一种高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法与流程

1.本发明具体涉及一种高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，属于医药生物技术领域。


背景技术：

2.庆大霉素是由weinstein于1963年首次从绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌中分离所得，是一种氨基糖苷类广谱抗生素；现有技术中，庆大霉素存在着产量低、发酵时间长和产品杂质高等缺点；目前，为了提高庆大霉素发酵单位，主要是从改变菌株的遗传性状出发；绛红小单孢菌是gm的产生菌之一，属于放线菌目小单孢菌属，革兰氏阳性菌，具有遗传性质十分稳定，传统的选育方法较难得到高产菌株。


技术实现要素：

3.为解决上述问题，本发明提出了一种高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，菌种操作简单，利用微生物代谢产物的反馈抑制机制，增加绛红色小单孢菌对逆环境生长的耐受性，短时间内获得有效价值的突变菌株，是一种可以提高绛红色小单孢菌发酵单位的方法；筛选得到的突变菌株通过发酵试验考察具有较高的产抗能力与传代稳定。
4.本发明的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，所述方法步骤如下：（1）培养基制备，将15000μ/ml硫酸庆大霉素粉加入5ml纯化水溶解，过滤无菌后加入60ml种瓶培养基中；（2）孢子菌接种，取一支生长成熟的菌株斜面加入5ml生理盐水，用接种棒均匀地将菌株刮入无菌生理盐水中，制备成孢子悬浮液，接种至上述种瓶培养基中，培养4~6天，温度37℃~40℃，并进行镜检；（3）菌丝培养，当上一步骤镜检菌丝生长状态旺盛时，将正在培养的种瓶加入1%氯化锂溶液，继续培养5~7天，并进行镜检；（4）单菌落获取，当上一步的种瓶中颜色转为浅紫色，镜检菌丝成团，种瓶液变粘稠，取下种瓶，并用逐级稀释法吸取1ml种瓶液，分别稀释至10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，并分别取上述稀释的100μl菌液涂布于平板培养基的培养皿中，培养10~12天，温度37℃~40℃，获取单菌落；（5）突变菌株制备，目视挑选单菌落用无菌技术划线法接种斜面固体培养基并进行培养，得到突变菌株；（6）突变菌株培养，将突变菌株斜面和原始菌株斜面采用挖块法接入1cm2至发酵瓶的发酵培养基种，培养温度33℃~35℃，培养时间96小时；（7）菌株液相测效价，成熟后取下发酵瓶，液相测效价。
5.进一步地，所述60ml种瓶培养基制备过程如下：先进行培养基配比，再进行装瓶，所述培养基配比以1l计为：可溶性淀粉6.25g、蛋白胨5g、玉米粉15g、鹰豆粉18.8g、葡萄糖
1g、硝酸钾0.6g、浓度为1.2μg/ml的氯化钴0.24ml和碳酸钙6.25g；并调节ph至7.2，所述装瓶过程为：装量60ml/瓶,湿热灭菌25~30分钟，灭菌条件压力0.12
±
0.02mpa, 温度121℃～124℃。
6.进一步地，所述菌丝生长状态旺盛为菌丝伸展和粗壮。
7.进一步地，所述平板培养基配比以1l计：琼脂粉10g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1粉g，调节ph至7.8，121℃高压蒸汽灭菌25min。
8.进一步地，所述斜面固体培养基与平板培养基的配方、培养温度和培养时间均相同；所述单菌落的挑选标准为黑色丰满，中间凸起和四周呈圆形盘旋状。
9.进一步地，所述突变菌株与原始菌株接种标准要求大小保持一致，所述发酵培养基的配制以1l计如下：淀粉37g、蛋白胨4g、玉米粉11.5g、鹰豆粉35g、葡萄糖2g、硝酸钾0.185g、硫酸铵1g、浓度为10μg/ml的氯化钴2ml和碳酸钙3g，并调节ph至7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
10.进一步地，所述步骤（7）的发酵瓶成熟标准：颜色为深紫色，粘稠糊状，无泡沫和无异臭。
