circZKSCAN1在制备血管内皮损伤修复产品中的应用

circzkscan1在制备血管内皮损伤修复产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种circzkscan1在制备血管内皮损伤修复产品中的应用。


背景技术：

2.冠状动脉疾病(cad)是全世界最常见的死亡原因之一。经皮血管重建术的引入显著提高了cad患者的治疗效果。目前，经皮冠状动脉介入治疗(pci)，包括经皮腔内冠状动脉成形术(ptca)和支架植入术和药物涂层球囊(dcb)等，大大降低了伴随cad的死亡率，尤其是那些与急性心肌梗死(ami)相关的病例。但与此同时，支架后再狭窄(isr)也逐渐成为pci治疗cad的主要难题和挑战。
3.目前虽然有针对再狭窄的药物，但是这些药物的输送并不能完全根除isr，仍然有血管内皮损伤和增生的风险，所以isr新的治疗靶点和治疗方案的探索仍有待深入研究。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种circzkscan1在制备血管内皮损伤修复产品中的应用，所述circzkscan1的sirna和抑制剂能够抑制huvecs的增殖、迁移和坏死，进而能够通过影响huvecs的增殖、迁移、坏死调控血管内膜的损伤修复，实现对血管内皮损伤修复，尤其是支架后再狭窄的治疗。
6.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.本发明第一方面提供了一种circzkscan1的sirna在制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品中的应用。
8.优选地，所述circzkscan1的sirna的核苷酸序列如seq id no：1所示，或如seq id no：2所示。
9.优选地，所述产品包括药品和食品。
10.本发明第二方面提供了一种circzkscan1的抑制剂在制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品中的应用。
11.优选地，所述circzkscan1的抑制剂为第325位点由a突变为c的m6a，或含有编码第325位点由a突变为c的m6a的质粒；所述第325位点由a突变为c的m6a的核苷酸序列如seq id no：3所示。
12.优选地，所述产品包括药品和食品。
13.本发明第三方面提供了一种抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品，所述产品包括所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂，以及辅料；所述辅料为药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。
14.本发明第四方面提供了一种所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂在制备治疗和/或预防血管内皮损伤产品中的应用。
15.优选地，所述产品包括药品和食品。
16.本发明第五方面提供了一种用于治疗和/或预防血管内皮损伤的药物，所述药物包括治疗有效量的所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂，以及药学上可接受的辅料。
17.本发明第六方面提供了一种所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂在制备治疗和/或预防支架内再狭窄产品中的应用。
18.本发明第七方面提供了一种用于治疗和/或预防支架内再狭窄的药物，所述药物包括治疗有效量的所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂，以及药学上可接受的辅料。
19.本发明第八方面提供了一种circzkscan1在制备诊断血管内皮损伤和/或支架内再狭窄产品中的应用。
20.优选地，所述产品包括试剂盒。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
22.本发明circzkscan1的sirna和抑制剂能够抑制huvecs的增殖、迁移和坏死，进而能够通过影响huvecs的增殖、迁移、坏死调控血管内膜的损伤修复，实现对血管内皮损伤以及支架后再狭窄的治疗。
23.本发明circzkscan1在健康和支架后再狭窄股动脉里进行的荧光原位杂交和免疫荧光试验证实circzkscan1在血管内膜中特异性表达且表达差异显著；因此，circzkscan1可以用于支架后再狭窄的辅助诊断。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
25.图1为本发明实施例中circzkscan1结构的验证结果；
26.图2为本发明实施例中circzkscan1在体内调节内皮损伤修复的研究结果；
