一种治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物及其制备方法、活性物质筛选方法

1.本发明涉及一种治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物，属于药物领域。


背景技术：

2.甲状腺功能减退症(简称甲减)，是一种常见的内分泌疾病，是一组由于不同原因导致的甲状腺激素合成和分泌缺乏或生物效应障碍导致的以机体代谢和多系统功能降低为特征的代谢紊乱综合征。根据疾病发生的部位不同，甲减可分为原发性甲减(发生在甲状腺本身，包括原发性临床性甲减和原发性亚临床甲减)、中枢性甲减(发生在垂体和下丘脑)、外周性甲减包括甲状腺激素抵抗综合征和消耗性甲减(iii型脱碘酶(deiodinase tipe iii，d3)活性增加导致四碘甲腺原氨酸(tetraiodothyronine,t4)灭活增多)，其中原发性甲减占所有甲减的99％以上。
3.原发性甲减主要是由于各种因素导致的甲状腺滤泡上皮细胞受损，最终导致甲状腺激素的合成和分泌减少。其主要的病因为自身免疫损伤(自身免疫性甲状腺炎)、甲状腺破坏(甲状腺手术、碘131放射治疗、头颈部的肿瘤放射治疗等)、碘摄入过量、抗甲状腺药物等引起甲状腺损伤、硒或维生素d等微量元素缺乏以及病毒感染和环境因素影响，其中自身免疫性损伤、甲状腺手术和运用碘131治疗甲状腺功能亢进症是引发原发性甲减的三个主要的原因，约90％的原发性甲减是由这三大原因引起的。该病临床表现无特异性，主要表现为代谢低下、交感神经兴奋性降低，可包括畏寒、乏力、记忆减退、嗜睡、表情呆滞、反应迟钝、面色苍白、皮肤干燥脱屑、脉率减低等表现，如果甲减程度严重或长期得不到有效、及时的甲状腺激素替代治疗，尚可诱发心脑血管、消化系统、肾上腺、性腺等多器官、系统损害，病情严重者可发生黏液性水肿昏迷，严重影响患者的身体健康和生活质量。
4.目前原发性甲减的治疗主要采用甲状腺激素制剂替代疗法，且往往需要终身服药。此法已应用100余年，为治疗原发性甲减的金标准。主要治疗药物为左旋甲状腺素钠片(l-tetraiodothyronine，l-t4)、干甲状腺片、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，t3)，其中l-t4为主要药物。但是原发性临床性甲减和原发性亚临床性甲减治疗方法以及治疗目标上还存在一定的区别，一般来说原发性临床性甲减的患者需要终生甲状腺激素替代治疗，其治疗目标为治疗后甲减的症状和体征消失，血清tsh、总四碘甲腺原氨酸(total tetraiodothyronine，tt4)、ft4水平保持在正常水平。而原发性亚临床甲减患者需要根据血清tsh的水平制定治疗方法和治疗目标，一般来说血清tsh≥10miu/l的患者被认为是重度原发性亚临床甲减，其治疗方法和治疗目标和原发性临床性甲减的患者一致。血清tsh＜10miu/l的患者被认为是轻度原发性亚临床甲减，如果伴有甲减症状、血脂异常、动脉粥样硬化疾病、甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，tpoab)升高时应该给予甲状腺激素替代治疗，如果没有上述表现只需定期随访即可。
5.虽然目前西医以甲状腺激素替代治疗原发性甲减取得了一定的效果，能够较好地改善甲状腺功能的相关指标，但没有在根本上解决甲减的病因，绝大部分患者甲状腺激素
虽然已替代到正常水平范围，但多数患者仍存在精神疲劳、情绪不稳定、记忆力减退、注意力不能集中、睡眠差、体重增加、躯体疼痛和身体笨拙等症状，而一些老年心脏病患者还易诱发心律失常、心绞痛，并有骨质疏松的危险。此外，该方法还常常存在药物依赖、药物耐受、药量不易控制等弊端，这常会导致患者的不规范的服药，严重影响了疾病的治疗。同时，由于甲状腺激素通常需要终身服药，患者服药的低依从性也是不容忽视的问题。
6.近年来，越来越多的基础以及临床研究发现中医药能够在原发性甲减的治疗中发挥良好的作用。有研究指出，中医药联合甲状腺激素替代治疗的方法较单纯甲状腺激素替代治疗的方法更具疗效，这可以一定程度减少甲状腺激素替代治疗的剂量。此外，研究发现，中医药治疗不仅能够改善甲状腺功能，还能够较好地减轻甲减患者的不适症状，明显提高患者的生活质量。中药虽不含有甲状腺激素，而可以通过补肾温阳，改善甲状腺本身的功能，提高基础新陈代谢率，来调整阴阳平衡，补益精髓气血，促进和调节机体的内分泌功能，从而起到改善临床症状的作用。
7.中医医家们对原发性甲减进行了深入的理论与实践的研究，各个医家常对原发性甲减的病因病机有着不完全相同的理解。对各医家对原发性甲减的认识的梳理后大致可将其分为如下几类(1)纯虚之疾，虚乃病之“根”；(2)虚实夹杂，虚乃病之“原”；(3)虚实同现，实乃病之“始”；诸多医家对原发性甲减的认识不完全一致，但总体来看，大多数医家认为原发性甲减以阳虚为主，病位主要在脾、肾、肝、心，属本虚标实之证，本虚以脾肾阳虚为主，标实以痰浊、瘀血、水饮、气郁为主。
8.目前有报道肾气丸加减治疗甲状腺功能减退症(何明清，肾气丸加减治疗甲状腺功能减退症60例，光明中医2017年2月第32卷第4期)，主要功效是补肾助阳，生津复脉。但在临床使用中，仍存在缺陷，对于甲减症复杂的病因，临床治疗存在局限性。


技术实现要素：

9.本发明的技术方案是提供了一种治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物。本发明还提供了该药物组合物的制备方法、以及活性物质筛选方法。
10.本发明提供了一种治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成：
11.桂枝8-12份、川芎8-12份、川牛膝8-12份、当归8-12份、桑枝12-18份、鸡血藤12-18份、补骨脂8-12份、杜仲8-12份、炙黄芪16-24份、丹皮8-12份、茯苓12-18份、泽泻12-18份、山药8-12份、山茱萸8-12份、熟地8-12份。
12.进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成：
13.桂枝10份、川芎10份、川牛膝10份、当归10份、桑枝15份、鸡血藤15份、补骨脂10份、杜仲10份、炙黄芪20份、丹皮10份、茯苓15份、泽泻15份、山药10份、山茱萸10份、熟地10份。
14.本发明组合物是由所述的原料药的原生药粉、水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的口服制剂。
15.其中，所述的制剂是口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、口服液。
16.本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、称取各重量配比的原料药；
17.b、加水煎煮、浓缩，再加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用
的制剂。
18.本发明还提供了该药物组合物在制备治疗原发性甲状腺功能减退症的药物中的用途。
19.所述的药物是通过激活ampk/mtor、ampk/sirt1信号通路并激活自噬减轻炎症反应的药物。
20.本发明还提供了该药物组合物在制备治疗精血亏虚，阳虚气弱，诸损不足，具有温阳益气、养血充精的药物中的用途。
21.本发明还提供了一种筛选所述的治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物中活性标志物的方法，它包括如下步骤：
22.a、基于uhplc-qe orbitrap平台，对组合物中活性成分鉴定，通过网络数据库依据其药代动力学性质、生物利用度和毒理学性质进行成分鉴定、活性成分筛选；
23.b、将a步骤筛选出的活性成分，预测原发性甲状腺功能减退症的靶点：对原发性甲状腺功能减退症的潜在靶点和a步骤筛选出的活性成分的药物靶点取交集，获得交集靶点；
24.c、构建与分析ppi网络；
