检测Tau蛋白的试剂盒与方法与流程

检测tau蛋白的试剂盒与方法
技术领域
1.本技术属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测tau蛋白的试剂盒以及一种检测tau蛋白的方法。


背景技术：

2.阿尔兹海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种与年龄相关的最常见神经系统退行性疾病。
3.阿尔茨海默病(ad)以神经元死亡为特征，通常与淀粉样斑块和神经原纤维缠结(nft)的出现有关，而后者是超磷酸化微管相关蛋白tau的丝状缠结。在正常生理条件下tau蛋白促进微管组装和稳定性，也作为轴突微管和神经质膜成分的连接蛋白发挥作用。tau缺陷修饰特别是磷酸化修饰，被认为会导致tau失去微管结合功能，诱导其聚集而形成tau的丝状缠结，并可能最终导致ad的产生。
4.目前研究结果证实使用脑脊液总tau作为ad生物标志物时能够有效提高正确诊断患者的百分比。相比较pet-ct等影像学手段，该生物标志物组合的检测将有助于ad的早期发现以及治疗效果的动态追踪。
5.然而，目前现有试剂盒制备技术主要有以下几点缺点：
6.(1)检测时间过长
7.目前基于微流控芯片总tau检测时间相对较长，如李宜鸿等人建立的用于阿尔茨海默症早期检测的芯片试剂盒检测时长约1.5小时。基于化学发光平台的总tau测定试剂盒也有类似情况。刘建芳等人开发的总tau测定试剂盒单个样本的检测时长也需要不少于0.5小时。这样的检测时长无疑为临床检验科室/体检科室的高通量、高效率总tau检测带来了困扰。
8.(2)检出限数值高
9.检出限数值越低说明试剂盒灵敏度越高，越能够可靠地定量检测到低丰度被检测物。然而林斯等人的数据显示其poct平台的试剂盒，其总tau检出限为15pg/ml。郭健夫等人建立的基于化学发光平台的总tau测定试剂盒检出限高达500pg/ml。我们希望借助技术改良能够更加有效地检测出低丰度总tau，来提升试剂盒的灵敏度。
10.(3)线性范围窄
11.更宽的线性范围可以保证样本无需稀释即可完成检测，这样无疑可以减少检测次数并消除因样本稀释而造成的检测偏差。王谦等人建立的化学发光平台的总tau的检测上限为400pg/ml。已公开数据显示姚天明等人建立的总tau检测系统其线性范围上限也仅为1000pg/ml。该线性范围上限低于andreasen等人报道的部分样本中总tau的浓度范围为759
±
417pg/ml。


技术实现要素：

12.基于上述描述，当前总tau检测系统还有很多不足。因此ad的早期发现以及治疗效
果的动态追踪受到了限制。为了克服现有技术中存在的不足，本技术提供一种检测tau蛋白的试剂盒，以及所述试剂盒在制备用于检测tau蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途，还提供一种检测样品中tau蛋白含量的方法。
13.本技术的具体技术方案如下：
14.1.一种检测tau蛋白的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
15.靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠；和
16.经化学发光剂标记的靶向tau蛋白的第二抗体；
17.其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。
18.2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体与磁珠的质量比为1:(20～60)，优选为1:(25～50)。
19.3.根据项1或2所述的试剂盒，其中，所述靶向tau蛋白的第二抗体与化学发光剂的物质的量之比为1:(6～50)，优选为1:(10～30)。
20.4.根据项1～3中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括tau蛋白标准品、底物、包被缓冲液、标记物缓冲液、洗涤液、封闭液和样品稀释液。
21.优选地，所述包被缓冲液和标记物缓冲液为tbs-t缓冲液，所述tbs-t缓冲液中包含吐温-20和bsa，优选所述tbs-t缓冲液还包含海藻糖；
22.优选地，所述tbs-t缓冲液中包含0.7％～1.2％吐温-20和0.5％～1％bsa；
23.优选地，所述tbs-t缓冲液中还包含30～50g/l海藻糖。
24.5.根据项1～4中任一项所述的试剂盒，其中，
25.所述靶向tau蛋白的第一抗体包含三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，其中：
26.所述cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:1所示；
27.所述cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:3所示；
28.所述cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:5所示；
29.所述cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:7所示，
30.所述cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:9所示；