27.图3为本发明实施例中过表达circzkscan1可以促进细胞坏死的研究结果；
28.图4为本发明实施例中过表达circzkscan1可以促进h2o2诱导的内皮细胞坏死的研究结果；
29.图5为本发明实施例中敲低circzkscan1可以抑制细胞坏死的研究结果；
30.图6为本发明实施例中敲低circzkscan1可以抑制h2o2诱导的细胞坏死的研究结果；
31.图7为本发明实施例中m6a甲基化修饰可以调控circzkscan1编码蛋白的研究结果；
32.图8为本发明实施例中m6a的325位点突变可以影响circzkscan1介导的细胞坏死的研究结果；
33.图9为本发明实施例中eif4g2和ythdf3调控circzkscan1编码蛋白及细胞坏死的研究结果。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
35.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
36.本发明实施例提供了一种circzkscan1的sirna在制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品中的应用。
37.本发明circzkscan1的sirna能够抑制huvecs的增殖、迁移和坏死，进而可以用于制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品。
38.进一步地，在一实施方式中，所述circzkscan1的sirna的核苷酸序列如seq id no：1所示，具体为accccgaggaacagugcagaa；或如seq id no：2所示，具体为ccccgaggaacagugcagaaa。
39.本发明对上述产品类型不作严格限制，例如可以是药品，也可以是食品。
40.本发明又一实施例提供了一种circzkscan1的抑制剂在制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品中的应用。
41.本发明circzkscan1的抑制剂能够抑制circzkscan1的翻译过程，进而能够调控huvecs的增殖、迁移和坏死，可以用于制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品。
42.在一实施方式中，所述circzkscan1的抑制剂为第325位点由a突变为c的m6a，或含有编码第325位点由a突变为c的m6a的质粒；所述第325位点由a突变为c的m6a的核苷酸序列如seq id no：3所示，具体为gaatagtaaagaaacacatcataaaacctcccaggacataaaggtgagcacagaccctgtttggatcaagtcagttcctggagcctgaatggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaagatgactgctgaatcacgggaagccacgggtctgtccccacaggctgcacaggagaaggatggtatcgtaatagtgaaggtggaagaggaagatgaggaagaccacatgtgggggcaggattccaccctacaggacacgcctcctccagacccagagatattccgccaacgcttcaggcgcttctgttaccagaacacttttgggccccgagaggctctcagtcggctgaaggcactttgtcatcagtggctgcggccagaaataaacaccaaggaacagatcctggagcttctggtgctagagcagtttctttccatcctgcccaaggagctccaggtctggctgcaggaataccgccccgatagtggagaggaggccgtgacccttctagaagacttggagcttgatttatcaggacaacaggtcccaggtcaagttcatggacctgagatgctcgcaagggggatggtgcctctggatccagttcaggagtcctcgagctttgaccttcatcacgaggccacccagtcccacttcaaacattcgtctcggaaaccccgcctcttacagtcacgag。
43.本发明对上述产品类型不作严格限制，例如可以是药品，也可以是食品。
44.本发明另一实施例提供了一种抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品，所述产品包括所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂，以及辅料；所述辅料为药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。
45.本发明研究证明，circzkscan1的sirna和抑制剂能够抑制huvecs的增殖、迁移和坏死，进而通过影响huvecs的增殖、迁移、坏死可以调控血管内膜的损伤修复，实现对血管内皮损伤以及支架后再狭窄的治疗。
