一种诱导藻类高效合成虾青素的方法与流程

1.本发明生物合成技术领域，特别涉及一种诱导藻类高效合成虾青素的方法。


背景技术：

2.虾青素，化学名为3,3
′‑
二羟基-4,4
′‑
二酮基-β,β
′‑
胡萝卜素，属于萜烯类不饱和化合物，其化学分子式为c
40h52
o4。虾青素分子结构中包含两个β-紫罗兰酮环和11个共轭双键。该物质广泛存在于自然界，如大多数海洋甲壳动物和鲑科鱼类的体内。虾青素被称为“超级抗氧化剂”，其抗氧化能力是其他类胡萝卜素如β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素的10倍以上。虾青素具有强大的自由基清除能力和抑制脂质过氧化的作用，在预防动脉硬化、视网膜黄斑变性、帕金森综合征等方面发挥重要作用。它对于维护眼睛和中枢神经系统健康、增强免疫系统功能、强化机体能量代谢、抗癌和抗感染等方面具有多重功效。
3.目前，虾青素的生产方法主要包括从虾蟹壳中提取、化学合成以及利用红发夫酵母或雨生红球藻等生物合成方法生产。其中，生物合成法，尤其是利用雨生红球藻进行培养法生产虾青素，是当前自然虾青素主要的生产方法。从雨生红球藻中提取的虾青素具有高抗氧化活性且无毒副作用，广泛应用于保健食品、医药和化妆品等领域。然而，由于雨生红球藻生长速率较慢、培养周期长，因此面临着成本高、生产效率低以及产量低(3-30mg/g)等技术瓶颈的制约。因此，目前依靠雨生红球藻培养来生产天然虾青素远不能满足国际市场的需求。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提供了诱导藻类高效合成虾青素的方法。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.诱导藻类高效合成虾青素的方法，包括如下步骤：
7.将藻种子液接种至诱导培养基中，进行光诱导培养；
8.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9～30g/l葡萄糖、0.1～0.2g/l硝酸钠、0.8～2.2g/l半乳糖氧化酶或半乳糖氧化酶的酸水解物和/或1～3g/l芸苔素、0.18～0.23g/l磷酸二氢钾、0.08～0.12g/l岩藻糖(l-岩藻糖，cas号2438-80-4，分子式c6h
12
o5)、0.025～0.035g/l硫酸镁、0.0025～0.0035mg/l硫酸铜、5～7mg/l氯化铁、0.025～0.035g/l氯化钙、0.17～0.29mg/l硫酸锰、0.025～0.036g/l氯化钠、0.3～0.7mg/l硫酸锌、0.0012～0.0018mg/l钼酸铵、0.06～0.08mg/l硼酸。
9.优选的，半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于盐酸溶液，在90-100℃下水解3-6h，加入氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。
10.优选的，半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的20v/v％盐酸溶液，在90℃下水解3h，加入氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。
11.优选的，所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：30g/l葡萄糖、0.2g/l硝酸钠、2.2g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、3g/l芸苔素、0.23g/l磷酸二氢钾、0.12g/l岩藻糖、0.035g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、5mg/l氯化铁、0.025g/l氯化钙、0.17mg/l硫酸锰、0.036g/l氯化钠、0.7mg/l硫酸锌、0.0015mg/l钼酸铵、0.06mg/l硼酸。
12.优选的，所述光为蓝光，光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h。
13.优选的，所述藻为雨生红球藻。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
15.本发明方法可大大提高藻胞内虾青素的产量，效率高，耗时短，方法简便，能耗低，有效降低生产成本，在利用藻进行天然虾青素的积累方面具有重要应用价值。
16.本发明研究结果显示半乳糖氧化酶或其酸水解物和芸苔素在适当浓度下能够显著促进藻细胞内虾青素的积累，可作为一种有效的诱导子应用于藻虾青素的生产。
具体实施方式
17.为了使本领域的普通技术人员更好地理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述。
18.半乳糖氧化酶，cas号9028-79-9，酶活：50u/mg，是由一条含六百多个氨基酸基团的单聚肽链组成、以铜原子为活性中心的酶。
19.藻种为雨生红球藻(gy-d2 haematococcus pluvialis，上海光语生物科技有限公司)。
20.实施例1诱导藻类高效合成虾青素的方法
21.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
22.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：30g/l葡萄糖、0.2g/l硝酸钠、2.2g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、3g/l芸苔素、0.23g/l磷酸二氢钾、0.12g/l岩藻糖、0.035g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、5mg/l氯化铁、0.025g/l氯化钙、0.17mg/l硫酸锰、0.036g/l氯化钠、0.7mg/l硫酸锌、0.0015mg/l钼酸铵、0.06mg/l硼酸。