31.所述cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:11所示；
32.所述靶向tau蛋白的第二抗体包含三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，其中：
33.所述cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:2所示；
34.所述cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:4所示；
35.所述cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:6所示；
36.所述cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:8所示；
37.所述cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:10所示；
38.所述cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:12所示。
39.6.根据项1～5中任一项所述的试剂盒，其中，
40.所述靶向tau蛋白的第一抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:13，或为与seq id no:13具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:15所
示，或为与seq id no:15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
41.所述靶向tau蛋白的第二抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14，或为与seq id no:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示，或为与seq id no:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
42.7.根据项1～6中任一项所述的试剂盒，其中，其用于诊断阿尔兹海默症。
43.8.项1～7中任一项所述的试剂盒在制备用于检测tau蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。
44.9.一种检测样品中tau蛋白含量的方法，其中，包括以下步骤：
45.将被测样品、靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠和化学发光剂标记的靶向tau蛋白的第二抗体混合，孵育后进行磁分离；
46.洗涤后加入底物，测定被测样品的发光值；
47.利用tau蛋白标准品的发光值计算出被测样品中tau蛋白的含量；
48.其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。
49.10.根据项9所述的方法，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体与磁珠的质量比为1:(20～60)，优选为1:(25～50)；
50.优选地，所述靶向tau蛋白的第二抗体与化学发光剂的物质的量之比为1:(6～50)，优选为1:(10～30)。
51.11.根据项9或10所述的方法，其中，所述被测样品为脑脊液；
52.优选地，所述被测样品至少为50μl，优选至少为100μl；
53.更优选地，每微升被测样品，需要使用0.005～0.015μg靶向tau蛋白的第一抗体和0.05～0.15ng靶向tau蛋白的第二抗体；
54.进一步优选地，孵育时间至少为15min。
55.12.根据项9～11中任一项所述的方法，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体、靶向tau蛋白的第二抗体为项5或6中所述的靶向tau蛋白的第一抗体、靶向tau蛋白的第二抗体。
56.发明的效果
57.本技术的检测tau蛋白的试剂盒，以一对重组抗体作为核心原料，包括靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠，以及经化学发光标记的靶向tau蛋白的第二抗体，本技术的检测tau蛋白的方法，将第一抗体包被的磁珠、标记的第二抗体与被测样品混合后磁分离，并在磁微粒化学发光平台进行检测。本技术的试剂盒中包含的重组抗体性能优异且稳定、亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。本技术的试剂盒和检测方法中所使用的磁珠为特定的甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠，检出限数值更低，线性范围更宽，检测灵敏度高。此外，磁微粒化学发光平台有着操作简单、自动化程度高以及均相反应体系等优势，借助一步法的反应系统可以进一步缩短检测时间。本技术进一步采用高亲和力且性能稳定的重组抗体对抗原表位识别能力更强，与抗原之间的结合程度更高，因此高亲和力抗体具备更强的低丰度靶抗原捕获的能力，为试剂盒提供一个更低的检出限，检测灵敏度高；在不改变包被工艺的前提下，更换高亲和力抗体可以增强单