25.d、基因本体论和kegg富集分析；
26.e、geo数据库验证核心靶点；
27.f、治疗原发性甲状腺功能减退症的关键成分与核心靶点的分子对接、分子动力学模拟。
28.本发明还提供了该筛选方法筛选的治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物的活性标志物，它包含槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇、4－异戊烯基氧基白藜芦醇、木犀草素、谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素。
29.本发明药物组合物具有温阳益气，养血充精之功效，方中黄芪大补阳气，健脾以助生化之源；熟地滋补肾阴，益精填髓，共为君药。臣以山茱萸、杜仲、补骨脂补益肝肾，益精助阳；臣以山药健脾益气，固肾精，资肾阴；桂枝温肾助阳，鼓舞肾气，与黄芪相伍，达温阳化气以利水之功；诸药相配，阴阳相生，使肾之元阳生化无穷，共助君药补阳益精。佐以当归、鸡血藤补血活血，配合黄芪、桂枝，以达气血双补，活血利水之功；另佐以茯苓健脾益肾，泽泻、丹皮降相火而制虚阳浮动，且茯苓、泽泻均有渗湿泄浊、通调水道之功；诸药相合，一方面，非峻补元阳，乃阴中求阳，微微生火，鼓舞肾气，即“少火生气”之意；另一方面，众多补益之品中加入活血淡渗之药，寓以补中有泻，泻中寓补，泄而不峻，补而不腻之意，以防滋腻之弊。桑枝通达上肢，牛膝通达下肢，加川芎疏肝、补气血、通经络，三药相伍，上下通行，气行而血畅，共为使药。全方诸药相合，共奏温阳益气，养血充精之功。
30.与肾气丸方解相比，为去附子，换干地黄为熟地黄，加黄芪、当归、鸡血藤、补骨脂、杜仲、川芎、牛膝、桑枝而成，肾气丸以附子、桂枝为君峻补阳气，本方去附子大辛大热之品，拟黄芪温补阳气为君，以防燥热伤阴，另立熟地为君，滋肾阴，充精血，共为本方功效主导；肾气丸以干地黄、山茱萸、山药为臣药，补阴助阳，本方以山茱萸、杜仲、补骨脂、山药、桂枝共为臣药，使阴阳相生，补阳益精；肾气丸以茯苓、泽泻、丹皮为佐药，活血利水，寓泻于补，本方以当归、鸡血藤、茯苓、泽泻、丹皮为佐药，养血活血兼利湿，补中有泻，泄而不峻，补而不腻；另本方设桑枝、川芎、牛膝为使药，上下通行，气行而血畅，助诸药通达全身，以消诸损之弊。
31.综上所述，本发明组合物的主要功效为温阳益气，养血充精，针对原发性甲状腺功能减退证，治从精血亏虚，阳虚气弱，诸损不足入手，除治肾阳之不足，亦布局于精亏血虚之弊、脾之阳气虚衰，多措并举，以消甲减诸损不足之弊，纵观全方，功效较肾气丸更全面，更贴切于甲减病机。药效更明确，且通过现代药理方法，筛选出组方中治疗原发性甲状腺功能减退症的活性标志物，质量可控，为临床提供了一种新的选择。
附图说明
32.图1甲减方治疗原发性甲减的靶点筛选
33.图2药物－化合物－靶点－疾病网络图
34.图3甲减方治疗原发性甲减相关靶点的ppi网络图
35.图4根据网络拓扑参数对甲减方治疗原发性甲减的核心靶点进行筛选
36.图5go功能富集分析
37.图6kegg通路富集分析
38.图7分子对接结合能热图
39.图8alb和芦荟大黄素的分子对接模型展示(-10.4kcal
·
mol-1
)
40.图9adipoq和山柰酚的分子对接模型展示(-9.4kcal
·
mol-1
)
41.图10sirt1和木犀草素的分子对接模型展示(-9.8kcal
·
mol-1
)
42.图11溶解曲线图和扩增曲线图(注：a-h分别是il-1β、il-6、tnf-α的溶解曲线图和扩增曲线)
43.图12各组大鼠的病理学观察
44.图13各组大鼠甲状腺组织中ampk/mtor及ampk/sirt1通路蛋白的表达情况
45.图14各组自噬相关蛋白lc3、beclin-1、p62蛋白的表达情况
具体实施方式
46.实施例1本发明药物口服液的制备
47.a、称取下述重量的原料：
48.桂枝10g、川芎10g、川牛膝10g、当归10g、桑枝15g、鸡血藤15g、补骨脂10g、杜仲10g、炙黄芪20g、丹皮10g、茯苓15g、泽泻15g、山药10g、山茱萸10g、熟地10g。
49.b、加入药材总量10倍量的水，煎煮，每次1小时，煎煮三次，合并滤液、浓缩，制备成口服液。
50.实施例2本发明颗粒剂的制备
51.a、称取下述重量的原料：
52.桂枝12g、川芎12g、川牛膝12g、当归12g、桑枝18g、鸡血藤18g、补骨脂12g、杜仲12g、炙黄芪24g、丹皮12g、茯苓18g、泽泻18g、山药12g、山茱萸12g、熟地12g。
53.b、加入药材总量10倍量的水，煎煮，每次1小时，煎煮三次，合并滤液、浓缩成浸膏，加入淀粉，制粒、整粒，得颗粒剂。
54.实施例3本发明片剂的制备
55.a、称取下述重量的原料：
56.桂枝8g、川芎8g、川牛膝8g、当归8g、桑枝12g、鸡血藤12g、补骨脂8g、杜仲8g、炙黄
芪16g、丹皮8g、茯苓12g、泽泻12g、山药8g、山茱萸8g、熟地8g。
57.b、加入药材总量10倍量的水，煎煮，每次1小时，煎煮三次，合并滤液、浓缩成浸膏，加入淀粉，制粒、整粒，压片，得片剂。
58.以下通过具体药效试验证明本发明的有益效果。
59.试验例1本发明药物治疗原发性甲状腺功能减退症药效试验
60.实验1：原发性甲减大鼠模型的制备
61.适应性喂养后，大鼠随机分为空白组8只、造模组40只，每组大鼠雌雄各半。造模组大鼠采用1％丙硫氧嘧啶(ptu)溶液按10ml/kg体重的剂量每日灌胃，以制备甲减模型(0.1％ ptu溶液的制备：将丙硫氧嘧啶(50mg/片)10片研碎，用500ml蒸馏水配成0.1％(1mg/ml)的ptu溶液)，空白组大鼠给予相应的10ml/kg体重的蒸馏水灌胃。每周记录大鼠体重以调整灌胃剂量。灌胃2周后眼眶静脉丛采血，检测各组大鼠血清中tsh、ft4、tt4、ft3、tt3的值，与空白组相比模型组出现主要指标tsh含量上升，ft4含量下降，即可判断为模型建立成功。之后根据各组大鼠tsh、ft4的均值作为基线，剔除超过对照组均值或低于对照组均值的样本大鼠个体后，将模型组大鼠再次随机分为模型组、西药组、中低组、中中组、中高组。造模成功后为了维持大鼠甲减状态，造模成功后除空白组外的各组依然用0.1％ ptu溶液灌胃，频率改为隔日1次直到实验结束。
62.造模结束后，采用elisa法检测大鼠血清中甲状腺激素相关指标(tsh、ft4、tt4、ft3、tt3)的水平，为了避免甲状腺激素分泌的节律性影响检测结果，取血的时间尽量安排在上午9：00-11：00。按elisa试剂盒要求逐步检测各组大鼠血清中的甲状腺激素相关指标的水平。
63.表1造模后，造模组大鼠和空白组大鼠血清中tsh、ft4、tt4、ft3、tt3的比较
[0064][0065]
注：与空白组相比，#p《0.05，##p《0.01；
[0066]
从表1中可知，与空白组相比诊断原发性甲减的关键指标tsh(p《0.05)明显升高，ft4(p《0.01)明显降低，同时辅助性指标tt4、ft3、tt3也显著降低(p《0.01)。
[0067]
通过给大鼠灌胃0.1％的ptu 2周后成功建立了原发性甲减的模型，该模型具有典型的甲减的症状以及显著降低的甲状腺激素的水平，此外以空白组大鼠激素水平的均值为筛选条件，筛选出异常值的大鼠8只，使得模型更加的准确，后续的实验奠定了基础。
[0068]
实验2：甲减方对原发性甲减大鼠的治疗作用
[0069]
1.实验材料
[0070]
1.1实验动物：由实验1成功造模的动物；
[0071]
1.2实验药品
[0072]
西药：丙硫氧嘧啶片(上海复星朝晖药业有限公司，货号：h31021082，50μg；规格：50mg/片)；左旋甲状腺素钠片(德国默克公司，货号：h20140052；规格：50μg/片)中药：甲减方，药物组成为：桂枝10g川芎10g川牛膝10g当归10g桑枝15g鸡血藤15g补骨脂10g杜仲10g炙黄芪20g丹皮10g茯苓15g泽泻15g山药10g山茱萸10g熟地10g，上述药物都是中药配方颗
