一种负载中药的水凝胶薄膜、其制备及抗骨肉瘤的应用

1.本发明属于生物医学工程领域，具体涉及壳聚糖/丝素蛋白负载中药冻干粉的水凝胶薄膜在治疗骨肉瘤中的应用。


背景技术：

2.骨肉瘤是青少年常见的恶性肿瘤，严重威胁青少年的生命安全和身心健康。骨肉瘤发病机制所涉及的分子过程尚不完全清楚。目前，常规的手术、化疗等治疗方法会存在复发和产生耐药性的问题。此外，手术后残留的肿瘤细胞会导致骨破坏和疾病复发。因此，有必要开发新药或增强当前使用的药物以及确定骨修复方法。药物靶向递送及手术植入骨修复材料以修复受损部位具有广泛的应用前景。壳聚糖具有优异的生物降解性和生物相容性，可用于生物工程各个领域。蚕丝蛋白是一种有机高分子材料，具备良好的韧性、成膜性及可生物降解特性，柞蚕丝素蛋白由于其分子链中具有由精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸首尾相连而成的特殊的rgd三肽肽段，该肽段对哺乳动物细胞有良好的吸附性和促增殖性。鹿茸补肾颗粒是全国名中医赵文海教授，依据天池伤科流派的骨质增生丸（“骨质增生丸”治疗增生性骨关节病）。
3.公开号cn110368485a，发明名称《鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的用途》公开了鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的用途，该鹿茸多肽可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，并且诱导骨肉瘤细胞凋亡，尤其是人骨肉瘤细胞u2os，在浓度为80μg/ml时效果最为显著。鹿茸多肽可以作为骨肉瘤治疗的潜在药物，减缓肿瘤的增长，促进治愈骨肉瘤。该专利虽然采用了鹿茸多肽治疗骨肉瘤，但是其并非中药制剂，而仅仅鹿茸众多活性成分中的一种多肽。
4.连湘倩，发表的《鹿茸活性成分调控骨肉瘤细胞死亡和迁移侵袭的机制研究》，公开了：通过网络药理学及体外细胞实验，探究鹿茸多肽及鹿茸其他活性成分调控骨肉瘤细胞死亡和迁移侵袭的作用机制。研究内容如下：（1）网络药理学分析获取鹿茸治疗骨肉瘤的物质基础和分子机制。结果发现tnf-α、notch1等可作为鹿茸治疗骨肉瘤的关键靶点；17β-雌二醇和雌酮等可作为鹿茸治疗骨肉瘤的关键成分。tnf-α介导的坏死性凋亡可促进肿瘤细胞死亡，notch1介导的notch信号通路可调控肿瘤细胞的迁移和侵袭，推测鹿茸活性成分可通过这两种途径调控骨肉瘤细胞的死亡和迁移侵袭。（2）体外细胞实验探究17β-雌二醇、雌酮及鹿茸多肽调控骨肉瘤细胞死亡的机制。mtt实验结果发现，17β-雌二醇和雌酮均可有效抑制mg63细胞的增殖活性。酶联免疫吸附实验发现，17β-雌二醇和雌酮能够上调mg63细胞中tnf-α、ripk3和mlkl蛋白的表达，tnf-α、ripk3和mlkl介导骨肉瘤细胞坏死性凋亡。说明17β-雌二醇和雌酮可以促进骨肉瘤细胞mg63中坏死性凋亡的发生。同样通过酶联免疫吸附实验发现，鹿茸多肽也可上调骨肉瘤细胞mg63中tnf-α、ripk3和mlkl的表达进而促进坏死性凋亡的发生。（3）体外细胞实验探究鹿茸多肽调控骨肉瘤细胞迁移侵袭的机制。细胞克隆形成实验结果显示，80μg/ml鹿茸多肽可以抑制骨肉瘤细胞mg63、u2os的增殖能力；细胞划痕实验和transwell实验结果显示，鹿茸多肽显著抑制骨肉瘤细胞mg63、u2os的迁移和侵
袭能力；westernblot和qpcr实验结果显示，20μg/ml和80μg/ml鹿茸多肽处理细胞后，细胞内notch1、hes1蛋白及其mrna表达量明显下降，说明鹿茸多肽可以抑制骨肉瘤细胞mg63、u2os中notch信号通路的表达。综上，鹿茸多肽、17β-雌二醇和雌酮可通过促进坏死性凋亡的发生进而促进骨肉瘤细胞死亡，鹿茸多肽下调notch信号通路的表达从而抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。