23.半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的20％(v/v)盐酸溶液，在90℃下水解3h，加入30％(v/v)氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。
24.实施例2诱导藻类高效合成虾青素的方法
25.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
26.所述诱导培养基中包括如下浓度的各组分：30g/l葡萄糖、0.2g/l硝酸钠、0.8g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、1g/l芸苔素、0.175g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、5mg/l氯化铁、0.025g/l氯化钙、0.17mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸铵、0.06mg/l硼酸。
27.半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的
20％(v/v)盐酸溶液，在90℃下水解3h，加入30％(v/v)氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。
28.实施例3诱导藻类高效合成虾青素的方法
29.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
30.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9g/l葡萄糖、0.1g/l硝酸钠、0.8g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、1g/l芸苔素、0.18g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0035mg/l硫酸铜、7mg/l氯化铁、0.035g/l氯化钙、0.29mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸铵、0.08mg/l硼酸。
31.半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的20％(v/v)盐酸溶液，在90℃下水解3h，加入30％(v/v)氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。
32.实施例4诱导藻类高效合成虾青素的方法
33.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
34.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9g/l葡萄糖、0.1g/l硝酸钠、0.8g/l半乳糖氧化酶、1g/l芸苔素、0.18g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、7mg/l氯化铁、0.035g/l氯化钙、0.29mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸铵、0.08mg/l硼酸。
35.实施例5诱导藻类高效合成虾青素的方法
36.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
37.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9g/l葡萄糖、0.1g/l硝酸钠、0.8g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、0.18g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、7mg/l氯化铁、0.035g/l氯化钙、0.29mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸铵、0.08mg/l硼酸。
38.半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的20％(v/v)盐酸溶液，在90℃下水解3h，加入30％(v/v)氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。
39.实施例6诱导藻类高效合成虾青素的方法
40.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
41.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9g/l葡萄糖、0.1g/l硝酸钠、1g/l芸苔素、0.18g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、7mg/l氯化铁、0.035g/l氯化钙、0.29mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸
铵、0.08mg/l硼酸。
42.实施例7诱导藻类高效合成虾青素的方法
43.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
44.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9g/l葡萄糖、0.1g/l硝酸钠、0.8g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、1g/l芸苔素、0.18g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0035mg/l硫酸铜、7mg/l氯化铁、0.035g/l氯化钙、0.29mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸铵、0.08mg/l硼酸。