粒购于成都中医药大学附属医院(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号分别为21080021、21100182、21100140、21080106、21080138、21040097、21060071、21100136、21090158、21100036、21100369、21070072、21090103、21100304、21090080)。
[0073]
2.实验方法
[0074]
2.1动物分组及造模
[0075]
实验1中，造模后造模组大鼠为40只，通过空白组ft4和tsh的均值，再次筛选了造模组动物的异常值，结果筛除了8只大鼠，最后，将造模组大鼠32只再次进行随机分组，分为5个组。组别和数量分别为空白组8只、模型组6只、西药组7只、中药低剂量组6只、中药中剂量组6只、中药高剂量组7只。
[0076]
2.2给药方式及给药类别
[0077]
不同组别的大鼠给予相应的药物进行灌胃，灌胃频率为每天1次，灌胃周期持续4周，其中西药组：1μg/ml左旋甲状腺素钠混悬液9ml/kg灌胃，每天1次，持续4周；中药组：高中低剂量，每天1次，持续4周；模型组：无菌纯水灌胃，每天1次，持续4周；空白组：无菌纯水灌胃，每天1次，持续4周；中药按体表面积换算法换算出大鼠等效剂量，中药等效剂量定为低剂量、中剂量(相当于成人剂量5倍，成人体质量按70kg计)低剂量为中剂量1/2倍，高剂量为中剂量2倍；西药等效剂量灌喂(相当于成人剂量5倍，成人体质量按70kg计)各组大鼠的给药情况见表2。
[0078]
表2各组大鼠的给药的情况
[0079][0080][0081]
注：甲减方水煎液中的药物克数指的是中药生药的克数，因本研究用的是中药颗粒剂溶于水后进行灌胃，使用颗粒剂的重量已与生药克数进行等比例的转换(浓缩比是1:12)。
[0082]
2.3动物取材及处理
[0083]
末次灌胃后大鼠禁食不禁水24h，通过腹腔注射1％戊巴比妥(40mg/kg)麻醉所有大鼠，腹主动脉取血，静置1h，3000r/min离心机中离心10min，取上层血清封存后，于-20℃冰箱中保存，待测。大鼠处死后，割开颈部皮肤，剥离颈部肌肉及筋膜组织，暴露甲状腺，取左侧甲状腺组织于10％多聚甲醛溶液中，常温保存，待用；右侧甲状腺组织，于冻存管中-80℃冰箱保存，待测。
[0084]
2.4观察项目及方法
[0085]
2.4.1一般情况观察
[0086]
从第二次分组后开始，每周观察和记录各组大鼠的精神状态、摄食饮水情况、活动及反应能力、毛发的颜色及光泽、耳、唇、尾、鼻的色泽、排便等情况，如有大鼠死亡，或者其他意外情况、不良事件等也应及时记录。
[0087]
2.4.2甲状腺激素相关指标水平检测
[0088]
治疗结束后，采用elisa法检测大鼠血清中甲状腺激素相关指标(trh、tsh、ft4、tt4、ft3、tt3)的水平，为了避免甲状腺激素分泌的节律性影响检测结果，取血的时间尽量安排在上午9：00-11：00。取上清置于1.5ml离心管中大鼠血清按elisa试剂盒要求逐步检测，最终检测450nm波长处的od值，检测各组大鼠血清中的甲状腺激素相关指标的水平。
[0089]
2.5统计学方法
[0090]
同实验一。
[0091]
3.实验结果
[0092]
3.1大鼠的一般情况观察
[0093]
给予丙硫氧嘧啶造模14天后相较于空白对照组，甲减模型组大鼠精神较萎靡、行动迟缓、反应迟钝、摄食饮水量降低、毛发脱落无光泽、鼻嘴唇苍白无光泽，体重增加、大便较稀，随着干预的开始，西药组，以及各中药组上述表现逐渐呈现不同程度的好转，其中尤其以中药中、高剂量组和西药组改变最为明显。未见大鼠死亡及其他意外情况、不良事件等。
[0094]
3.2各组大鼠下丘脑－垂体－甲状腺轴相关的激素水平的比较
[0095]
表3各组大鼠血清中trh浓度的变化
[0096][0097]
备注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01；其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01；中药组和西药组比较，
△
p《0.05，
△△
p《0.01；
[0098]
根据表3统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中trh浓度明显降低，差异极显著(p《0.01)。
[0099]
与模型组相比，西药组大鼠血清中trh浓度明显升高，差异极显著(p《0.01)；中药中剂量组、中药高剂量组大鼠血清中trh浓度明显升高，差异显著(p《0.05)；中药低剂量组大鼠血清中trh浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0100]
与西药组相比，中药低剂量组大鼠血清中trh的浓度明显升高低于西药组，差异显著(p《0.05)，中药中剂量组和中药高剂量组大鼠血清中trh浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0101]
表4各组大鼠血清中tsh浓度的变化
[0102][0103]
备注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01；其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01；中药组和西药组比较，
△
p《0.05，
△△
p《0.01；
[0104]
表4统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中tsh浓度明显升高，差异极显著(p《0.01)。
[0105]
与模型组相比，西药组大鼠血清中tsh浓度明显降低，差异显著(p《0.05)；中药中剂量组、中药高剂量组大鼠血清中tsh浓度明显降低，差异极显著(p《0.01)；中药低剂量组大鼠血清中tsh浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0106]
与西药组相比，中药各组大鼠血清中tsh浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0107]
表5各组大鼠血清中ft3浓度的变化
[0108][0109]
备注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01；其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01；中药组和西药组比较，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0110]
表5统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中ft3浓度明显降低，差异极显著(p《0.01)。
[0111]
与模型组相比，西药组、中药中剂量组、中药高剂量组大鼠血清中ft3浓度明显升高，差异极显著(p《0.01)；中药低剂量组大鼠血清中ft3浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0112]
与西药组相比，中药各组大鼠血清中ft3浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0113]
表6各组大鼠血清中ft4浓度的变化
[0114][0115]
备注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01；
[0116]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01；
[0117]
中药组和西药组比较，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0118]
表6统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中ft4浓度明显降低，差异极显著(p《0.01)。