46.因此，本发明再一实施例提供了一种所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂在制备治疗和/或预防血管内皮损伤产品中的应用。
47.本发明对上述产品类型不作严格限制，例如可以是药品，也可以是食品。
48.本发明又一实施例提供了一种用于治疗和/或预防血管内皮损伤的药物，所述药物包括治疗有效量的所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂，以及药学上可接受的辅料。
49.本发明实施例还提供了一种所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂在制备治疗和/或预防支架内再狭窄产品中的应用。
50.本发明对上述产品类型不作严格限制，例如可以是药品，也可以是食品。
51.本发明实施例提供了一种用于治疗和/或预防支架内再狭窄的药物，所述药物包括治疗有效量的所述circzkscan1的sirna和/或所述circzkscan1的抑制剂，以及药学上可接受的辅料。
52.circzkscan1在健康和支架后再狭窄股动脉里进行的荧光原位杂交和免疫荧光试验证实circzkscan1在血管内膜中特异性表达且表达差异显著；因此，circzkscan1可以用于支架后再狭窄的辅助诊断。
53.因此，本发明另一实施例提供了一种circzkscan1在制备诊断血管内皮损伤和/或支架内再狭窄产品中的应用。
54.在一些实施方式中，所述用于诊断血管内皮损伤的产品包括试剂盒。
55.以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
56.实施例
57.本实施例为circzkscan1对内皮细胞功能和内皮损伤修复的研究：
58.1、实验材料和方法
59.(1)实验细胞：
60.实验细胞为实验室液氮中保存的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，huvec)和hek-293t细胞。复苏后的细胞培养介质分别为添加10％的胎牛血清(fetal calf serum，fbs)的f12k培养基和添加10％fbs的dmem培养基，培养环境为37℃，5％ co2的细胞培养箱。
61.(2)实验方法：
62.(2.1)临床样本收集
63.研究收集了从2022年5月至2022年9月在青岛大学附属医院接受截肢手术的8例患者的支架后再狭窄股动脉标本和病理资料，健康血管取自于外伤样本。临床组织样品采集后使用预冷的pbs冲洗1-2次，放入液氮速冻，随后转入-80℃超低温冰箱进行储存，并用于后续的切片、western blot、荧光原位杂交和免疫组化的验证。本研究研究参与者提供知情同意，得到了中国青岛大学附属医院伦理委员会的批准。所有患者在手术前都被告知他们的手术样本和临床病理资料将用于科学研究，并全部按照正规程序签署了知情同意书。
64.(2.2)颈动脉球囊损伤模型大鼠的构建
65.将sprague-dawley大鼠随机分为四组(每组n＝5)：对照组、损伤组、治疗对照组和治疗组。治疗对照组使用aav-shrna-nc，序列为5
’‑
cctaaggttaagtcgccctcg-3’，治疗组用aav-shrna-circzkscan1治疗，序列为5
’‑
accccgaggaacagtgcagaa-3’。首先，将颈动脉球囊通过左颈外动脉插入颈总动脉，用充气膨胀的球囊导管来回摩擦损伤数次，用0.9％正常生理盐水清洗消肿。将100μlaav-nc或aav-shrna-circzkscan1稀释液(1x108 tu/ml)缓慢注
入动脉损伤段，局部应用30分钟，并结扎颈动脉。注射后15周，通过腹腔注射10％水合氯醛，提取左颈总动脉的血管进行形态学检查和后续实验，石蜡切片染色，并提取总rna。
66.(2.3)h&e染色
67.分离大鼠的颈动脉组织，用4％多聚甲醛固定并包埋入石蜡中。从石蜡块中获得切片(6μm)并贴在玻片上。首先，用二甲苯脱蜡，然后用不同浓度梯度的乙醇处理。最后，进行h&e染色处理，先用苏木精染液染色5分钟，用流水清洗10分钟，再用伊红染液染色1分钟。最后用中性树脂封固。在尼康倒置荧光显微镜下拍摄玻片图像。
68.(2.4)马松染色
69.取自人和大鼠的动脉标本，切片脱蜡复水。用铁苏木素染液染色6分钟，酸性乙醇分化10秒，再用masson蓝返蓝4分钟，使用蒸馏水洗。再用丽春红品红染液染色6分钟，用弱酸工作液洗1分钟。接着使用磷钼酸溶液1分钟，使用弱酸工作液洗1分钟。再直接放入苯胺蓝染液染色1分钟，弱酸工作液1分钟。最后用不同梯度乙醇脱水，二甲苯透明。中性树胶封固。在尼康倒置荧光显微镜下拍摄玻片图像。
70.(2.5)免疫组化