45.半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的20％(v/v)盐酸溶液，在100℃下水解6h，加入30％(v/v)氢氧化钠溶液中和，收集分子量＜0.5kda的产物，减压浓缩去除水分。
46.对比例诱导藻类高效合成虾青素的方法
47.将雨生红球藻种子液接种至诱导培养基中，藻细胞的接种密度为107cell/l，进行光诱导培养；培养条件为：转速为500r/m，温度为26
±
5℃、光源采用蓝色的led灯串联并排放置，控制光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h，培养12天。
48.所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9g/l葡萄糖、0.1g/l硝酸钠、0.18g/l磷酸二氢钾、0.08g/l岩藻糖、0.025g/l硫酸镁、0.0035mg/l硫酸铜、7mg/l氯化铁、0.035g/l氯化钙、0.29mg/l硫酸锰、0.025g/l氯化钠、0.3mg/l硫酸锌、0.0012mg/l钼酸铵、0.08mg/l硼酸。
49.虾青素含量测定方法：
50.培养结束后，取藻液，离心收集细胞，冷干，称重，计算细胞生物量。细胞生物量/(g/l)＝藻粉干重(g)/藻液体积(l)。采用高效液相色谱法测定雨虾青素的含量，方法如下：
51.色谱条件：
52.色谱柱为c18柱(waters，25cm
×
4.6mm，5mm)，流动相为体积比8.5：1：0.5的丙酮-乙腈-水；流速1.0ml/min；测定波长480nm。
53.标准曲线测定：配制不同浓度虾青素标准品溶液，采用以上色谱条件测定峰面积，获得虾青素标准曲线方程。
54.待测品测定：取藻液，离心收集藻细胞，水洗，加入5ml甲醇-二氯甲烷(体积比3：1)，冰水浴下匀浆，匀浆液低温离心，收集上清。重复提取至沉淀物呈现无色为止。将上清用高效液相色谱仪测定，积分得到虾青素峰面积，将峰面积代入虾青素标准曲线方程，计算虾青素质量浓度。根据虾青素质量浓度和细胞生物量计算虾青素含量。虾青素含量(mg/g)＝虾青素质量浓度(mg/l)/细胞生物量(g/l)
55.检测结果：
[0056] 细胞生物量g/l虾青素含量mg/g实施例10.6141.4实施例20.6535.8实施例30.6039.9实施例40.5834.3
实施例50.5930.5实施例60.6032.1实施例70.6136.7对比例0.5627.4
[0057]
注：n＝10，平行测试10组。
[0058]
与实施例3相比，实施例4添加的是未水解的半乳糖氧化酶，实施例5未添加芸苔素，实施例6未添加半乳糖氧化酶的酸水解产物，实施例7添加的水解物有所不同，对比例未添加半乳糖氧化酶的酸水解产物和芸苔素。经检测，实施例藻粉中虾青素含量均达30mg/g以上，显著高于对比例。
[0059]
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种诱导藻类高效合成虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：将藻种子液接种至诱导培养基中，进行光诱导培养；所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9～30g/l葡萄糖、0.1～0.2g/l硝酸钠、0.8～2.2g/l半乳糖氧化酶或半乳糖氧化酶的酸水解物和/或1～3g/l芸苔素、0.18～0.23g/l磷酸二氢钾、0.08～0.12g/l岩藻糖、0.025～0.035g/l硫酸镁、0.0025～0.0035mg/l硫酸铜、5～7mg/l氯化铁、0.025～0.035g/l氯化钙、0.17～0.29mg/l硫酸锰、0.025～0.036g/l氯化钠、0.3～0.7mg/l硫酸锌、0.0012～0.0018mg/l钼酸铵、0.06～0.08mg/l硼酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于盐酸溶液，在90-100℃下水解3-6h，加入氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，半乳糖氧化酶的酸水解产物由以下方式制成：将半乳糖氧化酶溶于10倍体积的20v/v％盐酸溶液，在90℃下水解3h，加入氢氧化钠溶液中和，收集分子量0.5-1kda的产物，减压浓缩去除水分。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：30g/l葡萄糖、0.2g/l硝酸钠、2.2g/l半乳糖氧化酶的酸水解产物、3g/l芸苔素、0.23g/l磷酸二氢钾、0.12g/l岩藻糖、0.035g/l硫酸镁、0.0025mg/l硫酸铜、5mg/l氯化铁、0.025g/l氯化钙、0.17mg/l硫酸锰、0.036g/l氯化钠、0.7mg/l硫酸锌、0.0015mg/l钼酸铵、0.06mg/l硼酸。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光为蓝光，光照强度为1600
±
100lx，光暗周期为20:4h。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻为雨生红球藻。

技术总结
本发明公开了一种诱导藻类高效合成虾青素的方法。该方法包括以下步骤：将藻种子液接种至诱导培养基中，进行光诱导培养；所述诱导培养基包括半乳糖氧化酶、半乳糖氧化酶的酸水解物、芸苔素等成分。本发明方法可大大提高藻细胞内虾青素的产量和产率，方法简便，能耗低，有效降低生产成本，容易产业化推广，在利用藻类合成天然虾青素方面具有重要应用价值。类合成天然虾青素方面具有重要应用价值。


技术研发人员：袁用华 曾顺辉 赵冬瑞 王紫芬
受保护的技术使用者：海南春蕾海洋生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/10/5