位质量磁珠或其他介质的抗原抓取能力，进而不产生hook效应的前提下明显提升试剂的线性范围。
附图说明
58.图1为采用本技术的tau试剂盒与采用g1200平台产品检测的样品中tau含量的一致性分析结果。
具体实施方式
59.下面结合具体实施方式对本技术做进一步的详细描述，给出的实施方式是为了能够更透彻地理解本技术，并且能够将本技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
60.本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
61.tau蛋白在正常人体内的主要功能是诱导与促进微管蛋白聚集成微管，并维持其稳定性。成人大脑中有6种tau蛋白亚型，其中三种是有三段微管结合重复区域(2n3r、1n3r、0n3r)，另三种是有四段微管结合重复区域(2n4r、1n4r、0n4r)。2n4r/tau-441是tau全长蛋白，k18和k19是截短的tau蛋白，仅含有微管结合重复区域。tau蛋白的微管结合能力由翻译后修饰来控制，其中磷酸化修饰是主要方式之一。tau蛋白的20％的氨基酸都可以是潜在的磷酸化位点。通常情况下，tau蛋白的微管结合区域是带正电的，因此可以吸引带负电的微管。当这个微管结合区域高度磷酸化以后，它就失去了正电量，从微管蛋白上脱离下来，不再具有结合稳定微管的能力了。接下来造成微管蛋白的失效，而且高度磷酸化的tau聚集沉淀，对神经细胞有毒性，这些后果共同造成了神经衰退病因，由于tau蛋白有多个磷酸化位点并且参与调节的蛋白激酶和磷酸酯酶又不止一种，所以这使得ad的发病机制非常复杂。tau前体纤维原(pffs)可以诱导人工培养的细胞和动物活体中的tau蛋白的聚集，使可溶的单体聚集形成不溶纤维。在表达tau蛋白的细胞中引入少量的taupffs就可以引起大量的tau聚集形成丝状包含物类似nfts。合成的taupffs也可以进入到非神经细胞中聚集tau蛋白形成nfts。
62.在一些实施方式中，本技术的tau蛋白为tau全长蛋白2n4r/tau-441。
63.在本文中，术语“重组抗原”是指在将抗原基因连接至载体后转入原核或真核细胞中，体外重组表达纯化得来的抗原。
64.在本文中，术语“重组抗体”是将免疫特异性重链和轻链抗体基因克隆到高效表达载体，再将这些载体引入表达宿主(例如细菌、酵母或哺乳动物)中进行抗体表达而得到的抗体。本技术的抗体可以是全人源化抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
65.在一些实施方式中，本技术的重组抗体是利用本技术的重组抗原免疫动物后获得的抗体。
66.在一些实施方式中，本技术的抗体为全长抗体，全长抗体典型地是指由两条“重链”和两条“轻链”组成的抗体。“重链”通常是这样的多肽，其在n端到c端方向由重链可变区(vh)、重链恒定区1(ch1)，铰链区(hr)，抗体重链恒定区2(ch2)，和重链恒定区3(ch3)组成，缩写为vh-ch1-hr-ch2-ch3；在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在n端到c端方向由vh，ch1，hr，ch2和ch3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在n端到c端方向由轻链可变区(vl)，
和轻链恒定区(cl)组成的多肽，缩写为vl-cl。
67.本技术中，所述轻链恒定区、重链恒定区可以为任意的轻链恒定区、重链恒定区。所述轻链恒定区(cl)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。所述重链恒定区可以是igg、igm、iga、ige、igd中的任意一种的重链恒定区。
68.本领域技术人员公知，每个重链可变区可由三个互补决定区(cdr)和四个框架区(fr)区构成，每个轻链可变区可由三个互补决定区(cdr)和四个框架区(fr)区构成，互补决定区(cdr，通常有cdr1、cdr2及cdr3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。在一些实施方式中，从n-末端至c-末端，重链可变区与轻链可变区均包含fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3与fr4。重链可变区或轻链可变区的cdr序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和chothia定义，例如参见kabat et al.,“sequences of proteins ofimmunological interest”，national institutes of health,bethesda，md.(1991)；al-lazikani et al.，j mol biol 273:927-948(1997)；以及martin et al.，proc.natl.acad.sci.usa 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据kabat定义或者chothia定义来确定重链可变区或轻链可变区序列中cdr序列。在本技术的实施方案中，利用chothia定义确定cdr序列。