71.为了进行ihc分析，将浸泡在4％多聚甲醛中的大鼠颈动脉组织在梯度乙醇中脱水48小时，在二甲苯中透明，并制备组织切片(6μm厚)。然后通过淬灭内源性过氧化物酶、抗原恢复和正常山羊血清阻断来恢复切片。然后将切片与抗rip3抗体(1:100,abclonal,usa)、抗p-rip3抗体(1:150,cell signaling technology,usa)、抗p-mlkl抗体(1:150,affinity,usa)和抗ki67抗体(1:200,abcam,uk)在4℃下孵育过夜。在室温下，二抗孵化1小时，用显微镜进行拍照。
72.(2.6)细胞培养
73.细胞复苏：提前打开37℃水浴锅，在1min内融化细胞；将其吸出转移至1.5mlep管中，离心机中1000rpm离心5min，培养皿并加入4ml完全培养基[29]；将细胞悬液加入培养皿中，轻轻吹打摇晃；将细胞培养在37℃，5％co2的培养箱中，细胞密度达到80％以上可进行细胞传代。
[0074]
(2.7)细胞转染
[0075]
6孔板：
[0076]
a管：5μllipofectamine 3000+200μl无血清培养基，静置3min；
[0077]
b管：5μl si-circzkscan1-1+200μl无血清培养基，静置3min；
[0078]
静置后将a管中溶液缓慢加入到b管，轻轻吹打混匀后静置25min，然后将其加入到6孔板中继续培养。
[0079]
6孔板：
[0080]
a管：5μllipofectamine 3000+200μl无血清培养基，静置3min；
[0081]
b管：5μl si-circzkscan1-2+200μl无血清培养基，静置3min；
[0082]
静置后将a管中溶液缓慢加入到b管，轻轻吹打混匀后静置25min，然后将其加入到6孔板中继续培养。
[0083]
6孔板：
[0084]
a管：9μl pei+150μl无血清培养基，静置3min；
[0085]
b管：2.5μg circzkscan1+150μl无血清培养基，静置3min；
[0086]
静置后将a管中溶液缓慢加入到b管，轻轻吹打混匀后静置12min，然后将其加入到6孔板中继续培养。
[0087]
(2.8)迁移实验
[0088]
首先在24孔板中转染过表达质粒或sirna来过表达或敲低circzkscan1，接着分组用或不用h2o2处理huvecs的条件，细胞用胰酶进行消化，加入完全f12k培养基终止消化。在1.5ml离心管中以300g离心5分钟，然后使细胞复苏。接着在用不含fbs的f12k培养基再次以300g离心5分钟。使用细胞计数板，将3x104个细胞种植在24孔透析孔的上腔，下腔含有10％ fbs的培养基。继续在37℃和5％co2的培养箱中进行培养。36小时后，用结晶紫对细胞进行30分钟的染色。在显微镜下对细胞进行计数和拍照。
[0089]
(2.9)荧光素酶检测
[0090]
荧光素酶的测定使用双荧光素酶报告基因测定系统进行。为了构建报告载体，将细胞周期蛋白d1基因的3
′‑
非翻译区(utr)序列克隆到空的plightswitch-3
′‑
utr rensp-荧光素酶报告载体中。为了测定荧光素酶活性，将hek-293t细胞接种到24孔板中，并与荧光素酶报告载体以及circzkscan1、circzkscan1-ires或circzkscan1-ires-cmv转染，遵循qiagen提供的转染程序。转染后48小时，使用光度计裂解细胞以进行荧光素酶活性测量。
[0091]
(2.10)实时定量pcr(real-time quantitative reverse transcription pcr，qrt-pcr)
[0092]
使用定量实时聚合酶链式反应检测rna的表达量。使用trizol提取总rna，然后使用primescript rt master mix转录1μg rna。使用sybr green pcr master mix通过qrt-pcr评估基因表达。以gapdh mrna为内参，采用δδct法对相对基因表达量进行定量。引物序列见表1。
[0093]
表1
[0094][0095]
(2.11)蛋白免疫印迹
[0096]
(2.11.1)细胞总蛋白提取
[0097]
预冷的pbs洗3遍备好的细胞，细胞裂解液配置比例为ripa:pmsf:cocktail＝1000:10:1，每孔200μl加入到6孔板中，并在冰上裂解30min；将细胞刮下转移到1.5mlep管中，4℃离心15min，转速为12000rpm；留上清，弃沉淀并计算蛋白浓度；根据bca试剂盒所测浓度使用5
×
蛋白上样缓冲液和双蒸水调整蛋白为1
×
，离心混匀；金属浴为100℃5min，直接用于蛋白电泳。
[0098]
(2.11.2)sds-page凝胶电泳
[0099]
按照凝胶电泳试剂盒配制10％的page凝胶，使用上样器将25μg蛋白和2μl蛋白marker缓慢匀速加入到胶孔中；使用80v电压使蛋白压平；40min后120v恒压1h继续电泳；提前准备5
×
8.5cm大小的pvdf膜，在甲醇中激活1分钟后进行转膜，恒流240ma(具体情况根据不同蛋白分子量调整时间)，电转槽外周加入冰水混合物保持转膜过程呈现低温状态；等待转膜结束后，将pvdf膜置于5％牛奶或5％ bsa溶液中室温摇床封闭2h(具体情况根据实验需要适量调整时间)，洗膜用1
×
