粪便中与肠道氧化应激有关菌种的特异性引物组和检测定量方法

1.本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及粪便中与肠道氧化应激有关菌种的特异性引物组合检测定量方法。


背景技术：

2.肠道微生物群落是人类肠道内共生的微生物群落，其在维护人体健康和代谢疾病的发生发展方面具有重要作用。肠道微生物与肠道氧化应激之间密切联系，并且某些菌群对氧化应激反应的调节具有重要作用。开发一种能够准确检测与氧化应激反应有关的菌群的定量方法，对于深入研究肠道微生物与氧化应激反应的相互作用有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种基于粪便样本中与氧化应激有关的菌种进行绝对定量检测的方法，主要以多氏拟杆菌(bacteroides dorei)、埃氏拟杆菌(bacteroides eggerthii)、粪便拟杆菌(bacteroides stercoris)、鲍氏梭菌(clostridium bolteae)、挑剔真杆菌(eubacterium eligens)、普拉梭菌(faecalibacterium prausnitzii)、肠道罗斯拜瑞氏菌(roseburia intestinalis)、纤维素类杆菌(bacteroides cellulosilyticus)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、普氏梭杆菌(flavonifractorplautii)等与肠道氧化应激有关的菌种作为检测对象。
4.本发明的目的通过以下技术方案实现：
5.用于检测粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的引物组，所述菌株为多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌；所述引物组序列如seq id no：1～20所示。
6.本发明还提供用于绝对定量粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
7.本发明还提供用于绝对定量粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的标准曲线，当所述菌株为多氏拟杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.2149x+40.002，r2＝0.9933；当所述菌株为埃氏拟杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.0832x+36.1，r2＝0.9948；当所述菌株为粪便拟杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.5985x+39.991，r2＝0.9961；当所述菌株为鲍氏梭菌，其标准曲线公式为y＝-3.6154x+40.294，r2＝0.9945；当所述菌株为挑剔真杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.5024x+39.553，r2＝0.9979；当所述菌株为普拉梭菌，其标准曲线公式为y＝-3.3924x+39.505，r2＝0.9982；当所述菌株为肠道罗斯拜瑞氏菌，其标准曲线公式为y＝-3.2937x+37.166，r2＝0.9983；当所述菌株为纤维素类杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.1288x+36.852，r2＝0.999；当所述菌株为丁酸梭菌，其标准曲线公式为y＝-3.5617x+39.366，r2＝0.9957；当所述菌株为普氏梭杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.3396x+37.344，r2＝0.999。
8.本发明还提供引物组或/和所述试剂盒或/和所述标准曲线在对粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种进行绝对定量中的应用。
9.本发明还提供一种用于绝对定量粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的方法，包括以下步骤：
10.s1、采集人粪便样本进行基因组提取；
11.s2、以人粪便样本基因组为模板，以权利要求1所述引物组对模板进行扩增，得到扩增曲线的ct值；
12.s3、对应权利要求3所述的标准曲线，根据样本的ct值和拷贝数之间的转换关系，得出样本中对应菌株的拷贝数。
13.优选的，s2扩增的反应体系为：2x sybr qpcr master mix 10μl，引物各0.4μl，ddh2o8.2μl，模板1μl。
14.优选的，s2扩增的反应条件为：95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s；40个循环。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.本发明该方法基于qpcr技术平台，针对不同菌种设计特异引物，结合标准曲线法对粪便样品中目标菌群的定量进行精准、快速、可靠的检测。
17.应用本发明提供的方法，我们可以评估肠道内菌群的代谢功能，并为人们调整饮食结构、预防代谢相关疾病提供重要的指导。了解肠道微生物与氧化应激之间的相互作用对于我们更好地理解人体健康和疾病发展之间的关系至关重要。通过本发明的方法，我们验证了在不同动物粪便中，多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌等菌种的强特异性。这意味着这一方法在不同动物粪便样本中具备高度的准确性和特异性。因此，应用这一创新技术将为相关领域的研究和临床实践提供有力的支持，为我们提供更深入的了解和干预手段。这一方法具有潜力在健康管理和疾病预防方面发挥重要作用，为个体化医疗和微生物介入治疗提供新的突破。
