一株硫自养反硝化菌及其扩培方法与应用与流程

1.本发明涉及生物工程及环境工程技术领域，具体为一株硫自养反硝化菌及其扩培方法与应用。


背景技术：

2.硝酸盐是自然水体和生活废水中常见的污染物，不仅会导致水体的富营养化，还对饮用水安全造成严重威胁。硝酸盐的处理方法有离子交换法、反渗透法、化学还原法、吸附法和生物法。生物法除硝酸盐相较于其他物理、化学法除硝酸盐工艺运行成本低，不会造成二次污染，是最具效益和可行性的硝酸盐去除工艺之一。
3.生物脱氮法主要分为异养反硝化工艺和自养反硝化工艺，异养反硝化工艺以有机物为电子供体，硝酸盐氮为电子受体，在缺氧条件下将硝酸盐氮转化为氮气，而我国目前废水脱氮所面临的最大问题是c/n低，在反应过程中需要额外投加甲醇、乙酸钠等有机碳源，易造成运行费用及污泥处置成本增加。自养反硝化工艺以氢、铁、硫等基质为电子供体，硝酸盐氮为电子受体，碳酸根为无机碳源，在缺氧条件下将硝酸盐氮转化为氮气。自养反硝化工艺相较于异养反硝化工艺反应过程无需额外投加碳源，反应产生污泥量少，因而该技术成为了现代生物脱氮技术的热点研究方向，且硫自养反硝化技术相较于氢、铁两种自养反硝化技术自养反硝化效果好且更易实现工程化，国内外已经出现了小规模工程化应用。
4.据文献报道，硫自养反硝化技术涉及的主要菌株为硫杆菌属及硫单胞菌属，两个菌属的菌均为严格化能自养型菌，该技术涉及的主要电子供体为硫磺、黄铁矿等，该技术涉及的主要无机碳源主要为菱铁矿、石灰石等。如中国专利号cn114480209a，该申请案公开了一种发酵生产自养型脱氮菌剂的生产工艺，该方案通过将厌氧污泥训化，筛选得到含有硫单细胞菌属(sulfurimanas)和嗜甲基菌目(methylophilales)复合菌，复合菌通过两级扩培后制得自养型脱氮菌剂，投加至以青石、菱铁矿和单质硫作为填料的上升式反应器内，处理no
3-‑
n＝200-250mg/l的实际废水，室温下运行4周后no
3-‑
n去除率达到95％以上，虽然取得较好的处理效果，但启动运行过程停留时间过长。又如中国专利号cn103626293a，该申请案公开了一种天然磁黄铁矿生物滤池以及利用其同步去除水中硝氮和磷的方法，该方案通过在反应器内加入黄铁矿颗粒，加入营养液和厌氧污泥驯化一段时间后，系统能够对于no
3-‑
n＝20-50mg/l的废水有较好的脱氮效果，但系统需要较长的驯化时间且no
3-‑
n＞50mg/l时，系统no
3-‑
n去除效果明显变差。再如中国专利号cn107176702a，该申请案公开了一种强化硫自养反硝化过程同步脱氮除磷的污水处理方法，该方案通过将自养反硝化菌剂投加至以黄铁矿、菱铁矿和硫磺作为填料的序批式反应器内，在加入废水后在系统中吹扫保护性气体来营造厌氧环境，当系统进水no
3-‑
n为80mg/l，停留时间为15d时，no
3-‑
n去除率达到100％，废水停留时间过长且废水进系统后需要吹扫保护气来营造厌氧环境使得该方案难以实现工程化应用。综上所述，目前关于硫自养反硝化的工艺普遍存在培菌成本高、启动速度慢、挂膜周期长、启动后系统自养反硝化速率低及运行过程中停留时间长的特点。


技术实现要素：

5.1.发明要解决的问题
6.针对现有生物脱氮工艺中的异养反硝化工艺在废水c/n低时，需在反应过程中需要额外投加甲醇、乙酸钠等有机碳源，易造成运行及污泥处置成本增加；自养反硝化工艺氢、铁自养反硝化工艺难以工程化实现；硫自养反硝化的工艺普遍存在培菌成本高、启动速度慢、挂膜周期长、启动后系统自养反硝化速率低及运行过程中停留时间长的问题。本发明提供一株硫自养反硝化菌及其扩培方法与应用来解决上述问题。
7.2.技术方案
8.为达到上述目的，本发明提供的方案为：
9.一株硫自养反硝化菌，该菌株为副球菌paracoccus sp.sad-4，保藏编号为cgmccno.26352，于2022年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
10.一种前述菌株的扩培方法，包括以下步骤：