[0119]
与模型组相比，西药组、中药中剂量组、中药高剂量组大鼠血清中ft4浓度升高，差异显著(p《0.05)；中药低剂量组大鼠血清中ft4浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0120]
与西药组相比，中药各组大鼠血清中ft4浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0121]
表7各组大鼠血清中tt3浓度的变化
[0122][0123]
备注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01；
[0124]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01；
[0125]
中药组和西药组比较，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0126]
表7统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中tt3浓度明显降低，差异极显著(p《0.01)。
[0127]
与模型组相比，西药组、中药中剂量组大鼠血清中tt3浓度明显升高，差异极显著(p《0.01)；中药高剂量组大鼠血清中tt3浓度升高，差异显著(p《0.05)；中药低剂量组大鼠血清中tt3浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0128]
与西药组相比，中药各组大鼠血清中tt3浓度差异不显著，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0129]
表8各组大鼠血清中tt4浓度的变化
[0130][0131]
备注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01；
[0132]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01；
[0133]
中药组和西药组比较，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0134]
表8统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中tt4浓度明显降低，差异极显著(p《0.01)。
[0135]
与模型组相比，西药组、中药中剂量组大鼠血清中tt4浓度升高，差异显著(p《0.05)；中药低剂量组、中药高剂量组大鼠血清中tt4浓度差异不显著，不具备统计学意义(p＞0.05)。
[0136]
与西药组相比，中药各组大鼠血清中tt4浓度差异不显著，不具备统计学意义(p＞0.05)。
[0137]
4.小结
[0138]
甲减方不仅能够很好地改善原发性甲减大鼠的一般症状，还能够很好地调节原发性甲减大鼠的下丘脑－垂体－甲状腺轴的相关激素的水平，根据统计学结果分析，可见甲
3.8.0中，通过networkanalyzer工具进行拓扑分析，同样根据网络拓扑参数dc大于2倍中位数，bc、cc值均大于中位数对关键的靶点进行排序，筛选出核心靶点。
[0153]
1.6go和kegg富集分析分析
[0154]
甲减方的靶点治疗原发性甲减的靶点上传到metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html)，设置p《0.01，限定物种为“homo sapiens”，并进行go功能和kegg通路富集分析，最后将得到的数据运用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理制。
[0155]
1.7分子对接
[0156]
将1.4筛选出的关键成分与1.5ppi网络中筛选的核心靶点分子对接。从pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载上述有效成分的sdf格式文件，接着将其导入chem3d软件中进行能量最小化处理，处理后导出为mol2格式的文件，从蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)获得分辨率较高、含有配体分子、结构获得方式为x射线的核心蛋白的3d结构。运用autodocktools 1.5.6和pymol2.3.4软件，将关键靶点去除水分子，分离配体和受体，加入极性氢，计算gasteiger电荷，分配ad4类型，将小分子配体柔性键设置为可旋转等操作，之后导出为pdbqt格式文件，最后分子对接使用autodock vina 1.1.2执行，并将对接的结合能结果利用微生信平台绘制成热图，结合能越小颜色越深，也说明靶点和配体之间的结合活性越高，运用pymol2.3.2软件可视化展示三个不同蛋白对接结合能最好的分子对接模型。
[0157]
2.结果
[0158]
2.1甲减方的有效成分及相关靶点
[0159]
将两个数据库汇总及删除重复值后，川牛膝获得4个化合物成分，169个靶点；川芎获得7个化合物成分，30个靶点；丹皮获得11个化合物成分，158个靶点；当归获得2个化合物成分，51个靶点；杜仲获得28个化合物成分，198个靶点；茯苓获得15个化合物成分，23个靶点；桂枝获得7个化合物成分，49个靶点；黄芪获得20个化合物成分，194个靶点；鸡血藤获得24个化合物成分，127个靶点；山药获得16个化合物成分，72个靶点；山茱萸获得20个化合物成分，68个靶点；熟地黄获得2个化合物成分，30个靶点；泽泻获得10个化合物成分，5个靶点；补骨脂获得14个化合物成分，274个靶点；桑枝获得20个化合物成分，349个靶点，整合之后共获得甲减方的有效成分165个和靶点710个。
[0160]
2.2原发性甲减相关靶点的收集
[0161]
从上述5个数据库中获取原发性甲减的靶点，其中ncbi数据库36个，genecards数据库154个，omim数据库149个，disgenet数据库19个，pharmgkb数据库171个，将5个数据库获取的靶点的数据取并集，最终得到562个原发性甲减的相关靶点。
[0162]
2.3甲减方治疗原发性甲减的靶点
[0163]
将筛选出的甲减方的靶点710个，原发性甲减的相关靶点562个，两者取交集后得到62个甲减方治疗原发性甲减的靶点，可以认为这62个靶点可能是甲减方治疗原发性甲减的靶点见图1。
[0164]
2.4药物－化合物－靶点－疾病网络图
[0165]
运用cytoscape 3.8.0绘制药物－化合物－靶点－疾病网络图，见图2。该网络中含有158个节点以及398条边，通过该图可以直观地看出甲减方可能通过多成分多靶点发挥
对原发性甲减的治疗作用。运用cytoscape 3.8.0内置的network analyzer对获得的药物－化合物－靶点－疾病网络图进行网络拓扑分析，根据bc、cc均大于等于中位数dc值大于等于2倍中位数，筛选关键活性成分，最后一共获得了8关键活性成分，这些成分可能是甲减方治疗原发性甲减中发挥作用的关键成分，见表9。
[0166]
注：网络中蓝色为活性成分，绿色为药物作用于疾病的靶点，黄色为中药，红色矩形为疾病。
[0167]
表9甲减方治疗原发性甲减的关键成分
[0168][0169]
2.5ppi网络分析
[0170]
对甲减方治疗原发性甲减的相关靶点及进行ppi网络分析，该网络中有62个节点，435条边，平均度值为14。运用cytoscape 3.8.0内置的network analyzer对获得的ppi网络图进行网络拓扑分析，接着同样根据bc、cc均大于等于中位数dc值大于等于2倍中位数筛选核心靶点，如图3、图4，最终获得了12个满足条件的靶点，见表10，这些靶点可以认为是甲减方治疗原发性甲减的核心靶点。
[0171]
表10甲减方治疗原发性甲减的核心靶点
[0172][0173][0174]
2.6go和kegg富集分析
[0175]