tbst洗3次，每次10min；将pvdf膜放入一抗中，室温摇床孵育2h或4℃过夜，tbst洗3次；之后用相对应的二抗孵育1h，用1
×
tbst洗3次，每次10分钟；用ecl试剂盒显影。
[0100]
(2.12)荧光原位杂交
[0101]
由吉玛(中国苏州)合成circzkscan1特异性连接的cy3标记探针，序列为5
’‑
gtgtttctttactattcctcgtgac-3’。使用fish试剂盒(碧云天，中国)进行分析。将细胞接种在载玻片上，然后在室温下，用4％多聚甲醛固定10分钟。然后用0.5％ triton x-100在4℃渗透5分钟。细胞用预杂交缓冲液在55℃封闭20分钟。然后，将细胞与fish探针在杂交缓冲液中于55℃黑暗中孵育6小时。用洗涤缓冲液i(4
×
ssc加0.1％吐温-20)、洗涤缓冲液ii(2
×
ssc)和洗涤缓冲液iii(1
×
ssc)在55℃的黑暗中洗涤三次，每次10分钟，并用含有dapi的抗淬灭剂(赛维尔，中国)固定细胞。使用尼康共焦显微镜进行图像采集。
[0102]
(2.13)流式细胞术
[0103]
将huvecs接种到6孔板中进行转染。然后进行细胞重悬，先使用完全培养基离心细胞，再使用pbs清洗细胞并收集。在37℃下避光条件下用碘化丙啶/annexin v染色15分钟。使用cytoflex lx流式细胞仪分析细胞的坏死程度。
[0104]
2、统计分析
[0105]
除非另有说明，所有实验结果至少重复三次，所有数据均通过graphpad prism 8.0分析。所有定量数据均以mean
±
sd表示。显著性评估采用未配对学生t检验分析。
[0106]
3、实验结果
[0107]
3.1circzkscan1结构验证
[0108]
生信网站circ base(http://www.circbase.org/)的分析表明circzkscan1来自人类17号染色体的zkscan1基因，其特征在于含有其外显子2和3的长核苷酸区域。分析显示，zkscan1基因的外显子3的3’端和外显子2的5’端可环化形成circzkscan1(图1中a)。通过sanger测序和qrt-pcr分析进一步验证了circzkscan1的反向剪接点(图1中b)，与其环状性质一致，circzkscan1显示出对rnase r更大的抗性。与其线性对应物相比，circzkscan1具有更长的半衰期，即更加稳定(图1中c)。接下来在健康和isr的股动脉样本中进行免疫荧光和荧光原位杂交共定位实验，证实了circzkscan1在人股动脉内膜的内皮细胞中表达，且鉴定了其在疾病组织中的特异性高表达(图1中d和e)。同时通过he染色观察到人isr样本的内膜明显增厚(图1中f)，马松染色观察到在isr样本发生了胶原沉积(图1中f)，此外，通过比较circzkscan1在血管平滑肌细胞和huvecs的含量，进一步证实了该circrna主要存在于huvecs中(图1中g和h)。最后在huvecs中通用荧光原位杂交(图1中i)实验证明了circzkscan1在细胞质中的定位。图1中，(a)：circzkscan1的环化示意图。(b)：circzkscan1的环化位点及环状结构通过qrt-pcr和sanger测序和qrt-pcr得到验证。(c)：放线菌素d处理huvecs后，在指定时间点对circzkscan1和线性zkscan1 rna进行qrt-pcr分析。(d和e)：
通过荧光原位杂交确定circzkscan1在健康和股动脉组织中的定位及差异表达；比例尺，200μm。(f)：he染色观察内膜增生情况，比例尺，200μm；马松染色观察胶原沉积情况，比例尺，200μm。(g和h)：荧光半定量测定circzkscan1在不同细胞中的差异性表达。(i)：在huvecs中进行fish分析，以确定circzkscan1的定位；红色：用cy3标记的circzkscan1探针；蓝色：细胞核dapi染色；比例尺，200μm。数据显示为：***p《0.001和****p《0.0001。
[0109]
上述结果表明circzkscan1是一种环状rna，来源于zkscan1的外显子2和外显子3的环化，且主要存在于血管内膜的内皮细胞质中，并在isr的血管中特异性高表达。
[0110]
3.2circzkscan1在体内调节内皮损伤修复的研究
[0111]
为了探索circzkscan1的治疗效果，构建了大鼠颈动脉球囊损伤模型，把大鼠随机分为四组，分别是健康组，损伤组，治疗对照组，治疗组。给治疗组大鼠注射腺相关病毒aav-shrna-circzkscan1以敲低circzkscan1的表达(图2中a)，在注射15周后收集颈动脉。提取了大鼠颈动脉组织rna进行qpcr，验证aav-shrna的干扰效率(图2中b)。与对照组相比，circzkscan1的敲低导致大鼠颈动脉组织中circrna的含量减少(图2中c)，同时内膜增厚情况发生改善(图2中d和e)。接着检测了ki67发现敲低circzkscan1后，增殖被抑制(图2中f)。在isr中，促进损伤血管内膜愈合是目前较有效缓解狭窄的方式，而内皮损伤导致愈合时间变长。