11.(1)挑取活化后的副球菌paracoccus sp.sad-4菌落接种于种液培养基中，在30-35℃、100-200r/min恒温震荡摇床培养24-96h，制得该菌的种子液；
12.(2)将种子液以扩培培养基体积1-10％的接种量接种于扩培培养基a或者扩培培养基b，在30-35℃、ph7-8、好氧培养24-48h，即制得菌液。
13.优选地，前述步骤(1)中种液培养基组分为：na2s2o3.5h2o 10g、nano
3 4g、kh2po42g、nahco
3 2g、mgso
4 0.5g、feso4.7h2o 0.05g、mnso
4 0.01g、nacl 0.5g、nh4cl 0.5g、自来水1l，培养基使用前于121℃、0.1mpa灭菌30min。
14.优选地，所述步骤(2)中扩培培养基a的组分：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl 10g、自来水1l；
15.或者，所述步骤(2)中扩培培养基b的组分：葡萄糖6g、复合氨基酸5g、kh2po
4 0.6g、k2hpo
4 0.4g、mgso
4 0.2g、nacl 0.2g、naoh 0.35g、自来水1l；
16.培养基使用前于121℃、0.1mpa灭菌30min。
17.一株前述菌株在投加填料的硫自养反硝化反应器内挂膜后在缺氧条件下对于废水中的no
3-‑
n及no
2-‑
n完全自养降解的应用。
18.优选地，硫自养反硝化反应器内填料组分：硫磺颗粒占填料总体积30-70％，粒径1-5目；青石占填料总体积10-30％，粒径1-5目；菱铁矿石占填料总体积20-50％，粒径1-5目；填料填充量为50-100％(v/v)。硫磺为3目，青石为5目，菱铁矿石为5目，硫磺、青石和菱铁矿石的体积占比为5：2：3。(硫自养反硝化填料的填充量是根据填料堆积体积/硫自养反硝化反应器的空床有效池容计算，当硫自养反硝化填料的填充量为空床有效池容的100％体积时，硫自养反硝化反应器上方仍有余量空间，包括管路空间)。
19.优选地，前述挂膜包括以下步骤：
20.s1、硫自养反硝化反应器在填充填料后补入挂膜营养液，营养液投加至没过填料层顶端10-20cm。
21.s2、将菌液以反应器有效体积5
‰‑
2％的投加量加入反应器中，在25-35℃曝气运行48-96h，运行至混合液od
600
值＜0.1时，挂膜完成。
22.优选地，前述步骤s1中，挂膜营养液组分葡萄糖2g、nh4cl 0.19g、kh2po
4 0.044g、
nahco
3 1g、自来水1l。
23.3.有益效果
24.采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：
25.(1)本发明开发硫自养反硝化菌株副球菌paracoccus sp.sad-4属于兼性自养、兼性好氧菌，在无机、有机培养基内缺氧、好氧环境下均能生长。相较于目前硫自养反硝化工艺中主流菌株硫杆菌属及硫单胞菌属，能利用有机碳源在好氧条件下快速生长，极大缩短了培养时间，提高了菌种数量，降低了扩培成本。
26.(2)菌株在以硫磺、青石、菱铁矿为填料的硫自养反硝化反应器内，通过短周期挂膜后即可处理含高no
3-‑
n废水，相较于其他硫自养反硝化工艺启动时间缩短，系统的自养反硝化速率高。
附图说明
27.图1为菌株paracoccus sp.sad-4经三种培养基扩培后菌液的自养反硝化活性对比图。
28.图2为硫自养反硝化填料的不同配比对于反应器脱氮效果影响示意图。
29.图3为投加菌液后不同启动方式对于反应器脱氮效果影响示意图。
30.图4为挂膜启动后的硫自养反硝化反应器处理实际含no
3-‑
n废水效果图。
具体实施方式
31.下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。
32.实施例1
33.菌株的分离与鉴定
34.硫自养反硝化菌paracoccus sp.sad-4的分离