11.与现有技术相比，本发明的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，得到产庆大霉素能力更强的绛红色小单孢菌，发酵水平可达2453.38μ/ml，部分批次可达到2557.44μ/ml，比现在水平提高90%-97%；操作简易、成本低，适合大规模工业化生产。
附图说明
12.图1为本发明的实施例1突变菌株和原始菌株对比示意图。
13.图2为本发明的实施例2突变菌株和原始菌株对比示意图。
具体实施方式
14.实施例1：
15.本发明的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，所述方法步骤如下：（1）培养基制备，将15000μ/ml硫酸庆大霉素粉加入5ml纯化水溶解，过滤无菌后加入60ml种瓶培养基中；（2）孢子菌接种，取一支生长成熟的菌株斜面加入5ml生理盐水，用接种棒均匀地将菌株刮入无菌生理盐水中，制备成孢子悬浮液，接种至上述种瓶培养基中，培养4~6天，温度37℃~40℃，并进行镜检；（3）菌丝培养，当上一步骤镜检菌丝生长状态旺盛时（菌丝伸展和粗壮），将正在培养的种瓶加入1%氯化锂溶液，继续培养5~7天，并进行镜检；（4）单菌落获取，当上一步的种瓶中颜色转为浅紫色，镜检菌丝成团，种瓶液变粘稠，取下种瓶，并用逐级稀释法吸取1ml种瓶液，分别稀释至10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，并分别取上述稀释的100μl菌液涂布于平板培养基的培养皿中，培养10~12天，温度37℃~40℃，获取单菌落；（5）突变菌株制备，目视挑选单菌落用无菌技术划线法接种斜面固体培养基并进
行培养，得到突变菌株；（6）突变菌株培养，将突变菌株斜面和原始菌株斜面采用挖块法接入1cm2至发酵瓶的发酵培养基种，培养温度33℃~35℃，培养时间96小时；（7）菌株液相测效价，成熟后取下发酵瓶，液相测效价。
16.其中，所述60ml种瓶培养基制备过程如下：先进行培养基配比，再进行装瓶，所述培养基配比以1l计为：可溶性淀粉6.25g、蛋白胨5g、玉米粉15g、鹰豆粉18.8g、葡萄糖1g、硝酸钾0.6g、浓度为1.2μg/ml的氯化钴0.24ml和碳酸钙6.25g；并调节ph至7.2，所述装瓶过程为：装量60ml/瓶,湿热灭菌25~30分钟，灭菌条件压力0.12
±
0.02mpa, 温度121℃～124℃。所述平板培养基配比以1l计：琼脂粉10g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1粉g，调节ph至7.8，121℃高压蒸汽灭菌25min；所述斜面固体培养基与平板培养基的配方、培养温度和培养时间均相同；所述单菌落的挑选标准为黑色丰满，中间凸起和四周呈圆形盘旋状；所述突变菌株与原始菌株接种标准要求大小保持一致，所述发酵培养基的配制以1l计如下：淀粉37g、蛋白胨4g、玉米粉11.5g、鹰豆粉35g、葡萄糖2g、硝酸钾0.185g、硫酸铵1g、浓度为10μg/ml的氯化钴2ml和碳酸钙3g，并调节ph至7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min；，所述步骤（7）的发酵瓶成熟标准：颜色为深紫色，粘稠糊状，无泡沫和无异臭。
17.实施例2：
18.本发明的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，所述方法步骤如下：a、种瓶培养基配比（0.5l）为：可溶性淀粉3.125g，蛋白胨2.5g，玉米粉7.5g，鹰豆粉9.4g，葡萄糖0.5g，硝酸钾0.3g，氯化钴0.12ml（浓度为1.2μg/ml），碳酸钙3.125g，调节ph至7.2，装量60ml/瓶,湿热灭菌30分钟，灭菌条件压力0.12
±