猜测这可能和内皮坏死有关系。于是在颈动脉组织切片中检测了坏死相关标记物。ihc数据显示，敲低circzkscan1的治疗组中rip3、p-rip3、p-mlkl的表达量下调(图2中g)。这是首次发现在颈动脉血管损伤时，内膜增厚与内皮坏死有关系。图2中，(a):诱导颈动脉球囊模型的动物实验的总体方案，红色箭头表示注射aav-shrna-circzkscan1的时间点。(b)：大鼠颈动脉组织中circzkscan1的qrt-pcr分析。(c):通过fish检测circzkscan1在组织中的位置和差异性表达，比例尺，100μm。(d和e)：he染色，对四组大鼠的颈动脉内膜增生面积进行统计分析，比例尺，100μm。(f):通过ki67免疫荧光检测大鼠颈动脉增殖情况，比例尺，100μm。(g):大鼠颈动脉样本的免疫组化染色，比例尺，50μm。数据显示为***p《0.001。
[0112]
综上所述，敲低circzkscan1可缓解受损颈动脉内膜增厚和坏死。
[0113]
3.3过表达circzkscan1可以促进细胞坏死的研究
[0114]
为了验证circzkscan1的生物学功能，在体外构建了circzkscan1过表达的huvecs模型(图3中a)。通过流式实验观察到与对照组相比，circzkscan1的过表达显著促进了细胞坏死(图3中b)，pi染色实验进一步证明坏死细胞数量的增加(图3中c)。然后进行western blot检测坏死相关蛋白(rip3,p-rip3,p-mlkl)的表达情况，在过表达组获得了一致的结果(图3中d和e)，circzkscan1可以促进huvecs的坏死。与此同时，还利用edu实验检测了细胞增殖情况，过表达circzkscan1可以促进细胞增殖(图3中f)。transwell实验检测了细胞迁移情况，结果显示过表达circzkscan1促进细胞迁移(图3中h和i)。图3中，(a)在huvecs里过表达circzkscan1后，检测circzkscan1过表达效率。(b)：流式细胞技术测huvecs的坏死。(c)：代表性的pi染色图，比例尺为100μm。(d和e)：western blot检测坏死相关的蛋白水平。(f)通过edu实验检测转染细胞的增殖水平，比例尺，100μm。(g和h)：通过transwell实验检测转染细胞的迁移水平，比例尺，100μm。数据显示为：*p《0.05，**p《0.01,***p《0.001和****p《0.0001。
[0115]
总的来说，circzkscan1的过表达可以显著促进内皮细胞的坏死和增殖迁移，这些调控作用可能是其在体内发挥作用的主要原因。
[0116]
3.4过表达circzkscan1可以促进h2o2诱导的内皮细胞坏死
[0117]
为了模拟circzkscan1在病理状态下的生物学功能，使用过氧化氢(500m)模拟内皮细胞坏死发生的病理条件(图4中a)。通过流式实验检测细胞坏死情况，观察到与对照组相比，circzkscan1显著促进了过氧化氢诱导的细胞坏死(图4中b)。然后进行western blot检测坏死相关蛋白(rip3,p-rip3,p-mlkl)，在过表达组获得了一致的结果(图4中c和d)；图4中，(a)：过氧化氢处理huvecs 24小时后，qrt-pcr检测circzkscan1表达情况。(b)：流式细胞技术测细胞坏死。(c和d)：western blot检测坏死相关的蛋白水平。数据显示为：**p《0.01和***p《0.001。
[0118]
以上结果表明，在病理条件下，circzkscan1显著促进了内皮细胞的坏死。
[0119]
3.5敲低circzkscan1可以抑制细胞坏死
[0120]
为了进一步在体外验证circzkscan1的调控作用，同时建立了敲低circzkscan1的huvecs细胞模型。在huvecs中设计了两个sirna来沉默circzkscan1，这两条sirna都能够敲低circzkscan1(图5中a)。接下来，还通过流式细胞术和pi染色检查了circzkscan1敲低后内皮细胞的功能，结果显示circzkscan1的敲低后能够减少坏死细胞数量(图5中b和c)。western blot实验显示坏死蛋白在circzkscan1敲低后表达量下调(图5中d和e)，即敲低circzkscan1能够抑制细胞坏死(描述结果)。此外，edu分析证实沉默circzkscan1后内皮细胞的增殖(图5中f)和迁移也受到抑制(图5中g和h)。这与过表达circzkscan1时得到的结论一致。图5中，(a)：在huvecs里敲低circzkscan1后circzkscan1的相对rna水平。(b)：流式细胞技术检测细胞坏死。(c)：pi染色检测坏死情况，比例尺：100μm。(d和e)：western blot检测坏死相关的蛋白水平。(f)通过edu实验检测转染细胞的增殖水平。(g和h)：通过transwell实验检测转染细胞的迁移水平，比例尺，100μm。数据显示为：nsp》0.05，*p《0.05，**p《0.01和****p《0.0001。
[0121]