5.目前骨肉瘤制备中的中药复方剂中，并没有涉及到含有鹿茸的中药复方剂，且在抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡的效果上表现不佳。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决中药复合方剂在治疗骨肉瘤，尤其是抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡效果不佳的问题，而提供一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜、其制备方法及在抗骨肉瘤中的应用。
7.本发明的一种负载中药的水凝胶薄膜，是由5~15重量份的鹿茸、20~40重量份熟地黄、10~30重量份淫羊藿、10~30重量份肉苁蓉、10~30重量份鸡血藤、10~30重量份鹿衔草、10~30重量份骨碎补、10~30重量份莱菔子和壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成。
8.进一步地，所述的水凝胶薄膜是由10重量份的鹿茸、30重量份熟地黄、30重量份淫羊藿、20重量份肉苁蓉、20重量份鸡血藤、20重量份鹿衔草、20重量份骨碎补、20重量份莱菔子和壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成。
9.进一步地，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的质量比为1:1，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，采用盐酸溶解后与柞蚕丝素蛋白混合。
10.进一步地，所述的负载中药的水凝胶薄膜是将鹿茸、熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、鹿衔草、骨碎补和莱菔子制成鹿茸补肾汤冻干粉，加入到壳聚糖及柞蚕丝素蛋白的混液溶液中，得到的负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液后，置于载玻片上，干燥后得到；其中，负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液中鹿茸补肾汤冻干粉的质量浓度为1.8mg/ml。
11.本发明的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜的应用，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞增殖的药物。
12.本发明的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜的应用，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞迁移的药物。
13.本发明的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜的应用，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞坏死性凋亡或促进骨肉瘤细胞程序性凋亡的药物。
14.本发明制备所述的负载中药的水凝胶薄膜的方法如下：（1）、鹿茸煎煮液：称取5~15重量份的鹿茸加20倍量的水浸泡，浸泡后进行3~4次煎煮，第一次煎煮与后续每次的煎煮时间均为20~30min，其中，第一次煎煮的前10min武火煎煮，后10~20min文火煎煮；后续每次煎煮的前10min均为武火煎煮，后10~20min均为文火煎煮；煎煮后用纱布
过滤；（2）、称取20~40重量份熟地黄、10~30重量份淫羊藿、10~30重量份肉苁蓉、10~30重量份鸡血藤、10~30重量份鹿衔草、10~30重量份骨碎补和10~30重量份莱菔子，加6倍量的水浸泡，浸泡后进行多次煎煮，每次煎煮20~30min，前10min武火，后10~20min文火；煎煮后用纱布过滤；（3）、合并滤液：将步骤（1）煎煮后的鹿茸滤液与步骤（2）的滤液合并，将合并后的滤液制得鹿茸补肾汤冻干粉；（4）、将步骤（3）得到的鹿茸补肾汤冻干粉加入到壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液，充分混匀，得到负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液；（5）、将负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液铺在载玻片上，室温干燥后，得到所述的负载中药的水凝胶薄膜。