附图说明
18.图1为实施例1中的特异性引物设计流程图；
19.图2是实验例2中实时荧光pcr引物特异性试验扩增曲线图；
20.图3是实验例2中实时荧光pcr引物特异性试验熔解曲线图；
21.图4是实验例3中实时荧光pcr标准曲线图；
22.图5是实验例4中迟缓埃格特菌、粪拟杆菌、内脏气味杆菌在人类粪便中的存在量；
23.图6是实验例5中不同物种来源的粪便基因组的实时荧光pcr熔解曲线图；
24.图7是实验例5中不同物种来源的粪便基因组的实时荧光pcr熔解曲线图。
具体实施方式
25.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
26.实施例1引物对的设计和初步验证
27.根据https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc5860091/，选择了本发明针对十种与氨基酸合成相关的肠道菌群(多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌)选择了相应的引物，以实现对这些菌种的绝对定量检测。
28.本实施例中初步验证合格的引物对的序列如表1所示。
29.表1
30.31.32.[0033][0034]
引物设计完成后先利用在ncbi网站的primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)和nucleotide blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)对引物及引物所对应的特异性产物的特异性进行初步评价。
[0035]
实施例2进一步检测引物特异性
[0036]
本实施例的模板：采集人类粪便样本，称取约250mg的粪便样本置于2ml离心管中，采用qiaamp powerfecal pro dna kits对人的粪便基因组进行提取，提取完成后，对粪便基因组的浓度利用紫外分光光度仪nanovue plus进行测定，模板量控制30ng/l反应以上，od260/280控制在1.8至2.0之间。
[0037]
本实施例的实时荧光pcr反应体系见表2。
[0038]
其中，sybr实时荧光pcr反应的扩增程序为：95℃，30s；95℃，10s 60℃，30s，72℃，30s，40个循环，熔解曲线的反应程序为：95℃，10s；65℃，60s；97℃，1s，1个循环。
[0039]
表2sybr实时荧光pcr反应体系
[0040][0041][0042]
以人的粪便基因组为模板，荧光定量pcr为技术手段检测多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸
梭菌、普氏梭杆菌引物及其产物的特异性。首先按照实例中的扩增程序对引物进行扩增，如图2所示每对引物设置两个加入模板的技术重复和一个不加模板的空白对照，确认引物对不会产生引物二聚体；其次按照实例中的熔解曲线的反应程序对产物进行荧光定量pcr扩增时得到的产物熔解，然而因粪便含量较为复杂，送测产物的浓度太低就可能导致测序失败，因此利用荧光定量pcr进行初步扩增后再利用pcr进行再次扩增，富集产物。以荧光定量pcr中的熔解曲线是否为单峰为判断依据如图3所示，进一步确定引物及其产物的特异性，如为单峰则认为其产物具有较高的特异性，将富集产物送去测序公司测序，最终确认其特异性。
[0043]
本实施例中最终验证合格的引物对的序列如表3所示。
[0044]
表3
[0045][0046][0047]
实施例3实时荧光pcr标准曲线的构建和检测限的划定
[0048]
将实施例3验证完成的特异性产物送到擎科生物有限公司(南京)合成并将其克隆的puc-19上，提取重组质粒，将重组质粒梯度稀释成50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μ
l、0.005ng/μl、0.0005ng/μl、0.00005ng/μl、0.000005ng/μl、0.0000005ng/μl、0.00000005ng/μl共十个浓度梯度，各1μl进行pcr扩增，反应条件与程序如实施例2所述。
[0049]
结果：qpcr得到的10株菌的qpcr扩增活菌数对数lgcfu与ct值的关系如图4所示，由标准曲线可知这10株菌的ct值检测范围在6～33之间，具有很高的灵敏度与特异性。
[0050]
实施例4多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌在人类粪便中的存在量
[0051]
采集人类粪便，使用粪便基因组提取试剂盒提取粪便中的基因组，使用实施例2的方法对提取得到的基因组进行qpcr扩增，得到各粪便的ct值，将获得ct值代入实施例3获得的绝对定量标准曲线，得到粪便中多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌的绝对含量，具体可见图5。
[0052]
实施例5在不同物种粪便样本中的特异性验证
[0053]
随机采集猪、牛、兔、狗、鸡、猫、羊、鼠的粪便各三份共24份按照实例2中所述的方法，提取粪便基因组，24个样品中各取80ng进行扩增与熔解试验。
[0054]