35.富集培养基组分为：na2s2o3.5h2o 2g、nano
3 1.2g、kh2po
4 1g、nahco
3 1g、mgso40.5g、feso4.h2o 0.05g、mnso
4 0.01g、nacl 0.5g、自来水1l。固体分离培养基组分为：na2s2o3.5h2o 5g、nano
3 2g、kh2po
4 2g、nahco
3 2g、mgso
4 0.5g、feso4.7h2o 0.05g、mnso
4 0.01g、nacl 1g、nh4cl 1g、水洗琼脂30g、自来水1l。培养基使用前于121℃、0.1mpa灭菌30min。
36.目标菌群的富集：向厌氧瓶中加入200ml富集培养基，121℃、0.1mpa条件下灭菌30min、冷却至常温后加入5g宜兴市高塍北投环保产业园河道底泥样品，密封厌氧瓶并将其横向置于恒温摇床中30℃、150r/min条件下振荡富集培养，通过测定混合液no
3-‑
n值来判断硫自养反硝化菌富集情况，当混合液中no
3-‑
n趋于稳定时将混合液转接5ml至新的装有200ml富集培养基厌氧瓶中，富集条件相同，连续转接2次，得到目标菌群。
37.目标菌株的分离：取各富集菌液倍比稀释，分别取10-3
、10-4
、10-5
涂布于固体分离培养基上，于无氧30℃条件下培养120h后，挑取平板上单个菌落进行划线于固体分离培养基上纯化，培养条件同上，重复纯化3次，得到目标菌株。
38.硫自养反硝化菌paracoccus sp.sad-4的鉴定
39.使用dna提取试剂盒(sangon)按照常规提取步骤提取细菌dna，而后进行pcr目的片段扩增。设计用于扩增16s rdna序列的一对通用引物为：
40.27f5'-agtttgatcmtggctcag-3'；
41.1492r 5'-ggttaccttgttacgactt-3'；
42.用基因组dna作为模板，加入premix taptm，进行pcr扩增，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用dna纯化回收试剂盒纯化，连接到p gm-t载体上，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的lb固体培养基中，在37℃下培养12h，挑取菌落至液体lb培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒进行测定。其中，pcr反应条件为:94℃预变性5min；再经30个循环的94℃变性1min；55℃退火1min；再72℃延伸5min。pcr扩增产物送至上海生工生物公司测序。其序列如seq id no:1所示：
43.该菌株经16s rdna鉴定，并将其结果通过genebank blast程序进行同源性比较，得出菌株与paracoccus sp.的同源性达99.86％，该菌株鉴定为副球菌。
44.实施例2
45.硫自养反硝化菌paracoccus sp.sad-4的扩培
46.种液培养基组分为：na2s2o3.5h2o 10g、nano
3 4g、kh2po
4 2g、nahco
3 2g、mgso40.5g、feso4.7h2o 0.05g、mnso
4 0.01g、nacl 0.5g、nh4cl 0.5g、自来水1l；扩培培养基a组分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl 10g、自来水1l；扩培培养基b组分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl 10g、自来水1l；葡萄糖6g、复合氨基酸5g、kh2po
4 0.6g、k2hpo40.4g、mgso
4 0.2g、nacl 0.2g、naoh 0.35g、自来水1l；扩培培养基c组分同种液培养基，培养基使用前于121℃、0.1mpa灭菌30min。