将交集靶点数据导入到metascape数据平台进行go和kegg富集分析，富集获得205条kegg通路，go分析中获得了3735条生物学过程、269条细胞组分、503分子功能，将富集得到的主要的kegg和go分析结果运用微生信平台进行可视化，分别见图5、图6，可见甲减方治疗原发性甲减的靶点主要通过调控对激素的反应、细胞分化的负调控、激素代谢过程、对脂多糖的反应、调节小分子代谢过程、细胞对细胞因子刺激的反应、细胞凋亡信号通路、对营养水平的反应、类固醇代谢过程、脂质代谢过程的调节等生物学过程；作用的细胞组分为转录调节复合物、内质网腔隙、质膜蛋白复合物、细胞外基质、蛋白激酶复合物等，以及影响受体配体活性，血红素结合、激素活性、核受体结合、抗氧化活性、g蛋白偶联受体结合、氧结合
等分子功能，相关的通路涉及晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,ages)－晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation endproducts,rage)、癌症、腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase,ampk)、非酒精性脂肪肝(non alcoholic fatty liver disease，nafld)、甲状腺激素、类固醇激素生物合成、p53、甲状腺激素合成等信号通路。
[0176]
2.7分子对接
[0177]
将筛选得到的甲减方核心化合物槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇、4－异戊烯基氧基白藜芦醇、木犀草素、谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素和核心靶点ins(pdbid:1uz9)、alb(pdbid:7ov5)、esr1(pdbid:1r5k)、vegfa(pdbid:4qaf)、il1b(pdbid:5r85)、ccl2(pdbid:1dok)、igf1(pdbid:1tgr)、lep1(pdbid:ax8)、adipoq(pdbid:5lx9)、sirt1(pdbid:4kxq)、crp(pdbid:3pvn)、casp3(pdbid:1nme)进行分子对接，计算核心化合物和核心靶点之间的结合能，以预测它们的结合活性，结合能低于0表明两个分子能够自发结合，结合能负值越高提示构象越稳定，一般认为结合能《-5.0kcal
·
mol-1
表示具有较好的结合能力，见图7。图中可见大部分的对接结果都小于0，且所有96个对接结果结合能《-5.0kcal
·
mol-1
，可见核心成分与核心靶点之间大都能够很好地结合，这也表明了甲减方的核心成分可与核心靶点的有效结合，反映了甲减方对原发性甲减治疗作用的可行性，最后将此模型运用pymol2.3.2展示两者间的相互作用，在此展示三个不同蛋白对接结合能最好的分子对接模型(alb和芦荟大黄素、adipoq和山柰酚、sirt1和木犀草素)，见图8-图10。
[0178]
3.小结
[0179]
综上所述，本章通过网络药理学和分子对接的方法预测了甲减方治疗原发性甲减的物质基础和潜在机制。发现甲减方可能是通过槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇、4－异戊烯基氧基白藜芦醇、木犀草素、谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素等的活性成分作用于ins、alb、esr1、il-1b等相关的潜在靶点，影响了age-rage、癌症、ampk、nafld、甲状腺激素、类固醇激素生物合成、p53、甲状腺激素合成等信号通路，干预了对激素的反应、细胞分化的负调控、激素代谢过程、对脂多糖的反应、调节小分子代谢过程、细胞对细胞因子刺激的反应信号通路等生物学过程，从而治疗原发性甲减。展示了甲减方多成分、多通路、多靶点治疗原发性甲减的特点。
[0180]
不难发现，在相关的信号通路中，ampk信号通路是关键的信号通路，不少研究也展示了其在甲状腺疾病中发挥着重要的作用，甲减方治疗原发性甲减的作用可能与ampk信号通路相关。在下一部分的实验中拟进一步验证ampk信号通路在甲减方治疗原发性甲减中的作用。
[0181]
试验例3甲减方通过调控ampk信号通路治疗原发性甲减的实验验证
[0182]
一、甲状腺组织中ampk/mtor和ampk/sirt1通路蛋白和自噬相关蛋白的表达
[0183]
1、实验步骤
[0184]
1.1大鼠甲状腺组织样本总蛋白提取
[0185]
将样本取出放入2ml研磨管中，然后向每管加入3mm钢珠及ripa裂解液(按照质量比样本：裂解液＝1:10)，置于高速低温组织研磨仪内(温度-20℃，研磨4次，每次60秒)；取出放4℃冰箱30分钟进行裂解，30分钟后取出放入离心机(4℃、12000rpm离心、10min)；离心完后取上清液，用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
[0186]
1.2样品蛋白浓度测定(bca法)
[0187]
(1)蛋白标准工作液配置
[0188]
a.取1.2ml蛋白标准配制液加入一管蛋白标准(30mgbsa)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。
[0189]
b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20℃长期保存。
[0190]
(2)标准品加样
[0191]
取一块酶标板，按以下表格数据加入试剂：
[0192][0193]
(3)bca工作液配制
[0194]
根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀；各孔加入200μl的bca工作液；振荡混匀后，37℃放置30min。
[0195]
(4)绘制标准曲线
[0196]
用酶标仪测定562nm波长处的od值(如下表所示)，以蛋白浓度(μg/μl)为横坐标，od值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0197][0198]
1.3样品测定
[0199]
取待测蛋白样品2μl用去裂解液稀释至16μl，再取稀释后待测蛋白2μl加入孔中加入裂解液补足至20μl，加入200μl bca工作液，混匀后37℃放置30分钟，然后以0号孔为对照，测定样品562nm波长处的od值；根据所测样品的od值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量(μg)。
[0200]
计算蛋白浓度：以标准曲线上查得的相应蛋白含量(μg)除以样品稀释总体积(20μl)，乘以样品稀释倍数即为待测样品的实际浓度(μg/μl)
[0201]
(1)蛋白变性
[0202]
各实验组取50μl，按4:1比例加入5
×
loding buffer，混匀后热循环仪95℃，15min，-80℃保存。
[0203]
(2)上样、电泳
[0204]
待到积层胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。用水冲洗一下积层胶以冲净孔内的碎胶，放入电泳槽中，加足够的电泳缓冲液后开始准备上样；上样：30μg(6μg/μl)，用10μl的移液枪将样品缓慢地加入加样孔中；电泳：接通电源，稳定电压100v，15min，当溴酚蓝染料到分离胶以后将电压调至180v继续电泳，到达凝胶底部时终止电泳。
[0205]
(3)转膜
[0206]
按照分离胶的尺寸剪1张pvdf膜和6张滤纸，将膜与切好的带有目的条带的分离胶一起放入转膜液中平衡10min，同时准备两块海绵；用转膜液将6张滤纸浸湿，按照海绵、滤纸(3张)、膜、凝胶、滤纸(3张)、海绵的顺序叠放好，每层之间用玻棒赶走气泡；转膜：将凝胶
面与负极相连，pvdf膜与正极相连，接通电源，200ma转膜1—2h。
[0207]