15.进一步地，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的质量比为1:1，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，采用盐酸溶解后与柞蚕丝素蛋白混合。
16.进一步地，步骤（4）中所述的负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液中鹿茸补肾汤冻干粉的质量浓度为1.8mg/ml。
17.进一步地，所制得的负载中药的水凝胶薄膜置于体积百分含量为80%的乙醇中进行不溶化处理。
18.进一步地，步骤（2）中所述的浸泡后进行多次煎煮的煎煮次数为3~4次。
19.本发明改变了鹿茸补肾颗粒的传统剂型得到鹿茸补肾方，并将其制成冻干粉，已在体外试验中验证了鹿茸补肾方冻干粉具有抗骨肉瘤活性的能力，因此将三者结合制备补肾方冻干粉及负载鹿茸冻干粉水凝胶薄膜。
20.本发明的中药复方冻干粉配伍：方中以鹿茸，生精补髓，养血益阴，强筋健骨为君，臣药熟地黄与淫羊藿调补阴阳、兴肾壮骨，肉苁蓉可达入肾充髓壮骨之效，取骨碎补、鹿衔草补骨治骨、止骨痛；佐以鸡血藤配合骨碎补等诸药，在补肾益精、填髓治骨基础上，通畅经络，行气活血，即可增强健骨作用，又能达“通则不痛”之效；使以莱菔子之健胃消食理气，以防补而滋腻之弊。诸药共用，以补肾壮骨，通络止痛。
21.本发明负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜与《鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的用途》相比，其提取鹿茸的有效成分，直接使用鹿茸多肽治疗骨肉瘤，而本发明所选择的鹿茸并非蛋白单体鹿茸多肽，而是直接将鹿茸与熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、鹿衔草、骨碎补、莱菔子制得中药复方冻干粉的水凝胶薄膜，而鹿茸由于未进行鹿茸多肽提取过程，因此，鹿茸多肽含量极少，并不能发挥出鹿茸多肽的功效。而本发明能够实现在抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，改善骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡的效果显著提升，是由于本发明采用的鹿茸与熟地黄、淫羊藿调补阴阳、兴肾壮骨，以及肉苁蓉入肾充髓壮骨，骨碎补、鹿衔草补骨治骨、止骨痛，从而达到改善或延缓骨肉瘤发展，可对抑制骨肉瘤细胞迁移，影响细胞增殖。
附图说明
22.图1为实施例1的中药冻干粉对骨肉瘤细胞增殖实验图；图a为鹿茸补肾方作用于
u2os细胞24h；图b为鹿茸补肾方作用于u2os细胞48h；图c为鹿茸补肾方作用于sw1353细胞24h；图d为鹿茸补肾方作用于sw1353细胞48h；*代表与对照组比较，p《0.05；图2为实施例1的中药冻干粉对骨肉瘤细胞划痕愈合能力结果图；图a、b表示u2os细胞愈合能力及其定量分析；图c、d表示sw1353细胞愈合能力及其定量分析。control表示对照组，treatment表示加入1.8mg/ml的鹿茸补肾方冻干粉；*代表与对照组比较，p《0.05；图3为实施例1的中药冻干粉对骨肉瘤细胞transwell迁移、侵袭能力结果图；图a、c表示u2os细胞愈合能力；图b、d表示sw1353细胞愈合能力。control表示对照组，treatment表示加入1.8mg/ml的鹿茸补肾方冻干粉；*代表与对照组比较，p《0.05；图4为实施例1的中药冻干粉对骨肉瘤细胞坏死性凋亡结果图；图a表示sw1353细胞中tnf-α的表达量；图b、c表示u2os细胞中tnf-α和mlkl的表达量。