69.在本文中，术语“同一性”或被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。在本文中，提及的与氨基酸序列具有百分比同一性的氨基酸序列是指在所提及的氨基酸序列的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
70.在本文中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
71.在本文中，术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、snp和互补序列，以及明确指出的序列。
72.在本文中，术语“ec50值”是指半数最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect,ec50)，指能引起50％最大效应的浓度。
73.在本文中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对它的配偶体y的亲和力通常可以由平衡解离常数(kd)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测定亲和力。
74.在本文中，术语“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成
所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。
75.在本文中，术语“靶向tau蛋白的重组抗体”表示能够以足够的亲和力结合tau蛋白、能够用作靶向tau蛋白的诊断剂和/或治疗剂的重组抗体。
76.本技术的靶向tau蛋白的重组抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的tau蛋白以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本技术的靶向tau蛋白的重组抗体与作为其靶标的tau蛋白的结合能力作为100％的情况下，本技术的靶向tau蛋白的重组抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如为9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
77.可通过本领域已知的多种标准的蛋白纯化或重组表达技术中的任何一种来产生适于产生抗体的tau蛋白。其他的β-淀粉样蛋白的形式还可包括tau蛋白表达细胞、含有tau蛋白的制品或细胞提取物或级分、部分纯化的tau蛋白。
78.在一些实施方式中，本技术采用磁微粒化学发光免疫分析法测定样品中tau蛋白水平，具体原理是：用化学发光剂直接标记抗原或抗体(化学发光剂标记物)，与被测样品中相应抗体或抗原、磁颗粒性(磁珠)的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂(发光底物)进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。
79.在本文中，elisa(enzyme linked immune sorbent assay)，即酶联免疫吸附测定，是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白结合，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是抗原或抗体能物理性地吸附于固相载体表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性或酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。
80.第一方面，本技术提供一种检测tau蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠；和经化学发光剂标记的靶向tau蛋白的第二抗体；其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。
81.甲苯磺酰活化的磁珠是一种超顺磁预活化功能磁性微球，与传统磁珠相比，其具有更快的磁响应性同时保持微球良好的分散性、极低的非特异性吸附和预活化的反应位点等特性，可以直接用来与多种生物配体(蛋白、多肽、寡聚核苷酸、药物分子等)进行高载量结合，实现共价键偶联在磁珠表面的目的。该磁珠具有长亲水性间隔臂，且反应条件比较温和，使它特别适用于生物活性大分子的固定化。
82.羧基磁珠具有超顺磁性、快速磁响应性、丰富羧基官能团、单分散性和亚微米尺度粒径等特点，能够在特殊化学试剂(如edc)的作用下将多肽、蛋白、抗体、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面。
83.在一些实施方式中，所述靶向tau蛋白的第一抗体与磁珠的质量比为1:(20～60)，