(4)封闭
[0208]
将pvdf膜放入用tbst buffer稀释的5％脱脂牛奶，放入孵育盒，摇床上轻摇2h。
[0209]
(5)孵育抗体
[0210]
一抗孵育：将pvdf膜放入一抗中，(一抗浓度：ampk 1:2000；beclin1 1:2000；lc3b1:2000；mtor 1:1000；p62 1:2000；p-ampk 1:2000；p-mtor 1:2000；sirt1 1:2000；β-actin1:50000)，摇床上轻摇，4℃孵育过夜；用tbst将pvdf膜洗3次，每次5min；
[0211]
二抗孵育：将pvdf膜放入二抗(稀释浓度：1:5000)中，摇床上轻摇，室温孵育2—3h；用tbst将pvdf膜洗3次，每次10min。
[0212]
(6)显影、定影
[0213]
将pvdf膜平铺到曝光板上，将ecl发光液的a、b两种试剂等体积混合后，均匀地滴加到膜上，反应1min后，将放有膜的曝光板放入化学发光凝胶成像仪的暗室中，根据信号的强弱适当调整曝光时间，曝光。
[0214]
图像分析：用天能gis机箱控制软件v2.0对条带进行曝光扫描，结果以目的蛋白相对表达量表示。
[0215]
(7)一抗二抗洗脱
[0216]
为节约实验样本、蛋白，或为使目的蛋白和内参在同一张膜上进行显影，会根据实验具体情况对步骤1.5.9完成后的膜进行一抗二抗洗脱液处理去除膜上结合的抗体，进行多次检测。采用这一策略多次检测同一张膜上的蛋白，能省去蛋白电泳和转膜等耗费性步骤，而且可以消除重新上样带来的误差，使结果可比性更强。具体操作如下：
[0217]
1)将需要处理的膜经蒸馏水漂洗5min，然后充分浸泡于一抗二抗洗脱液中(洗脱液需要提前复温)，室温摇床上振荡10-60min。可在洗脱一定时间后，对膜进行ecl显色、曝光检测确定是否洗脱干净。如未洗脱干净，则继续进入一抗二抗洗脱液浸泡处理，直到洗脱干净。
[0218]
2)洗脱干净后，取出膜用tbst漂洗两次，直接进行1.5.7至1.5.9步骤进行实验。
[0219]
1.4甲状腺组织中炎症相关基因的表达
[0220]
1.4.1实验步骤
[0221]
(1)样本总rna提取
[0222]
首次使用前先在结合液bd*中加入24ml无水乙醇(5t/50t分别加入2.4ml/24ml无水乙醇)，漂洗液w*中加入52ml无水乙醇(5t/50t分别加入5.2ml/52ml无水乙醇)，充分混匀后使用。
[0223]
取10—20mg新鲜样本于ep管中并加入350ul裂解液lb，用高速低温组织研磨仪捣碎。将研磨均匀的匀浆液转移至dna清除/rna吸附通用柱上(柱子放在2ml收集管内)，13,000rpm离心1min，收集含有rna的滤液。
[0224]
加入与上述滤液等体积的结合液bd*，立即轻柔吹打混匀。
[0225]
将上述混合液全部加入新的dna清除/rna吸附通用柱中，13,000rpm离心30s，弃掉滤液。加入700μl去蛋白液，室温30s，13,000rpm离心30s，弃掉滤液，将dna清除/rna吸附通用柱重新放回2ml收集管中。加入500ul漂洗液w*，13,000rpm离心30s，弃掉滤液。空柱13,000rpm离心2min，除去残留的漂洗液w*。将dna清除/rna吸附通用柱放入新的1.5ml离心管
中，在膜中央加入30-50ul rnase-free h2o，室温放置1min。然后13,000rpm离心1min，收集滤液，即为rna溶液，待测或者-80℃保存。
[0226]
(2)基因组dna的除去反应(见表11)
[0227]
表11基因组dna去除反应体系
[0228][0229]
备注：依次加入各试剂后，42℃，2min
[0230]
(3)逆转录反应(见表12)
[0231]
表12逆转录反应体系
[0232][0233]
(4)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time pcr)
[0234]
1、引物设计
[0235]
从美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库搜索基因全序列，用primer premier引物设计软件设计筛选各基因特异性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，以ultrapage纯化(详见下表)。
[0236]
表13本次检测所用引物及碱基序列
[0237][0238]
实时荧光定量pcr反应(表14，表15)
[0239]
表14 pcr反应体系
[0240][0241]
表15 pcr反应体系
[0242][0243]
1.4.2实验结果
[0244]
使用thermo scientific pikoreal软件(thermo公司)分析pcr过程各检测样本的ct(threshold cycle)值。本实验室通过2
‑△△
ct
计算x相对mrna表达水平：
△
ct＝ct目的基因-ct内参；
△△
ct＝
△
ct实验－
△
ct对照
[0245]
xmrna表达差别倍数以2
‑△△
ct表示
[0246]
溶解曲线图和扩增曲线图见图11。
[0247]
2.实验结果
[0248]
2.1甲状腺的一般病理学观察
[0249]
由图12可见不同组别大鼠甲状腺的病理学改变，其中空白组大鼠甲状腺组织结构完整、清晰，分叶较为明显，小叶内含有许多甲状腺滤泡，滤泡大小不等，呈圆形、椭圆形，滤泡上皮由单层立方上皮细胞组成，排列较为整齐，滤泡内充满胶质，胶质呈均质状，嗜酸性；模型组大鼠甲状腺组织可见明显的结构受损，分叶不明显，小叶内滤泡结构不清晰，大量滤泡增生，排列较为密集，上皮细胞肥大呈高柱状，胞体较大，胞核清亮，胞质较为丰富，部分区域上皮排列紊乱、不规则，管腔较小，腔内胶样物质基本消失不见；间质内可见少量纤维组织增生及血管充血。西药组大鼠甲状腺组织结构受损，可见分叶，部分区域滤泡增生，上皮细胞肥大，管腔略微变小，腔内胶样物质较少；间质极少量纤维组织增生及血管轻微充血。中药中剂量组大鼠甲状腺组织结构受损，可见分叶，部分区域滤泡增生，上皮细胞肥大，管腔略微变小，腔内胶样物质较少；间质极少量纤维组织增生及血管轻微充血。可见与空白相比，模型组大鼠甲状腺组织可见大量滤泡增生、上皮细胞肥大、管腔减小、腔内胶样物质减少、间质内可见少量纤维组织增生及血管充血等典型的原发性甲减的病理表现；与模型组相比，西药和中药中剂量上述病理损伤都得到了一定的改善。
[0250]
2.2甲状腺组织中ampk/mtor及ampk/sirt1通路蛋白和自噬相关蛋白的表达情况
[0251]
2.2.1各组大鼠甲状腺组织中ampk/mtor及ampk/sirt1通路蛋白的表达情况(见图13)
[0252]
表16各实验组大鼠甲状腺组织中p-ampk/ampk表达
[0253][0254]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0255]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0256]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0257]
表16统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中p-ampk/ampk表达存在明显降低，具备统计学意义(p《0.05)；
[0258]
与模型组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中p-ampk/ampk表达有明显升高，具
备统计学意义(p《0.05)，西药组大鼠甲状腺组织中p-ampk/ampk表达存在明显升高，具备统计学意义(p《0.01)
[0259]
与西组相比，中药重计量组大鼠甲状腺组织中p-ampk/ampk表达存在明显升高，具备统计学意义(p《0.05)；
[0260]
表17各实验组大鼠甲状腺组织中p-mtor/mtor表达
