一种通过ARTP提高Ashbyagossypii核黄素生产能力的方法

一种通过artp提高ashbya gossypii核黄素生产能力的方法
技术领域
1.本发明涉及真菌技术领域，具体为一种通过artp提高ashbya gossypii核黄素生产的方法。


背景技术：

2.核黄素(riboflavin)又称维生素b2，是人体必须的13种维生素之一。核黄素在水溶液中溶解性较低，但在碱性溶液中容易溶解，光照及紫外照射均会引起不可逆的分解。在生物体内它以黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的形式存在，直接参与碳水化合物、蛋白质和脂肪的生物氧化作用。微生物和植物可以内源性产生核黄素，但大部分动物和人无法在体内合成，因此必须通过食品或膳食补充剂来提供核黄素，如牛奶、肉类、鸡蛋、坚果、营养面粉和绿色蔬菜等。对于19岁至70岁的成年男性和女性核黄素的平均需求量为0.9-1.1毫克/天，推荐摄入量为1.1-1.3毫克/天，1-9岁儿童和10-18岁青少年推荐摄入量分别为0.5-0.6毫克/天和0.9-1.3毫克/天。日常饮食中核黄素摄入不足会损害粘膜、皮肤、眼睛和神经系统的完整性，长期缺乏核黄素可导致多种临床异常，包括生长迟缓、贫血、皮肤损伤、肾脏损伤和神经系统退行性改变。另外，核黄素还参与增强许多抗癌药物的抗肿瘤活性，以及激活免疫系统杀死肿瘤细胞，因而在食品和医药工业等方面具有广泛的应用前景。
3.近年来，核黄素的市场需求不断增加。工业上生产核黄素主要经历了全化学合成、半化学合成和微生物合成三个阶段。微生物合成法因其成本低、生产周期短、产品纯度较高等优点成为国内外工业生产核黄素的发展趋势。
4.目前，工业生产核黄素菌株主要为棉囊阿舒氏酵母(ashbya gossypii)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。其他微生物如大肠杆菌等已通过代谢工程改造具有过量合成核黄素的能力，但这类工业菌株在构建的过程中需要使用抗生素基因，对于食品级和饲料级的核黄素产品存在争议，并且也没有将常压室温等离子体(artp)诱变技术与棉阿舒囊霉的选育上，限制了高性能棉阿舒囊霉的制备方法，因此诱变选育技术是提高棉阿舒囊霉核黄素生产能力较直接且有效的方式。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种通过artp提高ashbya gossypii核黄素生产的方法，通过棉阿舒囊霉变异后进行筛选，获取一株棉阿舒囊霉变异菌株ag-85。
6.为实现上述目的，本发明采用了以下的技术手段：
7.一株棉阿舒囊霉变异菌株ag-85，具有以下基因序列：
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9.所述棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的制备方法，包括以下步骤
10.(1)将斜面培养的棉阿舒囊霉接种到发酵培养基中进行摇瓶培养得到野生棉阿舒囊霉菌悬液；
11.(2)对野生棉阿舒囊霉菌悬液进行artp诱变：用移液枪移取10μl菌悬液均匀涂抹于直径为6mm的无菌金属片上，置于artp诱变仪中，并设置如下操作参数：电源功率110w，处理距离2mm，工作气流量10slpm，以氦气为工作气体；诱变处理结束后，将金属片分别放入装有1ml无菌水的ep管中，重悬金属片上的菌悬液，取100μl重悬液涂布于固体平板上，置于28℃培养箱中培养3-5d；
12.(3)棉阿舒囊霉诱变菌株的筛选：对突变后的棉阿舒囊霉进行筛选，选取培养基中黄色强度大且菌落直径大的菌株；
13.步骤(1)所述摇瓶培养条件为：26-28℃，200-220rpm，20-24h。
14.步骤(1)所述发酵培养基按以下方法制备：每升发酵培养基含蛋白胨10g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，肌醇1g。
15.所述固体平板上的固体培养基按以下方法制备：每升固体培养基含蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖20g，麦芽提取物3g，琼脂20g。
16.所述棉阿舒囊霉诱变菌株ag-85在核黄素生产中的应用。
17.本发明获得的有益效果是：通过常压室温等离子体对棉阿舒囊酶(ashbya gossypii atcc10859)进行诱变，成功筛选到一株生长饱满且核黄素产量提高的优良菌株ag-85，在摇瓶水平上发酵168h，核黄素产量较出发菌株高出26.6％，在检测传代六次的核黄素产量后，该诱变菌株具有良好的遗传稳定性，该方法为获取高产量棉阿舒囊酶菌株提供了一种新型研究方法，提高了棉阿舒囊酶的应用能力。