h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，其中：所述cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:1(gftftdy)所示；所述cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:3(rnkangyt)所示；所述cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:5(eedyrhgfpy)所示；所述cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:7(nssqsllntgnqknyla)所示，所述cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:9(galtres)所示；所述cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:11(qndhsyplt)所示；所述靶向tau蛋白的第二抗体包含三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，其中：所述cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:2(gfvfidy)所示；所述cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:4(rnkangyr)所示；所述cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:6(egsypygfpd)所示；所述cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:8(kssqsllhsgnqknyla)所示；所述cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:10(gastres)所示；所述cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:12(qndhsypft)所示。
94.在一些实施方式中，所述靶向tau蛋白的第一抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:13(evmlqesgg glvqpgsslrltcatsgftftdyymswvrqppgkalewlgvirnkangy tteysasvkgrftisrdntqgilylhmntlsaedsatyycareedyrhgf pywgqgtlvtvsa)所示，或为与seq id no:13具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:15(diimtqspsslsvsvgekvtmncnssqsllntgnqkn ylawyqqkpgqtpkllihgaltresgipdrftgrgsgtdftltissvqaed lavyycqndhsypltfgtgtklelrrad)所示，或为与seq id no:15具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述靶向tau蛋白的第二抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14(evkliesggglmqpgsslrlscass gfvfidyymswvrqppgkalewlglvrnkangyrteysstvkgrftisr dnsqgilylhmntlsaedsatyycaregsypygfpdwgqgtlvtvsa)所示，或为与seq id no:14具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16(div mtqspsslsasvgervtmnckssqsllhsgnqknylawyqqkpgqqpkl lihgastresgvpdrftgrgsgtdftltissvqaedlalyycqndhsypft fgtgtklelrran)所示，或为与seq id no:16具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
95.在一些实施方式中，前述任一项检测tau蛋白的试剂盒用于诊断阿尔兹海默症。
96.第二方面，本技术提供一种前述任一项检测tau蛋白的试剂盒在制备用于检测tau蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。
97.第三方面，本技术还提供一种检测样品中tau蛋白含量的方法，其包括以下步骤：将被测样品、靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠和化学发光剂标记的靶向tau蛋白的第二抗体混合，孵育后进行磁分离；洗涤后加入底物，测定被测样品的发光值；利用tau蛋白标准品的发光值计算出被测样品中tau蛋白的含量；其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。
98.在一些实施方式中，所述靶向tau蛋白的第一抗体与磁珠的质量比为1:(20～60)，
例如可为1:20、1:22、1:25、1:28、1:30、1:32、1:35、1:37、1:40、1:43、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:57、1:60等，优选为1:(25～50)。