0.02mpa, 温度121℃，装量60ml；b、将15000μ/ml硫酸庆大霉素粉加入5ml纯化水溶解，过滤无菌后加入60ml种瓶培养基中；c、取一支生长成熟的菌种斜面加入5ml生理盐水制备成孢子悬浮液，接种至种瓶培养基中，培养，菌株受硫酸庆大霉素粉抑制，生长缓慢，103小时镜检观察菌丝伸展，粗壮；d、将正在培养的种瓶培养基中加入1%氯化锂溶液，继续培养，镜检观察。145小时菌丝生长状态旺盛，菌丝成团；e、种瓶转为浅紫色，种瓶液变粘稠，取下种瓶，吸取种瓶液，用逐级稀释法吸取1ml种瓶液，分别稀释至10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，分别取100μl菌液涂布于含有分离培养基的培养皿中，培养10-12天，温度37℃~40℃，获取单菌落；平板培养基和斜面培养基配比一致，具体以1l计：琼脂粉12g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1g，调节ph至7.8，121℃高压蒸汽灭菌25min；培养温度37℃，培养时间11天；目视挑单菌落用无菌技术划线法接种斜面固体培养基，培养温度37℃，培养时间11天，得到突变菌株斜面；f、发酵培养基的配制（1l）：淀粉37g，蛋白胨4g，玉米粉11.5g，鹰豆粉35g，葡萄糖2g，硝酸钾0.185g，硫酸铵1g，氯化钴2ml（浓度为10μg/ml），碳酸钙3g，调节ph至7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min，装量30ml；
g、将突变菌株斜面和原始菌株斜面采用挖块法接入1cm2发酵瓶培养基，培养温度35℃，培养96小时；h、成熟后取下种瓶，高效液相测效价。
19.如图1所示，结果分析：筛选得到的突变菌株庆大霉素发酵能力稳定，通过发酵试验考察具有较高的产抗能力与传代稳定。
20.实施例3：
21.本发明的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，所述方法步骤如下：a、种瓶培养基配比（0.5l）为：可溶性淀粉3.125g，蛋白胨2.5g，玉米粉7.5g，鹰豆粉9.4g，葡萄糖0.5g，硝酸钾0.3g，氯化钴0.12ml（浓度为1.2μg/ml），碳酸钙3.125g，调节ph至7.0，装量60ml/瓶,湿热灭菌30分钟，灭菌条件压力0.12
±
0.02mpa, 温度121℃，装量60ml；b、将15000μ/ml硫酸庆大霉素粉加入5ml纯化水溶解，过滤无菌后加入60ml种瓶培养基中；c、取一支生长成熟的菌种斜面加入5ml生理盐水制备成孢子悬浮液，接种至种瓶培养基中，培养，菌株生长缓慢，106小时镜检观察菌丝伸展，粗壮；d、将正在培养的种瓶培养基中加入1%氯化锂溶液，继续培养，镜检观察。148小时菌丝生长状态旺盛，菌丝成团；e、种瓶转为浅紫色，种瓶液变粘稠，取下种瓶，吸取种瓶液，用逐级稀释法吸取1ml种瓶液，分别稀释至10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，分别取100μl菌液涂布于含有分离培养基的培养皿中，培养10-12天，温度37℃~40℃，获取单菌落；平板培养基配比和斜面培养基配比一致，具体以1l计：琼脂粉12g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1g，调节ph至7.8，121℃高压蒸汽灭菌25min；培养温度37℃，培养时间11天；f、目视挑单菌落用无菌技术划线法接种斜面固体培养基，培养温度37℃，培养11天，得到斜面菌种；g、发酵培养基的配制（1l）：淀粉37g，蛋白胨4g，玉米粉11.5g，鹰豆粉35g，葡萄糖2g，硝酸钾0.185g，硫酸铵1g，氯化钴2ml（浓度为10μg/ml），碳酸钙3g，调节ph至7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min，装量30ml；h、将突变菌株斜面和原始菌株斜面采用挖块法接入1cm2发酵瓶培养基，培养温度35℃，培养96小时；i、成熟后取下种瓶，高效液相测效价。
22.如图2所示，结果分析：筛选得到的突变菌株庆大霉素发酵能力稳定，通过发酵试验考察具有较高的产抗能力与传代稳定。
23.上述实施例，仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