control表示对照组，treatment表示加入1.8mg/ml的鹿茸补肾方冻干粉；*代表与对照组比较，p《0.05；图5为实施例1的中药冻干粉对骨肉瘤细胞凋亡结果图；图a和c分别为u2os细胞中bcl-2和bax的表达情况及bcl-2/bax定量分析的比值，图b和d分别为sw1353细胞中bcl-2和bax的表达情况及bcl-2/bax定量分析的比值。control组表示对照组，treatment组表示加入1.8mg/ml的鹿茸补肾方冻干粉；*代表与对照组比较p《0.05；图6为实施例1的中药冻干粉水凝胶薄膜照片；图7为实施例1的中药冻干粉水凝胶薄膜对骨肉瘤细胞（u2os）增殖能力结果图；图8为实施例1的中药冻干粉水凝胶薄膜的多糖含量的测定图；其中，葡萄糖标准曲线，标准方程为y=0.6172x+0.1753，r2=0.9928；柱状图为不同煎煮次数鹿茸补肾方多糖含量。*代表p《0.05；图9为不同煎煮次数鹿茸补肾方蛋白质含量检测结果图，其中，蛋白质标准曲线，标准方程为y=0.5231x+0.139，r2=0.9981；柱状图不同煎煮次数鹿茸补肾方蛋白质含量，*代表与煎煮一次相比p《0.05；图10为不同煎煮次数鹿茸补肾方干膏含量检测结果，*代表p《0.05。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
24.本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
25.实施例1
26.本实施例的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜制备方法如下：第一步，按照鹿茸补肾方配方称取药材：鹿茸10g、熟地黄30g、淫羊藿20g、肉苁蓉20g、鸡血藤20g、鹿衔草20g、骨碎补20g、莱菔子20g。将鹿茸片和其他药材分别用蒸馏水浸泡一小时。
27.第二步，煎煮：鹿茸进行4次煎煮，每次加20倍水单煎，第一次煎煮30min，其中，前10min武火煎煮，后20min文火煎煮；后续煎煮时间均为20min，其中前10min武火煎煮，后10min文火煎煮，将煎煮的药液用纱布过滤；其他药材加6倍水每次煎煮30min，前10min武火，后10~20min文火；煎煮后用纱布过滤；将煎煮的药液用纱布过滤，分别将不同煎煮次数
的鹿茸和其他药材的药液合并，浓缩至100ml后取出5ml再与下一次的滤液合并，重复浓缩及取样步骤。
28.第三步，多糖含量的测定：按照苯酚-硫酸法制备多糖标准曲线，将稀释100倍后的鹿茸补肾方溶液与5%苯酚、浓硫酸按照1：1：5的比例混匀静置10min，在40℃条件下水浴5min后冷却至室温后与490nm处测定od值，根据标准曲线计算多糖含量，如图8所示，以od值为纵坐标(y），葡萄糖浓度为横坐标(x）制作标准曲线，曲线方程为y=0.6172x+0.1753，r2=0.9928，说明葡萄糖含量在0~1mg/ml范围内时，酶标仪测定结果线性关系良好。根据标准曲线，按照鹿茸补肾方不同煎煮次数样品溶液测定的od值计算多糖含量，测定结果显示从煎煮一次到煎煮四次多糖含量都是呈上升趋势，煎煮四次时多糖含量达到最大值，之后煎煮五次和六次与煎煮四次相比无明显差异。
29.第四步，蛋白质含量测定:根据bca试剂盒使用方法制作蛋白质标准曲线，将稀释100倍后的鹿茸补肾方溶液与bca试剂（bca试剂a：bca试剂b的体积比为50：1）按照1：10的比例混匀后于37℃烘箱中孵育30min，于562nm处测定od值，根据标准曲线计算蛋白质含量，如图9所示，以od值为纵坐标(y），葡萄糖浓度为横坐标(x）制作标准曲线，bca法测定的曲线方程为y=0.5231x+0.139，r2=0.9981，由此可见，测定的od值与蛋白质浓度之间的线性关系良好。根据标准曲线计算鹿茸补肾方不同煎煮次数样品溶液的蛋白质含量，测定结果显示与煎煮一次相比，其余煎煮次数蛋白质含量均呈上升趋势，但后续各煎煮次数之间无明显差异。
30.第五步，干膏含量的测定：将ep管干燥至恒重记录质量，取2ml上清液加入ep管中，55℃烘箱中干燥至恒重，称量，两次数量差值即为干膏含量，如图10所示，鹿茸补肾方经过5天的时间干燥至恒重，干膏含量随着煎煮次数增加呈上升趋势，在煎煮四次达到最大值，之后煎煮五次和煎煮六次与煎煮四次之间无明显差异，干膏含量表示所得中药汤剂的有效成分，煎煮过程中溶出的有效成分随煎煮次数的增加而增加。