99.在一些实施方式中，所述靶向tau蛋白的第二抗体与化学发光剂的物质的量之比为1:(6～50)，例如可为1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:10.5、1:11、1:11.5、1:12、1:12.5、1:13、1:13.5、1:14、1:14.5、1:15、1:15.5、1:16、1:16.5、1:17、1:17.5、1:18、1:18.5、1:19、1:19.5、1:20、1:20.5、1:21、1:21.5、1:22、1:22.5、1:23、1:23.5、1:24、1:24.5、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50等，优选为1:(10～30)。
100.在一些实施方式中，被测样品为脑脊液，被测样品至少为50μl，例如可为50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、110μl、120μl、130μl、140μl、150μl、160μl、170μl、180μl等，优选至少为100μl，孵育时间至少为15min，例如可为15min、16min、17min、18min、19min、20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min、40min等
101.在一些实施方式中，被测样品为脑脊液，被测样品至少为50μl，优选至少为100μl，孵育时间至少为15min，每微升被测样品，需要使用0.005～0.015μg靶向tau蛋白的第一抗体和0.05～0.15ng靶向tau蛋白的第二抗体，每微升被测样品需要使用的靶向tau蛋白的第一抗体例如可为0.005μg、0.006μg、0.007μg、0.008μg、0.009μg、0.01μg、0.011μg、0.012μg、0.013μg、0.014μg、0.015μg等，每微升被测样品需要使用的靶向tau蛋白的第二抗体例如可为0.05ng、0.06ng、0.07ng、0.08ng、0.09ng、0.1ng、0.11ng、0.12ng、0.13ng、0.14ng、0.15ng等。
102.在一些实施方式中，所述靶向tau蛋白的第一抗体、靶向tau蛋白的第二抗体为前述第一方面中所述的靶向tau蛋白的第一抗体、靶向tau蛋白的第二抗体。
103.实施例
104.以下将结合具体实施例说明本技术内容，但本技术范围不限于此。如果没有特殊说明，以下实施例中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得。所使用的方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据实施例内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应结果。
105.实施例1重组抗原tau-abp的制备
106.本实施例中重组抗原的制备方法为：借助文献和数据库确认abp标签氨基酸序列(uniport，p19909)和tau-f氨基酸序列(uniport，p10636-8)(2n4r/tau-441形式)，密码子优化后分别串联构建至pet30a载体。载体测序正确后转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态并进行重组抗原的制备与纯化。经由ni-nta agarose(qiagen，货号30210)纯化得到重组抗原。其中，重组抗原tau-abp的氨基酸序列如seq id no:17所示，密码子优化后的编码重组抗原tau-abp的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:18所示。
107.实施例2重组抗体rtau-a和rtau-b的制备
108.本实施例中重组抗体的制备方法为：使用实施例制备的重组抗原tau-abp对小鼠进行免疫，获得灵敏度最高的鼠源单克隆抗体细胞系组合后进行抗体可变区序列测序，根据可变区序列完成嵌合载体构建并转染至hek293t细胞系中进行重组抗体表达，其中，所用的轻链载体为(pfuse2ss-clig-mk，invivogen公司)，重链载体为(pfusess-chig-mg1，invivogen公司)，上述两个载体均为商业化载体，自带恒定区序列，无需额外处理。重组抗
体在hek293t细胞系中表达后，经由proteing填料得到纯化后的重组抗体rtau-a和rtau-b。其中，rtau-a重链可变区的氨基酸序列如seq id no:13所示，rtau-a轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:15所示，rtau-b重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，rtau-b轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示。
109.实施例3重组抗体rtau-a和rtau-b性能验证
110.(1)重组抗体浓度测定