47.用接种环挑取活化后的副球菌paracoccus sp.sad-4菌落3环接种于种液培养基中，在35℃、150r/min恒温震荡摇床培养96h，制得该菌的种子液；将种子液分别以培养基体积5％的接种量分别接种于扩培培养基a、扩培培养基b、扩培培养基c，扩培培养基a、扩培培养基b在接种后于35℃好氧培养48h，扩培培养基c在接种后于35℃密封缺氧搅拌培养48h，搅拌速度80r/min，分别制得三种培养基培养的菌液。对菌液硫自养反硝化活性进行测定，菌液硫自养反硝化活性对比如图1所示，扩培培养基a和扩培培养基b扩培的菌液硫自养反硝化活性相似，分别为63.8mg no
3-‑
n/(l*h)、66.1mg no
3-‑
n/(l*h)，扩培培养基c扩培的菌液硫自养反硝化活性相对较低，为25.6mg no
3-‑
n/(l*h)。(注：自养反硝化活性表示单位体积菌液每小时能够降解no
3-‑
n的量)
48.实施例3
49.填充不同配比硫自养反硝化填料的反应器的脱氮特性
50.挂膜营养液组分：葡萄糖2g、nh4cl 0.19g、kh2po
4 0.088g、自来水1l；模拟水组分：nano
3 1.82g、nh4cl 0.11g、kh2po
4 0.044g、自来水1l。
51.分别取6个1l量筒，编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#，6个反应器内加入的硫磺为3目，青石为5目，菱铁矿石为5目。1#加入500ml硫磺、500ml青石，2#加入500ml硫磺、400ml青石、菱铁矿石100ml，3#加入500ml硫磺、300ml青石、菱铁矿石200ml，4#加入500ml硫磺、200ml青石、菱铁矿石300ml，5#加入500ml硫磺、100ml青石、菱铁矿石400ml，6#加入500ml硫磺、菱铁矿石500ml，6个反应器有效体积为0.5l，反应器内分别加入实施例2中扩培培养基b扩培的
菌液10ml。反应器内在加入菌液后加入500ml挂膜营养液于30℃曝气48h，挂膜后将反应器内清液倒出，进模拟水500ml，运行温度为30℃，停留时间为48h，6个反应器的48hno
3-‑
n平均降解速率、去除率如图2所示，硫自养反硝化反应器以硫磺为电子供体，青石和菱铁矿石为无机碳源、碱源时，填料组分为硫磺：青石：菱铁矿石＝5：2：3时，反应器硫自养反硝化活性最高，48hno
3-‑
n平均降解速率、去除率分别为4.7mg no
3-‑
n/(l*h)、75.2％。(注：平均降解速率代表反应器单位有效体积每小时降解no
3-‑
n的量)
52.实施例4
53.硫自养反硝化菌paracoccus sp.sad-4的于反应器的启动
54.分别取4个1l量筒，编号为a、b、c、d，分别加入加入3目硫磺500ml、5目青石200ml、5目菱铁矿石300ml，反应器有效体积约为0.5l，4个反应器内分别加入实施例2中扩培培养基b扩培的菌液10ml。设定反应器内在加入菌液后加入500ml实施例3中挂膜营养液于30℃曝气48h为1个挂膜周期(每个挂膜周期内反应器内od
600
呈先上升后下降趋势，od
600
上升过程代表游离菌的增值过程，下降过程代表游离菌向填料上挂膜过程)，反应器b、c、d挂膜周期分别为1、2、3，b、c、d挂膜后将反应器内清液倒出，进实施例3中模拟水500ml，反应器a不挂膜直接进模拟水500ml，运行温度为30℃，停留时间为24h，4个反应器的24hno
3-‑
n平均降解速率、去除率如图3所示，硫自养反硝化反应器以硫磺为电子供体，青石和菱铁矿石为无机碳源，反应器在挂膜1个周期后no
3-‑
n降解速率最高，24hno
3-‑
n平均降解速率、去除率分别为3.39mg no
3-‑
n/(l*h)、57.6％。
55.实施例5
56.挂膜启动后的硫自养反硝化反应器处理实际废水
57.表1实际废水指标
[0058][0059]
