cfu/ml，结合实验使用的j53od值为1.307，平均菌浓度为7e+10cfu/ml(表2)。[0095]表2.hs/j53计数(la板，单位为cfu/ml)[0096][0097][0098]3.2transconjugants计数[0099]对实验组培养24h后的混合菌液进行计数，检测其中能在ni(100μg/mlnan3+5μg/mlipm)板(理论上除transconjugants外，recipients与donors均不可生长)生长的菌并计数(table3),其中仅gcl相对于空白对照能降低结合子数；[0100]表3.transconjugants计数(ni板，单位为cfu/ml)[0101][0102]由表3可知样品对转移率有影响。[0103]3.3donors+transconjugants计数[0104]对实验组培养24h后的混合菌液进行计数，检测其中能在kan(100μg/mlkan)板(理论上仅donors可以生长，但transconjugants与recipients不可生长)生长的菌并计数(表4)，从d转移率来看，gcl可能通过减少供体菌数降低结合子数。[0105]表4.donors计数(100μg/mlkan，单位为cfu/ml)以及d转移率[0106][0107]3.4recipients+transconjugants计数[0108]对实验组培养24h后的混合菌液进行计数，检测其中能在nan3(100μg/mlnan3)板(理论上transconjugants与recipients可以生长，但仅donor不可生长，扣除表3中transconjugants数目即可得recipients数)生长的菌并计数(表5)，由表可知，样品对受体菌生长活性有一定的影响；[0109]表5.recipients+transconjugants计数(100μg/mlnan3，单位为cfu/ml)[0110][0111]3.5allcells[0112]对实验组培养24h后的混合菌液进行计数，检测其中在lb琼脂培养板(不含抗生素)生长的菌落并计数(表6)，gcl可能通过减少混合菌液中细胞数从而降低结合子数；[0113]表6.allcells计数(lb，单位为cfu/ml)[0114][0115]3.6样品对j53影响[0116]为检测样品单独对j53的影响，实验组培养24h后的j53菌液进行计数，检测其中在lb琼脂培养板(不含抗生素)生长的菌落并计数(表7)；其中，ggl与ggb样品对j53有明显的抑菌活性。[0117]表7.j53计数(cfu/ml)[0118][0119][0120]3.7样品对hs影响[0121]为检测样品单独对hs的影响，实验组培养24h后的hs菌液进行计数，检测其中在lb琼脂培养板(不含抗生素)生长的菌落并计数(表8)。[0122]表8.hs计数(lb单位为cfu/ml)[0123][0124]实验结果表明：[0125]与空白对照相比，哥纳香叶和茎提取物对供体菌和受体菌的生长均没有显著的抑制作用；[0126]景洪哥纳香叶和茎提取物gcl和gcb在2.5mg/ml浓度下能够降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子的转移率(表4-6及图1)；[0127]景洪哥纳香叶提取物gcl在2.5mg/ml浓度下能够降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子的数目(表3及图1)；[0128]与空白对照的1.4×10-5转移率相比，景洪哥纳香叶提取物gcl在2.5mg/ml浓度作用下，通过降低供体菌的结合子数，降低了肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子供体转移率至5.8×10-6，从而降低了耐药菌的总转移率至5.8×10-6，与空白对照的1.4×10-5相比，降低接近一个数量级，显示较强的耐药质粒结合抑制作用(表6及图2)。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.景洪哥纳香叶提取物在制备抑制耐药质粒接合转移药物中的用途，所述的耐药质粒是肺炎克雷伯菌耐药质粒。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的景洪哥纳香叶提取物取自番荔枝科哥纳香属植物景洪哥纳香的叶或者茎。3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的景洪哥纳香叶提取物通过下述方法制备，(1)取景洪哥纳香的叶或茎部位，经采集、切块、晾干、粉碎，用95％室温提浸泡提取；(2)挥发除去溶剂在45摄氏度下进行。4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肺炎克雷伯菌对炭青霉烯类抗生素耐药；该肺炎克雷伯菌菌株含有炭青霉烯类抗生素耐药质粒pkphs-1，pkphs-2，pkphs-3，pkphs-4，pkphs-5，pkphs-1。5.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的景洪哥纳香的叶或者茎提取物通过降低供体菌的结合子数，降低耐药菌的总转移率。6.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的景洪哥纳香叶提取物和茎提取物用于制备抑制含有炭青霉烯类抗生素耐药性传播的制剂。

技术总结
本发明属化学制药技术领域，涉及景洪哥纳香叶提取物及其用途，尤其涉及景洪哥纳香叶提取物在制备抑制耐药质粒接合转移药物中的用途。本发明经试验证实，景洪哥纳香叶和茎提取物对供体菌和受体菌的生长均没有显著的抑制作用；景洪哥纳香叶提取物GCL在2.5mg/mL浓度下能够降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合子的数目。所述景洪哥纳香叶提取物通过降低供体菌的结合子数，降低了耐药菌的总转移率，与空白对照相比，降低接近一个数量级，显示较强的耐药质粒结合抑制作用。本发明的景洪哥纳香叶和茎提取物可用于制备降低肺炎克雷伯菌耐药质粒结合的药物，进一步抑制质粒接合转移，消除细菌耐药质粒。菌耐药质粒。


技术研发人员：穆青 刘潇 蒋晓飞 田东兴 许又凯
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.08.06
技术公布日：2023/9/23