结果表明，体外数据显示，在敲低circzkscan1后，细胞坏死得到缓解且增殖迁移减少。
[0122]
3.6敲低circzkscan1可以抑制h2o2诱导的细胞坏死
[0123]
接下来，在过氧化氢诱导的病理条件中，同样进行敲低circzkscan1的敲低以检测相同病理条件下的细胞功能。通过流式细胞试验检测细胞坏死功能，发现敲低circzkscan1之后能够显著抑制过氧化氢诱导的细胞坏死(图6中a)。比较于生理条件下，circzkscan1缓解细胞坏死的能力在病理条件下更加显著。western blot结果显示病理条件下敲低circzkscan1坏死相关标记物含量明显下调，即在敲低circzkscan1后能够缓解细胞坏死的发生(图6中b和c)。
[0124]
图6中，(a)：huvecs转染si-circzkscan1 24小时后，流式细胞技术检测细胞坏死。(b和c)：western blot检测坏死相关的蛋白水平。数据显示为：*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001。
[0125]
3.7m6a甲基化修饰可以调控circzkscan1编码蛋白
[0126]
circrnadb数据库分析表明circzkscan1能够编码一种新的多肽(图7中a)。所以，构建了含有flag标签的circzkscan1过表达载体，以检测它是否可以进行翻译。转染过表达质粒进行免疫印迹实验后，数据显示在28kd附近有一条特异性条带产生，且该处蛋白的表达量随着转染质粒浓度的增加而增加(图7中b和c)。以上结果初步确定了circzkscan1能够
编码。据报道，由于circrna缺乏帽子结构，因此它们能够使用两种独立于帽子结构的方法进行翻译:iress和m6a修饰。结合生物信息学网站circrnadb的分析，预测到circzkscan1中有一个潜在的ires元件((ires-1:134-294)。根据之前的报道，验证ires活性的检测报告系统是基于将两个报告基因，海肾荧光素酶蛋白和萤火虫荧光素酶蛋白同时串联构建到一个启动子后面，通过中间插入ires核酸片段，将报告质粒转染细胞，检测计算两个肾荧光素酶的活性，从而实现ires活性的定量，ires有活性即证明有编码能力。所以，将这个ires片段克隆到ires荧光素酶报告基因中，结果证实它不能启动荧光素酶表达(图7中d)。据此，推测：circzkscan1的编码可能是由于m6a的催化作用。据sramp数据库中预测，结果显示circzkscan1中有两个高可信度的m6a修饰位点具有编码潜力(m6a位点:325和535)。m6a具有不同的甲基化位点，不同位点具有不同的修饰功能。可通过不同的方式进行突变，选择把这两个位点进行点突变，即把a(腺嘌呤)突变为c(胞嘧啶)(图7中e)，发现在325位点突变后显著下调了编码蛋白的表达(图7中f和g)，circzkscan1翻译被抑制。鉴于上述结果，接下来想知道m6a修饰如何调节circzkscan1的翻译。用sirna敲低了m6a读码蛋白ythdf3和m6a翻译启起始因子eif4g2。huvecs内转染sirna后，circzkscan1翻译蛋白的表达显著减少(图7中h和i)。图7中，(a)：circzkscan1编码的多肽序列。(b和c)：浓度梯度过表达circzkscan1后的检测抗-flag抗体的western blot分析。(d)：双荧光素酶报告实验检测ires元件活性。(e)：sarmp数据库预测的circzkscan1翻译的m6a修饰位点。(f-g)：用m6a突变体转染细胞之后的western blot分析。(h-i)：敲低m6a修饰酶之后转染细胞的western blot分析。数据显示为：nsp》0.05，***p《0.001和****p《0.0001。
[0127]
由图7可知，circzkscan1可编码蛋白，且编码翻译蛋白的过程是受依赖于ythdf3和eif4g2的m6a修饰的，而非ires介导。
[0128]
3.8m6a的325位点突变可以影响circzkscan1介导的细胞坏死
[0129]
为了确定circzkscan1编码蛋白(以下称为circzkscan1-203aa)的功能，在huvecs中转染了具有点突变m6a325位点的质粒(图8中a)。通过流式细胞技术和pi染色结果证实在circzkscan1-203aa表达下调的条件下，细胞坏死数量显著下调，细胞坏死被抑制(图8中b和c)。接下来通过western blot检测坏死相关蛋白(rip3,p-rip3,p-mlkl)的表达情况，发现在编码蛋白被抑制时，坏死蛋白的表达也同时被抑制(图8中d和e)，数据显示circzkscan1可能是通过circzkscan1-203aa发挥功能促进细胞坏死的，transwell实验则证明了circzkscan1-203aa下调细胞迁移被抑制的情况(图8中f和g)。
[0130]