技术特征：
1.一种高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于，所述方法步骤如下：（1）培养基制备，将15000μ/ml硫酸庆大霉素粉加入5ml纯化水溶解，过滤无菌后加入60ml种瓶培养基中；（2）孢子菌接种，取一支生长成熟的菌株斜面加入5ml生理盐水，用接种棒均匀地将菌株刮入无菌生理盐水中，制备成孢子悬浮液，接种至上述种瓶培养基中，培养4~6天，温度37℃~40℃，并进行镜检；（3）菌丝培养，当上一步骤镜检菌丝生长状态旺盛时，将正在培养的种瓶加入1%氯化锂溶液，继续培养5~7天，并进行镜检；（4）单菌落获取，当上一步的种瓶中颜色转为浅紫色，镜检菌丝成团，种瓶液变粘稠，取下种瓶，并用逐级稀释法吸取1ml种瓶液，分别稀释至10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，并分别取上述稀释的100μl菌液涂布于平板培养基的培养皿中，培养10~12天，温度37℃~40℃，获取单菌落；（5）突变菌株制备，目视挑选单菌落用无菌技术划线法接种斜面固体培养基并进行培养，得到突变菌株；（6）突变菌株培养，将突变菌株斜面和原始菌株斜面采用挖块法接入1cm2至发酵瓶的发酵培养基种，培养温度33℃~35℃，培养时间96小时；（7）菌株液相测效价，成熟后取下发酵瓶，液相测效价。2.根据权利要求1所述的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于：所述60ml种瓶培养基制备过程如下：先进行培养基配比，再进行装瓶，所述培养基配比以1l计为：可溶性淀粉6.25g、蛋白胨5g、玉米粉15g、鹰豆粉18.8g、葡萄糖1g、硝酸钾0.6g、浓度为1.2μg/ml的氯化钴0.24ml和碳酸钙6.25g；并调节ph至7.2，所述装瓶过程为：装量60ml/瓶,湿热灭菌25~30分钟，灭菌条件压力0.12
±
0.02mpa, 温度121℃～124℃。3.根据权利要求1所述的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于：所述菌丝生长状态旺盛为菌丝伸展和粗壮。4.根据权利要求1所述的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于：所述平板培养基配比以1l计：琼脂粉10g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1粉g，调节ph至7.8，121℃高压蒸汽灭菌25min。5.根据权利要求1所述的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于：所述斜面固体培养基与平板培养基的配方、培养温度和培养时间均相同；所述单菌落的挑选标准为黑色丰满，中间凸起和四周呈圆形盘旋状。6.根据权利要求1所述的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于：所述突变菌株与原始菌株接种标准要求大小保持一致，所述发酵培养基的配制以1l计如下：淀粉37g、蛋白胨4g、玉米粉11.5g、鹰豆粉35g、葡萄糖2g、硝酸钾0.185g、硫酸铵1g、浓度为10μg/ml的氯化钴2ml和碳酸钙3g，并调节ph至7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。7.根据权利要求1所述的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，其特征在于：所述步骤（7）的发酵瓶成熟标准：颜色为深紫色，粘稠糊状，无泡沫和无异臭。

技术总结
本发明公开了一种高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，所述方法步骤如下：（1）培养基制备，（2）孢子菌接种，（3）菌丝培养，（4）单菌落获取，（5）突变菌株制备，目视挑选单菌落用无菌技术划线法接种斜面固体培养基并进行培养，得到突变菌株；（6）突变菌株培养，将突变菌株斜面和原始菌株斜面采用挖块法接入1cm2至发酵瓶的发酵培养基种，培养温度33℃~35℃，培养时间96小时；（7）菌株液相测效价，成熟后取下发酵瓶，液相测效价。本发明的高产庆大霉素的绛红色小单孢菌抗性突变选育方法，得到产庆大霉素能力更强的绛红色小单孢菌，发酵水平可达2453.38μ/ml，部分批次可达到2557.44μ/ml，比现在水平提高90%-97%。97%。97%。


技术研发人员：毛宁 王莉莉 叶晖 时圣凤 孟晓妍 伍雄辉 杨勇 金绍杰 张力支 张文浩
受保护的技术使用者：福安药业集团烟台只楚药业有限公司
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/10/5