31.第六步，将煎煮四次的鹿茸补肾方通过冻干干燥得到鹿茸补肾方冻干粉备用。
32.第七步，将0.1m盐酸溶液溶解的2%的壳聚糖溶液和柞蚕丝素蛋白按照1:1的质量比在磁力搅拌器上搅拌15min，充分混匀，得到壳聚糖/丝素蛋白共混溶液。将溶液分成三份备用。
33.第八步，将鹿茸补肾汤冻干粉按照1.8的量分别加入其中两份均为1ml的壳聚糖/丝素蛋白混合溶液，在磁力搅拌器上搅拌15min充分混匀即得两份浓度分为1.8mg/ml的负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液。
34.第九步，共混溶液铺在载玻片上，室温干燥两天，即得丝素蛋白-壳聚糖载药薄膜。
35.第十步，薄膜浸泡在80%的乙醇中进行不溶化处理。
36.第十一步，薄膜的灭菌处理：将制得的三种水凝胶薄膜（壳聚糖/丝素蛋白薄膜、负载1.8mg/ml鹿茸补肾方冻干粉的壳聚糖/丝素蛋白薄膜）先浸泡在75%的乙醇中30min，取出后浸泡pbs中1h（中间换液），之后再置于超净台中紫外照射30min，最后浸泡于1640培养基中24h。
37.第十二步，细胞实验；实验分为对照组（只在培养皿加入载玻片）、丝素蛋白-壳聚糖薄膜组及载药薄膜组，对处于对数生长期的骨肉瘤细胞u2os进行培养，通过噻唑蓝试剂（mtt）对细胞增殖能力进行检测。
38.对本实施制备的水凝胶薄膜中的冻干粉进行骨肉瘤治疗考察如下：1）鹿茸补肾方抑制骨肉瘤细胞的增殖将实施例1步骤六煎煮四次的鹿茸补肾方冻干粉分别对骨肉瘤细胞u2os和软骨肉瘤细胞sw1353增殖的半抑制浓度(ic50）进行研究，鹿茸补肾方冻干粉(0、1、2、3、4mg/ml，每ml培养基中所含冻干粉质量）作用于两种细胞24h、48h后，使用mtt法进行增殖实验的测定。实验结果如图1所示。随药物作用浓度和作用时间的增加对两种细胞的抑制效果更为显著，根据spss软件计算结果，鹿茸补肾方作用于u2os细胞在24h和48h的ic50值分别为3.4mg/ml和1.833mg/ml；而鹿茸补肾方作用于sw1353细胞在24h和48h的ic50值分别为2.708mg/ml和1.899mg/ml。所以在后续实验中选用了1.8mg/ml作为实验浓度。
39.2）鹿茸补肾方抑制骨肉瘤细胞的划痕愈合能力细胞划痕愈合能力是检测细胞迁移能力的经典实验，通过划痕前后迁移面积的比值来判定细胞迁移能力的强弱。实验发现经鹿茸补肾方冻干粉处理后的u2os和sw1353细胞与对照组相比细胞的迁移能力明显降低，说明鹿茸补肾方冻干粉对骨肉瘤细胞的迁移能力有抑制作用，可以影响骨肉瘤细胞的划痕愈合能力，实验结果如图2所示。
40.3）鹿茸补肾方抑制骨肉瘤细胞的迁移侵袭transwell实验可以检测细胞的迁移和侵袭能力，如图3所示，通过穿出transwell小室的细胞数量检测实施例1的鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的影响，实验结果表明鹿茸补肾方冻干粉作用后u2os细胞和sw1353细胞迁移和侵袭能力发生改变，加药处理组细胞穿出能力减弱，穿过小室的细胞数量减少。根据实验结果可以认为鹿茸补肾方冻干粉对骨肉瘤细胞的迁移侵袭能力有抑制作用，可以影响骨肉瘤细胞在体外的转移能力。
41.4）鹿茸补肾方促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡是受调节的坏死细胞死亡形式，坏死性凋亡是由肿瘤坏死因子α(tnf-α）下游的ripk1-ripk3-mlkl信号级联介导的细胞死亡途径。tnf-α可以诱导细胞坏死性凋亡，而mlkl是细胞坏死性凋亡的执行蛋白，因此，本发明首先检测了鹿茸补肾方冻干粉处理后的骨肉瘤细胞u2os和软骨肉瘤细胞sw1353中tnf-α的表达情况，发现经药物处理后的u2os细胞tnf-α的表达量升高，而sw1353细胞的tnf-α表达量无明显差异(图4的a、4的b）。猜测鹿茸补肾方对sw1353细胞的抑制可能不通过tnf-α的作用，因此只检测了tnf-α表达量有差异的u2os细胞中mlkl的表达量，发现鹿茸补肾方处理后的u2os细胞中mlkl的表达量呈升高趋势(图4的c），提示了鹿茸补肾方对骨肉瘤u2os细胞的促进坏死性凋亡作用。