结果：不同物种之间的肠道菌群组成可能存在差异，这可能会影响到这十种菌在不同物种的粪便样本中的存在丰度和特异性。10株菌的特异性引物在不同物种来源的粪便样本的特异性如图6、7所示，熔解曲线平滑单峰，ct值在6-33之间则判断为阳性结果，纤维素类杆菌的特异性引物主要对：牛、羊、狗表现出高特异性；多氏拟杆菌的特异性引物主要对：牛、兔、猪表现出高特异性；埃氏拟杆菌的特异性引物主要对：鸡、鼠、兔、羊表现出高特异性；粪便拟杆菌的特异性引物主要对：猫、牛、鸡、狗、鼠表现出高特异性；鲍氏梭菌特异性引物主要对：牛、鸡、鼠、羊表现出高特异性；挑剔真杆菌特异性引物主要对：牛、狗、羊、猫表现出高特异性；普拉梭菌特异性引物主要对：猫、鼠、羊、兔表现出高特异性和肠道罗斯拜瑞氏菌的特异性引物主要对：牛、鸡、狗表现出高特异性；普氏梭杆菌的特异性引物主要对：猫、兔、狗表现出高特异性；纤维素类杆菌特异性引物主要对：猫、牛、羊、兔、猪、鼠、猫表现出高特异性；丁酸梭菌的特异性引物主要对：鸡、兔表现出高特异性。
[0055]
本发明建立了多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌引物的实时荧光pcr绝对定量检测方法，针对多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌引物特异基因设计引物，结合实时熔解曲线图与标准曲线，精准定量粪便样本中的菌种丰度。
[0056]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.用于检测粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的引物组，其特征在于，所述菌株为多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌；所述引物组序列如seq id no：1～20所示。2.用于绝对定量粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。3.用于绝对定量粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的标准曲线，其特征在于，当所述菌株为多氏拟杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.2149x+40.002，r2＝0.9933；当所述菌株为埃氏拟杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.0832x+36.1，r2＝0.9948；当所述菌株为粪便拟杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.5985x+39.991，r2＝0.9961；当所述菌株为鲍氏梭菌，其标准曲线公式为y＝-3.6154x+40.294，r2＝0.9945；当所述菌株为挑剔真杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.5024x+39.553，r2＝0.9979；当所述菌株为普拉梭菌，其标准曲线公式为y＝-3.3924x+39.505，r2＝0.9982；当所述菌株为肠道罗斯拜瑞氏菌，其标准曲线公式为y＝-3.2937x+37.166，r2＝0.9983；当所述菌株为纤维素类杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.1288x+36.852，r2＝0.999；当所述菌株为丁酸梭菌，其标准曲线公式为y＝-3.5617x+39.366，r2＝0.9957；当所述菌株为普氏梭杆菌，其标准曲线公式为y＝-3.3396x+37.344，r2＝0.999。4.权利要求1引物组或/和权利要求2所述试剂盒或/和权利要求3所述标准曲线在对粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种进行绝对定量中的应用。5.一种用于绝对定量粪便样本中与肠道氧化应激有关的菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、采集人粪便样本进行基因组提取；s2、以人粪便样本基因组为模板，以权利要求1所述引物组对模板进行扩增，得到扩增曲线的ct值；s3、对应权利要求3所述的标准曲线，根据样本的ct值和拷贝数之间的转换关系，得出样本中对应菌株的拷贝数。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，s2扩增的反应体系为：2x sybr qpcr master mix 10μl，引物各0.4μl，ddh2o 8.2μl，模板1μl。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，s2扩增的反应条件为：95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s；40个循环。

技术总结
本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及粪便中与肠道氧化应激有关菌种的特异性引物组合检测定量方法，通过本发明的方法，我们验证了在不同动物粪便中，多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、粪便拟杆菌、鲍氏梭菌、挑剔真杆菌、普拉梭菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、纤维素类杆菌、丁酸梭菌、普氏梭杆菌等菌种的强特异性。这意味着这一方法在不同动物粪便样本中具备高度的准确性和特异性。因此，应用这一创新技术将为相关领域的研究和临床实践提供有力的支持，为我们提供更深入的了解和干预手段。这一方法具有潜力在健康管理和疾病预防方面发挥重要作用，为个体化医疗和微生物介入治疗提供新的突破。新的突破。新的突破。


技术研发人员：孙坚 朱婷婷 何冰
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/10/6