附图说明
18.图1为棉阿舒囊酶的生长曲线图；
19.图2为棉阿舒囊酶在不同artp处理时间下的致死率；
20.图3为所获得的突变菌株遗传稳定性。
具体实施方式
21.下面结合附图对本发明进行描述。
22.本发明所述的一株棉阿舒囊霉变异菌株ag-85，具有以下基因序列：
23.ttttccgtagagggggggctgcggaaggatcattatagaaatgattggacagttctgggatgcaaagttctgcctgcgcttaattgcgcggcggcgctatgtatctgctatcagagctgtcttaccaacacacatgtagtttctactatgcttttcttcctgggctgtcatggcccagggacaaacacaaacaaaaattttgaaaactagtcaaatctat
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24.所述的一株棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的制备方法，包括以下步骤：
25.(1)将斜面培养的棉阿舒囊霉接种到发酵培养基中进行摇瓶培养得到野生棉阿舒囊霉菌悬液；具体操作如下：将长势良好的棉阿舒囊霉单菌落接种于摇瓶发酵培养基中，将长势良好的棉阿舒囊霉单菌落接种于摇瓶发酵培养基中，摇瓶发酵培养基的配方为每升蛋白胨10g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，肌醇1g，保持摇床培养条件为200-220rpm和26-28℃，在该条件下发酵生长20-24h得到野生棉阿舒囊霉菌悬液。用血球计数板在光学显微镜下计数得到菌体数在10
5-107个/ml的野生棉阿舒囊霉菌悬液。
26.(2)对野生棉阿舒囊霉菌悬液进行artp诱变：artp仪提前进行紫外灭菌并预热20min，用移液枪移取10μl菌悬液均匀涂抹于直径为6mm的无菌金属片上，置于artp诱变仪中，以氦气为工作气体，并设置如下操作参数：电源功率100w，处理距离2mm，工作气流量10slm，选择artp的诱变时间设定为：0s，10s，20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s。诱变处理结束后，将金属片分别放入装有990μl生理盐水的ep管中，重悬金属片上的菌悬液后取100μl重悬液涂布于固体平板上，固体培养基的配方为每升蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖20g，麦芽提取物3g，琼脂20g，然后置于28℃培养箱中培养3d-5d。
27.(3)棉阿舒囊霉诱变菌株的筛选：对突变后的棉阿舒囊霉进行筛选，选取培养基中黄色强度大且菌落直径大的菌株；观察诱变处理前后菌株的生长情况，根据单菌落的形态大小及黄色颜色强度初步筛选出产量提高的菌株即为棉阿舒囊霉变异菌株ag-85。再将这些菌株接种到发酵培养基中，通过摇瓶复筛确定菌株的核黄素产量。
28.artp诱变致死率
29.artp诱变致死率的计算的步骤，包括：分别对诱变处理前后的平板进行计数，根据以下公式进行计算：
30.致死率(％)＝(a-b)/a
×
100％
31.式中，a为诱变处理时间为0s时平板上的菌落数；b为不同诱变处理时间下平板上的菌落数。
32.通过计算，棉阿舒囊酶在不同artp处理时间下的致死率如图2所示。
33.核黄素产量的测定
34.核黄素产量的测定的步骤，包括：通过分光光度法测量不同处理条件下发酵液中的核黄素产量。将培养样品用0.05mol/l naoh(1:4)稀释至紫外分光光度计的线性范围，并以12000rpm离心10min除去细胞，立即在445nm下比色测量无细胞上清液的吸光度。用纯核黄素标准品做标准曲线(y＝0.0149x-0.0127，r2＝0.9992)，通过比对不同样品吸光度确定发酵液中的核黄素浓度。
35.棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的遗传稳定性
36.所述棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的遗传稳定性实验的步骤，包括：将复筛得到核黄素产量较高的突变菌株接入发酵培养基中，在恒温振荡培养箱28℃、220r/min、发酵周期7d的条件下连续传代培养6代，并测定其在传代培养过程中各代的核黄素产量，从而确定所得菌株产核黄素能力及遗传稳定性，结果如图3所示。结果表明，经过连续传代培养6代，其具有良好的遗传稳定性，说明经artp诱变能够提高菌株产核黄素能力，得到的突变菌株有较强产核黄素能力和良好的遗传稳定性。