42.5）鹿茸补肾方促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡bcl-2和bax是bcl-2家族内检测细胞程序性凋亡的明星分子， bcl-2与bax的比值影响细胞的凋亡进程。当细胞内bax高表达时，细胞对死亡信号敏感，促进了细胞发生程序性凋亡。当bcl-2高表达时，bcl-2可以和bax形成异源二聚体，抑制细胞程序性凋亡。通过western blotting实验检测bcl-2和bax在鹿茸补肾方冻干粉作用后的表达情况判断鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞程序性凋亡的影响。检测了对照组和1.8mg/ml鹿茸补肾方冻干粉处理组的骨肉瘤细胞中bcl-2和bax的表达量并进行了定量分析。鹿茸补肾方通过下调u2os细胞中bcl-2和bax的表达促进u2os细胞的程序性凋亡，而通过上调sw1353细胞中bcl-2和bax的表达促进sw1353细胞的程序性凋亡。如图5所示，实验结果表明，鹿茸补肾方冻干粉能够对骨肉瘤细胞的程序性凋亡产生促进作用。
43.本发明从骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等方面实验进行了研究。细胞增殖实验主要研究鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞的抑制作用，浓度为0-4mg/ml的鹿茸补肾方冻干粉分别作用于骨肉瘤细胞u2os和软骨肉瘤细胞sw1353，作用时间为24h及48h，发现随鹿茸补肾方浓度升高及作用时间的延长抑制作用增加；细胞迁移侵袭的研究使用了细胞划痕愈合和transwell实验，实验发现在1.8 mg/ml鹿茸补肾方冻干粉的作用下，细胞迁移率减弱，侵袭能力也下降，提示了鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞迁移侵袭的抑制能力，可能在抑制骨肉瘤肺转移中发挥作用；细胞凋亡实验从tnf-α诱导的细胞坏死性凋亡和细胞程序性凋亡两方面进行了研究，分别采用了elisa和western blotting实验，实验结果发现鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞u2os的坏死性凋亡及程序性凋亡均存在促进作用，对软骨肉瘤细胞sw1353的坏死性凋亡无明显影响，但促进其程序性凋亡，提示了鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞发生凋亡的调控作用。
44.6）中药冻干粉水凝胶薄膜抑制骨肉瘤细胞的增殖结果如图6和图7所示，图6 水凝胶薄膜，如图为水凝胶薄膜，从左到右分别为壳聚糖/丝素蛋白薄膜（cs/sf)、负载1.8mg/ml鹿茸补肾方冻干粉的壳聚糖/丝素蛋白薄膜(cs/sf-1.8mg/ml）。图7骨肉瘤细胞（u2os）增殖能力的测定，如图检测了水凝胶薄膜作用骨肉瘤细胞u2os之后的细胞增殖能力。

技术特征：
1.一种负载中药的水凝胶薄膜，其特征在于，所述的水凝胶薄膜是由5~15重量份的鹿茸、20~40重量份熟地黄、10~30重量份淫羊藿、10~30重量份肉苁蓉、10~30重量份鸡血藤、10~30重量份鹿衔草、10~30重量份骨碎补、10~30重量份莱菔子和壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成。2.根据权利要求1所述的一种负载中药的水凝胶薄膜，其特征在于，所述的水凝胶薄膜是由10重量份的鹿茸、30重量份熟地黄、30重量份淫羊藿、20重量份肉苁蓉、20重量份鸡血藤、20重量份鹿衔草、20重量份骨碎补、20重量份莱菔子和壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成。3.根据权利要求1所述的一种负载中药的水凝胶薄膜，其特征在于，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的质量比为1:1。4.