[0261][0262]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0263]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0264]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0265]
表17统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中p-mtor/mtor存在升高趋势，但是不具备统计学意义(p《0.05)；
[0266]
与模型组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中p-mtor/mtor表达显著降低，具备统计学意义(p《0.01)，西药组大鼠甲状腺组织中p-mtor/mtor表达存在显著降低，具备统计学意义(p《0.05)
[0267]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中p-mtor/mtor表达存在明显降低，具备统计学意义(p《0.05)；
[0268]
表18各实验组大鼠甲状腺组织中sirt1表达
[0269][0270]
注：模型组与空白组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01
[0271]
其余组与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01
[0272]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0273]
表18统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中sirt1蛋白表达显著降低，具备极其显著的统计学意义(p《0.01)；
[0274]
与模型组相比，西药组大鼠甲状腺组织中sirt1蛋白表达明显升高，具备统计学意义(p《0.05)；中药中剂量组大鼠甲状腺组织中sirt1蛋白表达显著升高，具备极其显著的统计学意义(p《0.01)；
[0275]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中sirt1蛋白表达存在明显提高，具备极其显著的统计学意义(p《0.01)；
[0276]
2.2.2各组自噬相关蛋白lc3、beclin-1、p62蛋白的表达情况(见图14)。
[0277]
表19各实验组大鼠甲状腺组织中lc3-ii/lc3-i表达
[0278][0279]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0280]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0281]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0282]
表19统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中lc3-ii/lc3-i表达存在显著降低，具备极显著的统计学意义(p《0.01)；
[0283]
与模型组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中lc3-ii/lc3-i表达有上升的趋势，但不具备统计学意义(p＞0.05)，西药组大鼠甲状腺组织中lc3-ii/lc3-i表达存在显著升高，具备统计学意义(p《0.05)
[0284]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中lc3-ii/lc3-i蛋白表达存在明显提高，具备统计学意义(p《0.05)。
[0285]
表20各实验组大鼠甲状腺组织中beclin1表达
[0286][0287]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0288]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0289]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0290]
表20统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中beclin1蛋白表达有降低的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)；
[0291]
与模型组相比，西药组、中剂量组大鼠甲状腺组织中beclin1蛋白表达有上升的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)；
[0292]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中beclin1蛋白表达有上升的趋势但，不具备统计学意义(p》0.05)。
[0293]
表21各实验组大鼠甲状腺组织中p62表达
[0294][0295]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0296]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0297]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0298]
表21统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中p62蛋白表达明显降
低，具备统计学意义(p《0.05)；
[0299]
与模型组相比，西药组大鼠甲状腺组织中p62蛋白表达有降低的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)；中剂量组大鼠甲状腺组织中p62蛋白表达明显降低，具备统计学意义(p《0.05)；
[0300]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中p62蛋白表达有降低的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)。
[0301]
3甲状腺组织中炎症因子相关基因的表达
[0302]
表22大鼠甲状腺组织il-1βmrna的表达变化
[0303]
组别样本数量(例)2
‑△△
ct
(基因表达值)空白组31.060
±
0.454模型组33.200
±
1.570
*
西药组31.080
±
0.702
#
中药中剂量组30.640
±
0.279
##
[0304]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0305]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0306]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0307]
表22统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中il-1βmrna表达升高，具备统计学意义(p《0.05)。
[0308]
与模型组相比，中药中剂量组甲状腺组织中il-1βmrna表达明显降低，具备极显著的统计学意义(p《0.01)；西药组大鼠甲状腺组织中il-1βmrna表达降低，具备统计学意义(p《0.05)；
[0309]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中il-1βmrna有降低的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)。
[0310]
表23大鼠甲状腺组织il-6mrna的表达变化