于2l的硫自养反应器内加入2l硫自养反硝化填料，填料的组分为3目颗粒硫磺1000ml、5目青石400ml、5目菱铁矿石600ml，反应器有效体积为1l，反应器中加入实施例2中扩培培养基b扩培的菌液20ml。反应器内在加入菌液后加入1l实施例3中挂膜营养液于30℃曝气48h，挂膜后将反应器内清液放出，开始连续进实际废水，反应器进水流量为0.69ml/min，废水水力停留时间为24h，于30℃运行2周，反应器内废水no
3-‑
n、no
2-‑
n、tn指标变化如图4所示。

技术特征：
1.一株硫自养反硝化菌，其特征在于，该菌株为副球菌paracoccus sp.sad-4，保藏编号为cgmccno.26352，于2022年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.根据权利要求1所述的硫自养反硝化菌，其特征在于，硫自养反硝化菌的培养方法包括如下步骤:(1)挑取活化后的副球菌paracoccus sp.sad-4菌落接种于种液培养基中，在30-35℃、100-200r/min恒温震荡摇床培养24-96h，制得该菌的种子液；(2)将步骤(1)制得的种液以扩培培养基体积1-10％的接种量接种于扩培培养基a或者扩培培养基b，在30-35℃、ph7-8、好氧培养24-48h，制得菌液。3.根据权利要求2所述的硫自养反硝化菌，其特征在于，所述步骤(1)中种液培养基的组分：na2s2o3.5h2o 10g、nano
3 4g、kh2po
4 2g、nahco
3 2g、mgso
4 0.5g、feso4.7h2o0.05g、mnso
4 0.01g、nacl 0.5g、nh4cl 0.5g、自来水1l，培养基使用前于121℃、0.1mpa灭菌30min。4.根据权利要求2所述的硫自养反硝化菌，其特征在于，所述步骤(2)中扩培培养基a的组分：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl 10g、自来水1l；或者，所述步骤(2)中扩培培养基b的组分：葡萄糖6g、复合氨基酸5g、kh2po
4 0.6g、k2hpo
4 0.4g、mgso
4 0.2g、nacl 0.2g、naoh 0.35g、自来水1l；培养基使用前于121℃、0.1mpa灭菌30min。5.根据权利要求1所述的硫自养反硝化菌的应用，其特征在于，菌株在投加填料的硫自养反硝化反应器内挂膜后在缺氧条件下对于废水中的no
3-‑
n及no
2-‑
n完全自养降解。6.根据权利要求5所述的硫自养反硝化菌的应用，其特征在于，所述硫自养反硝化反应器内填料组分：硫磺颗粒占填料总体积30-70％，粒径1-5目；青石占填料总体积10-30％，粒径1-5目；菱铁矿石占填料总体积20-50％，粒径1-5目；填料填充量为50-100％(v/v)。7.根据权利要求6所述的硫自养反硝化菌的应用，其特征在于，硫磺为3目，青石为5目，菱铁矿石为5目，硫磺、青石和菱铁矿石的体积占比为5：2：3。8.根据权利要求7所述的硫自养反硝化菌的应用，其特征在于，所述菌株挂膜包括以下步骤：(1)硫自养反硝化反应器在填充填料后补入挂膜营养液，营养液投加至没过填料层顶端10-20cm。(2)将菌液以反应器有效体积5
‰‑
2％的投加量加入反应器中，在25-35℃曝气运行48-96h，运行至混合液od
600
值＜0.1时，挂膜完成。9.根据权利要求8所述菌株的应用，其特征在于，所述挂膜营养液组分：葡萄糖2g、nh4cl0.19g、kh2po
4 0.044g、nahco
3 1g、自来水1l。

技术总结
本发明公开了一株硫自养反硝化菌及其扩培方法与应用，该菌株为副球菌Paracoccus sp.SAD-4，保藏编号为CGMCCNo.26352。该菌株能够在缺氧或者好氧条件下以多种硫基质及有机物为营养源进行生长，在缺氧条件下以硫磺为电子供体、碳酸根为无机碳源实现废水中NO


技术研发人员：李志涛 羊建东 韦丽敏 曾小明
受保护的技术使用者：江苏宜裕环保科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/10/6