技术特征：
1.一株棉阿舒囊霉变异菌株ag-85，其特征在于：具有以下基因序列：ttttccgtagagggggggctgcggaaggatcattatagaaatgattggacagttctgggatgcaaagttctgcctgcgcttaattgcgcggcggcgctatgtatctgctatcagagctgtcttaccaacacacatgtagtttctactatgcttttcttcctgggctgtcatggcccagggacaaacacaaacaaaaattttgaaaactagtcaaatctatttcattagaaataaaatcttcaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaagaacgcagcgaattgcgataagtattgtgaattgcagattttcgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgtcctctggtattccagggggcatgcctgtttgagcgtcatttccttctcaaaccctcgggtttggtaatgagtgatactcggtcgtaagacaaggttaacttgaaaatgctggccatgggcggaacttgcgcggactgcggtctgagctagtttctacactgcgtattaggtttcgaccagatcgtggagtggagctggcgcttgaagaacgtacgacaaacaaggccttccaggcgaatagtattcccaaagtttgacctcaaatcaggtaggattacccgctgaacttaagcatatcgaaaccgcgagagagaaaaagaaatcat。2.权利要求1所述棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将斜面培养的棉阿舒囊霉接种到发酵培养基中进行摇瓶培养得到野生棉阿舒囊霉菌悬液；(2)对野生棉阿舒囊霉菌悬液进行artp诱变：用移液枪移取10μl菌悬液均匀涂抹于直径为6mm的无菌金属片上，置于artp诱变仪中，并设置如下操作参数：电源功率110w，处理距离2mm，工作气流量10slpm，以氦气为工作气体；诱变处理结束后，将金属片分别放入装有1ml无菌水的ep管中，重悬金属片上的菌悬液，取100μl重悬液涂布于固体平板上，置于28℃培养箱中培养3-5d；(3)棉阿舒囊霉诱变菌株的筛选：对突变后的棉阿舒囊霉进行筛选，选取培养基中黄色强度大且菌落直径大的菌株。3.根据权利要求2所述棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的诱变方法，其特征在于：步骤(1)所述摇瓶培养条件为：26-28℃，200-220rpm，20-24h。4.根据权利要求2所述棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的诱变方法，其特征在于：步骤(1)所述发酵培养基按以下方法制备：每升发酵培养基含蛋白胨10g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，肌醇1g。5.根据权利要求2所述棉阿舒囊霉变异菌株ag-85的诱变方法，其特征在于：所述固体平板上的固体培养基按以下方法制备：每升固体培养基含蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖20g，麦芽提取物3g，琼脂20g。6.权利要求1所述棉阿舒囊霉诱变菌株ag-85在核黄素生产中的应用。

技术总结
本发明公开了一种通过ARTP提高Ashbyagossypii核黄素生产能力的方法，涉及真菌技术领域，以棉阿舒囊霉(AshbyagossypiiATCC10859)为出发菌株，经常压室温等离子体(ARTP)诱变后筛选得到AG-85菌株，再通过AG-85菌株提高核黄素生产能力。本发明得到的棉阿舒囊霉AG-85在摇瓶水平上发酵7天后，核黄素水平可达到730.1mg/L，较出发菌株提高26.6％。且当菌株连续传代6次后，核黄素生产水平几乎保持稳定。该方法为获取高产量棉阿舒囊霉提供了一种新型研究方法，提高了棉阿舒囊霉的工业应用潜力。囊霉的工业应用潜力。


技术研发人员：李坚斌 陈亮 叶丽莎 李凯 黄智 邓立高 周昊
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/10/6