[0311]
组别样本数量(例)2
‑△△
ct
(基因表达值)空白组31.023
±
0.297模型组32.720
±
1.944西药组31.363
±
0.777中药中剂量组30.730
±
0.495
[0312]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0313]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0314]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0315]
表23统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中il-6mrna表达有上升的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)；
[0316]
与模型组相比，中剂量组与西药组大鼠甲状腺组织中il-6mrna表达有降低的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)；
[0317]
与西药组相比，中药中剂量组大鼠甲状腺组织中il-6mrna表达有降低的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)。
[0318]
表24大鼠甲状腺组织tnf-αmrna的表达变化
[0319][0320]
注：模型组与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01
[0321]
其余组与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01
[0322]
中药组与西药组相比，
△
p《0.05,
△△
p《0.01；
[0323]
表24统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠甲状腺组织中tnf-αmrna表达明显升高，具备极显著的统计学意义(p《0.01)。
[0324]
与模型组相比，西药组大鼠甲状腺组织中tnf-αmrna表达明显降低，具备极显著的统计学意义(p《0.01)；中剂量组大鼠甲状腺组织中tnf-αmrna表达降低，具备统计学意义(p《0.05)。
[0325]
与模型组相比，中剂量组与西药组大鼠甲状腺组织中tnf-αmrna表达有升高的趋势，但不具备统计学意义(p》0.05)。
[0326]
本实验运用甲减方优效剂量组(中剂量组)进行了甲状腺组织的病理学检测，发现甲减方能够一定程度的改善原发性甲减大鼠的病理损伤程度，且改善程度和西药组相当。其次，由于网络药理学研究部分发现ampk信号通路可能是甲减方治疗原发性甲减的关键通路，检测了其中关键的两条通路ampk/mtor、ampk/sirt1信号通路，并检测了与之相关及与甲状腺疾病相关的自噬的标志蛋白和炎症因子的表达情况。上述的结果提示，甲减方能够一定程度的激活ampk/mtor、ampk/sirt1信号，同时促进自噬，减少炎症因子的基因表达。
[0327]
甲减方能够很好地改善甲减大鼠的甲状腺功能，其机制可能是激活了甲状腺组织中ampk/mtor信号通路以及ampk/sirt1信号通路，激活了细胞自噬的水平，并抑制了炎症反应有关。

技术特征：
1.一种治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成：桂枝8-12份、川芎8-12份、川牛膝8-12份、当归8-12份、桑枝12-18份、鸡血藤12-18份、补骨脂8-12份、杜仲8-12份、炙黄芪16-24份、丹皮8-12份、茯苓12-18份、泽泻12-18份、山药8-12份、山茱萸8-12份、熟地8-12份。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成：桂枝10份、川芎10份、川牛膝10份、当归10份、桑枝15份、鸡血藤15份、补骨脂10份、杜仲10份、炙黄芪20份、丹皮10份、茯苓15份、泽泻15份、山药10份、山茱萸10份、熟地10份。3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于：它是由所述的原料药的原生药粉、水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的口服制剂。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂是口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、口服液。5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的药物组合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、称取各重量配比的原料药；b、加水煎煮、浓缩，再加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。6.权利要求1-4任意一项所述的药物组合物在制备治疗原发性甲状腺功能减退症的药物中的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的药物是通过激活ampk/mtor、ampk/sirt1信号通路并激活自噬减轻炎症反应的药物。8.权利要求1-4任意一项所述的药物组合物在制备治疗精血亏虚，阳虚气弱，诸损不足，具有温阳益气、养血充精的药物中的用途。9.一种筛选权利要求1-4任意一项所述的治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物中活性标志物的方法，它包括如下步骤：a、基于uhplc-qe orbitrap平台，对组合物中活性成分鉴定，通过网络数据库依据其药代动力学性质、生物利用度和毒理学性质进行成分鉴定、活性成分筛选；b、将a步骤筛选出的活性成分，预测原发性甲状腺功能减退症的靶点：对原发性甲状腺功能减退症的潜在靶点和a步骤筛选出的活性成分的药物靶点取交集，获得交集靶点；c、构建与分析ppi网络；d、基因本体论和kegg富集分析；e、geo数据库验证核心靶点；f、治疗原发性甲状腺功能减退症的关键成分与核心靶点的分子对接、分子动力学模拟。10.权利要求9所述的筛选方法筛选的治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物的活性标志物，其特征在于：它包含槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇、4－异戊烯基氧基白藜芦醇、木犀草素、谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素。

技术总结
本发明提供了一种治疗原发性甲状腺功能减退症的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成：桂枝8-12份、川芎8-12份、川牛膝8-12份、当归8-12份、桑枝12-18份、鸡血藤12-18份、补骨脂8-12份、杜仲8-12份、炙黄芪16-24份、丹皮8-12份、茯苓12-18份、泽泻12-18份、山药8-12份、山茱萸8-12份、熟地8-12份。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物药效明确，且通过现代药理方法，筛选出组方中治疗原发性甲状腺功能减退症的活性标志物，质量可控，为临床提供了一种新的选择。为临床提供了一种新的选择。为临床提供了一种新的选择。


技术研发人员：谢春光 高泓 谢红艳 富晓旭
受保护的技术使用者：成都中医药大学附属医院（四川省中医医院）
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/10/5