111.借助bca(bicinchoninic acidassay)技术对多批次不同重组抗体进行浓度检测，浓度统计结果如下表1所示，表1中显示的是纯化后的重组抗体浓度。使用的是bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天，货号p0010)。具体按照试剂盒说明书操作。
112.表1
113.浓度(mg/ml)2022080120220802rtau-a12.313.2rtau-b10.912.1
114.(2)重组抗体浓度测定
115.借助elisa技术对多批次的重组抗体进行亲和力检测。酶标板每孔包被100ng tau抗原，加入倍比稀释的重组抗体37℃温育1小时。温育结束后加入带有hrp标记的羊抗人二抗，最后加入tmb显色，加入2m硫酸终止反应，置酶标仪波长于450nm并进行检测，检测结果分别如下表2～5所示。
116.20220801批次rtau-a：
117.表2
[0118][0119][0120]
20220802批次rtau-a：
[0121]
表3
[0122][0123]
20220801批次rtau-b：
[0124]
表4
[0125][0126]
20220802批次rtau-b：
[0127]
表5
[0128][0129][0130]
根据sigmaplot 13.0软件计算重组抗体各批次ec50，数据总结于下表6中，表6结果显示上述重组抗体亲和力较高。相对于现有技术中的nm级的kd值，本技术的重组抗体的kd值能够达到pm级，约为现有技术的千分之一，本技术重组抗体亲和力远远高于现有技术的抗体亲和力。
[0131]
表6
[0132][0133]
实施例4检测tau蛋白的试剂盒的制备以及检测过程
[0134]
(1)抗体的包被
[0135]
选择甲苯磺酰活化的磁珠(thermo dynabeads
tm m-280tosylactivated，cat#14204)和羧基磁珠(thermo dynabeads
tm m-270carboxylic acid，cat#14305d)分别涡旋混匀后超声处理5min并充分重悬。分别用移液枪吸取充分重悬的磁珠母液100μl(约10mg磁珠)，磁分离5min去除液体。
[0136]
甲苯磺酰活化的磁珠系统：加入165μl 0.1m硼酸盐缓冲液(ph 9.5)，以及rtau-a重组抗体100μg、200μg、400μg并充分混匀并于37℃孵育过夜。孵育结束后，磁分离5min去除液体。加入10％ bsa 37℃封闭3h。封闭结束后，磁分离5min去除液体。最后加入tbs-t缓冲液(0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.1％bsa，0.5％吐温-20和0.1％proclin300)4℃保存待用。本实施例中重组抗体与磁珠的质量比分别为1:25、1:50、1:100。需将包被后的母液继续稀释20倍配置为tau蛋白抗体包被磁珠工作液使用。
[0137]
羧基磁珠系统：加入1ml 0.1m mes缓冲液(ph 5.0)重悬磁珠，加入tau重组抗体100μg、200μg、400μg并涡旋混匀。室温下旋转混匀30分钟后，加入100μl偶联试剂(10mg/ml edc，溶于冰预冷ph 5.0的0.1m mes缓冲液，现配现用)。随后继续室温下旋转混匀3小时。孵育结束后，磁分离5min去除液体。最后加入tbs-t缓冲液(0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.1％bsa，0.5％吐温-20和0.1％proclin300)4℃保存待用。本实施例中重组抗体与磁珠的质量比分别为1:25、1:50、1:100。需将包被后的母液继续稀释20倍配置为tau蛋白抗体包被磁珠工作液使用。
[0138]
(2)抗体标记
[0139]
吸取rtau-b重组抗体0.1mg，与8.25μl 4mm nsp-sa-nhs(heliosense，cat#hs-11015005，溶于dmf中)溶液充分混合2h。向溶液中补充200μl5％dl-赖氨酸，继续混和30min。使用sephadex g-25脱盐，tbs-t缓冲液(0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.1％bsa，0.5％吐温-20和0.1％proclin300)。补加等体积甘油充分混匀后，-20℃保存待用。本实施例中重组抗体与nsp-sa-nhs的物质的量比1:20。需将标记后的母液继续稀释4000倍配置为β-淀粉样蛋白标记抗体工作液使用。
[0140]
(3)抗原溯源
[0141]
在g1200平台按照说明书使用g total tau(fujirebio，货号231302)对tau抗原进行溯源。
[0142]
(4)校准品和质控品的分装
[0143]
tau的校准品及质控品均由抗原和样品稀释液配置而成。其中tau校准品的浓度为300pg/ml和1200pg/ml；tau质控品的浓度为300pg/ml和1500pg/ml。样品稀释液为ph 7.4的pbs缓冲液，且每升样品稀释液还含有1％bsa和0.1％proclin-300。样品稀释液为ph7.4的pbs缓冲液，且每升样品稀释液还含有1％ bsa和0.1％ proclin300。
[0144]
(5)试剂盒组装
[0145]
将3个批次小试生产的包被抗体、标记抗体分装于试剂仓内，与校准品、质控品一并组装成试剂盒。具体信息如下表7所示：
[0146]
表7