图8中，(a)：qrt-pcr测定huvecs转染m6a 325突变位点质粒之后circzkscna1表达量。(b)：流式技术测量坏死程度。(c)：pi染色测坏死细胞数量，比例尺，100μm。(d和e)：western blot检测坏死相关的蛋白水平。(f和g)：通过transwell实验检测转染细胞的迁移水平，比例尺，200μm。数据显示为：ns p》0.05，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001和****p《0.0001。
[0131]
3.9eif4g2和ythdf3调控circzkscan1编码蛋白及细胞坏死
[0132]
接下来在huvecs里共转染了sirna(si-eif4g2,si-ythdf3)和circzkscan1，结果发现m6a翻译相关蛋白在抑制circzkscan1-203aa的时候不会影响circzkscan1的表达(图9中a)。流式细胞技术和pi染色同样证实了m6a翻译相关蛋白敲低可以抑制circzkscan1对于细胞坏死的促进作用(图9中b和c)。接下来进行western blot实验检测坏死相关抗体
(rip3,p-rip3,p-mlkl)，得到了和前面实验一致的结果，即坏死相关蛋白表达下调，细胞坏死被抑制(图9中d和e)。接下来通过edu实验(图9中f和g)和transwell实验(图9中h和i)证实在circzkscan1203aa的抑制可以减少由circzkscan1调控的细胞增殖迁移情况。图9中，(a)：qrt-pcr测定转染之后circzkscna1表达量。(b)流式细胞技术测量坏死程度。(c)：代表性的pi染色图。(d和e)：western blot检测坏死相关的蛋白水平。(f和g)：通过edu实验检测转染细胞的增殖水平，比例尺，100μm。(h和i)通过transwell实验检测转染细胞的迁移水平，比例尺，200μm。数据显示为：nsp》0.05，***p《0.001和****p《0.0001。
[0133]
由图9可知，circzkscan1的编码是由eif4g2和ythdf3调控m6a实现的，且能够影响内皮细胞的坏死和增殖迁移功能。
[0134]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

技术特征：
1.circzkscan1的sirna在制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述circzkscan1的sirna的核苷酸序列如seq id no：1所示，或如seq id no：2所示。3.circzkscan1的抑制剂在制备抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述circzkscan1的抑制剂为第325位点由a突变为c的m6a，或含有编码第325位点由a突变为c的m6a的质粒；所述第325位点由a突变为c的m6a的核苷酸序列如seq id no：3所示。5.一种抑制huvecs增殖、迁移和/或坏死的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1～2任一所述circzkscan1的sirna和/或权利要求3～4任一所述circzkscan1的抑制剂，以及辅料；所述辅料为药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。6.权利要求1～2任一所述circzkscan1的sirna和/或权利要求3～4任一所述circzkscan1的抑制剂在制备治疗和/或预防血管内皮损伤产品中的应用。7.一种用于治疗和/或预防血管内皮损伤的药物，所述药物包括治疗有效量的权利要求1～2任一所述circzkscan1的sirna和/或权利要求3～4任一所述circzkscan1的抑制剂，以及药学上可接受的辅料。8.权利要求1～2任一所述circzkscan1的sirna和/或权利要求3～4任一所述circzkscan1的抑制剂在制备治疗和/或预防支架内再狭窄产品中的应用。9.一种用于治疗和/或预防支架内再狭窄的药物，其特征在于，包括治疗有效量的权利要求1～2任一所述circzkscan1的sirna和/或权利要求3～4任一所述circzkscan1的抑制剂，以及药学上可接受的辅料。10.circzkscan1在制备诊断血管内皮损伤和/或支架内再狭窄产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种circZKSCAN1在制备血管内皮损伤修复产品中的应用；本发明circZKSCAN1的siRNA和抑制剂能够抑制脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和坏死，进而能够通过影响HUVECs的增殖、迁移、坏死调控血管内膜的损伤修复，实现对血管内皮损伤以及支架后再狭窄的治疗。后再狭窄的治疗。后再狭窄的治疗。


技术研发人员：杨艳艳 于涛
受保护的技术使用者：青岛大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/10/6