如权利要求1或2所述的一种负载中药的水凝胶薄膜，其特征在于，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞增殖的药物。5.如权利要求1或2所述的一种负载中药的水凝胶薄膜，其特征在于，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞迁移的药物。6.如权利要求1或2所述的一种负载中药的水凝胶薄膜，其特征在于，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞坏死性凋亡或促进骨肉瘤细胞程序性凋亡的药物。7.权利要求1所述的一种负载中药的水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于，所述的负载中药的水凝胶薄膜制备方法如下：（1）、鹿茸煎煮液：称取5~15重量份的鹿茸加20倍量的水浸泡，浸泡后进行3~4次煎煮，第一次煎煮与后续每次的煎煮时间均为20~30min，其中，第一次煎煮的前10min武火煎煮，后10~20min文火煎煮；后续每次煎煮的前10min均为武火煎煮，后10~20min均为文火煎煮；煎煮后用纱布过滤；（2）、称取20~40重量份熟地黄、10~30重量份淫羊藿、10~30重量份肉苁蓉、10~30重量份鸡血藤、10~30重量份鹿衔草、10~30重量份骨碎补和10~30重量份莱菔子，加6倍量的水浸泡，浸泡后进行多次煎煮，每次煎煮20~30min，前10min武火，后10~20min文火；煎煮后用纱布过滤；（3）、合并滤液：将步骤（1）煎煮后的鹿茸滤液与步骤（2）的滤液合并，将合并后的滤液制得鹿茸补肾汤冻干粉；（4）、将步骤（3）得到的鹿茸补肾汤冻干粉加入到壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液，充分混匀，得到负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液；（5）、将负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液铺在载玻片上，室温干燥后，得到所述的负载中药的水凝胶薄膜。8.根据权利要求7所述的一种负载中药的水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的质量比为1:1，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，采用盐酸溶解后与柞蚕丝素蛋白混合。9.根据权利要求7所述的一种负载中药的水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液中鹿茸补肾汤冻干粉的质量浓度为1.8mg/ml。
10.根据权利要求7所述的一种负载中药的水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于，所制得的负载中药的水凝胶薄膜置于体积百分含量为80%的乙醇中进行不溶化处理。

技术总结
一种负载中药的水凝胶薄膜、其制备及抗骨肉瘤的应用，它涉及生物医学工程领域，本发明要解决中药复合方剂在治疗骨肉瘤，尤其是抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡效果不佳的问题。本发明中药复方冻干粉由鹿茸、熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、鹿衔草、骨碎补和莱菔子组成。并加入壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成水凝胶薄膜。本发明改变了鹿茸补肾颗粒的传统剂型得到鹿茸补肾方，并将其制成冻干粉，已在体外试验中验证了鹿茸补肾方冻干粉具有抗骨肉瘤活性的能力，因此将三者结合制备补肾方冻干粉及负载鹿茸冻干粉水凝胶薄膜。本发明应用于骨肉瘤治疗领域。本发明应用于骨肉瘤治疗领域。本发明应用于骨肉瘤治疗领域。


技术研发人员：赵长伟 周晓玲 赵文海
受保护的技术使用者：长春中医药大学
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/5