[0147][0148]
(6)上机检测
[0149]
检测流程：以全自动化学发光免疫分析仪(smart 500s全自动化学发光分析仪，重庆科斯迈生物科技有限公司)为检测工具，检查并补充耗材，开机后完成自检。手动或扫码输入总tau测试所需参数及试剂批号，并将试剂放于相应试剂位。使用tau校准品对主曲线进行校准，随后使用tau质控品对检测系统进行质控。质控合格后，在样本位依次加入待测样本进行检测。检测完毕后进行数据输出及分析整理。
[0150]
反应体系：机器自动吸取样本150μl并与100μl磁珠工作液和100μl标记抗体工作液充分混匀，并于37℃孵育20min后进行磁分离。弃掉上清后加入免疫分析仪配套洗液(pbs和吐温-20)，重复清洗3次。随后将反应被送入暗室，并加入免疫分析仪配套发光激发液a(硝酸和过氧化氢水溶液)、发光激发液b(氢氧化钠水溶液)各100μl进行发光反应，并记录发光值。结合已录入并校准后的计算曲线计算得到样本对应浓度值。
[0151]
对上述两种不同磁珠系统及多个不同包被抗体浓度组合进行交叉组合并检测其线性。每个组合每个抗原浓度进行3次重复并统计平均值。其检测结果如下表8所示：
[0152]
表8
[0153][0154]
实施例5标记抗体偶联比优化
[0155]
(1)抗体的包被：参照实施例4中羧基磁珠的抗体包被进行，其中，rtau-a重组抗体使用量为200μg。
[0156]
(2)抗体标记：吸取rtau-b重组抗体0.1mg，0.25mg，0.5mg和0.75mg，与8.25μl 4mm nsp-sa-nhs(heliosense，cat#hs-11015005，溶于dmf中)溶液充分混合2h。向溶液中补充200μl 5％dl-赖氨酸，继续混和30min。使用sephadex g-25脱盐，tbs-t缓冲液(0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.1％bsa，0.5％吐温-20和0.1％proclin300)。补加等体积甘油充
分混匀后，-20℃保存待用。本实施例中重组抗体rtau-b与nsp-sa-nhs的物质的量比分别为1:50，1:20，1:10和1:6.7。需将标记后的母液继续用tbs-t缓冲液稀释4000倍配置为工作液使用。
[0157]
(3)抗原溯源：参照实施例4进行。
[0158]
(4)上机检测：参照实施例4进行。
[0159]
对上述标记抗体偶联比和稀释比组合进行交叉组合并检测其线性。每个组合每个抗原浓度进行3次重复并统计平均值。其检测结果如下表9所示：
[0160]
表9
[0161][0162]
实施例6包被缓冲液、标记物缓冲液的优化
[0163]
(1)抗体的包被：参照实施例5进行。
[0164]
(2)抗体标记：参照实施例5进行，其中，rtau-b重组抗体使用量为0.25mg。
[0165]
(3)抗原溯源：参照实施例5进行。
[0166]
(4)上机检测：参照实施例5进行。
[0167]
本实施例中，作为包被缓冲液和标记物缓冲液的tbs-t缓冲液的组成相同。
[0168]
选取5种tbs-t缓冲液进行试剂盒灵敏度检测，其中，5种tbs-t缓冲液均为0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.1％bsa和0.1％proclin300，并且分别补充有0％、0.1％、0.5％、1％、2％吐温-20。检测结果如下表10所示，
[0169]
表10
[0170]
吐温-20含量00.1％0.5％1％2％mean490.8483.5356.6216.6327.5sd26.37624.16019.16211.63935.107mean+2sd543.552531.770394.924239.878397.714对应抗原浓度pg/ml5.5415.4214.0182.4484.050
[0171]
选取12种tbs-t缓冲液进行试剂盒加速稳定性分析，将试剂盒置于37℃7天后进行检测，与未进行加热处理的对照组进行比较。其中，12种tbs-t缓冲液均为0.1m磷酸盐缓冲
体系，ph7.4，补充有1％吐温20，0.1％proclin300，并且分别补充有0％、0.1％、0.5％、1％bsa，以及0g/l、20g/l、40g/l海藻糖。检测结果如下表11所示。
[0172]
表11
[0173][0174]
实施例7上机检测程序优化
[0175]
(1)抗体的包被：参照实施例6进行，其中，tbs-t缓冲液为：0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.5％ bsa，1％吐温-20，40g/l海藻糖和0.1％proclin300。
[0176]
(2)抗体标记：参照实施例6进行，其中，tbs-t缓冲液为：0.1m磷酸盐缓冲体系，ph7.4，补充有0.5％ bsa，1％吐温-20，40g/l海藻糖和0.1％proclin300。
[0177]
(3)抗原溯源：参照实施例6进行。
[0178]
(4)上机检测：机器自动吸取样本50μl、100μl、150μl并与100μl磁珠工作液和100μl标记抗体工作液充分混匀，并于37℃孵育10min、15min、20min、40min后进行磁分离。弃掉上清后加入免疫分析仪配套洗液(pbs和吐温-20)，重复清洗3次。随后将反应被送入暗室，并加入免疫分析仪配套发光激发液a(硝酸和过氧化氢水溶液)和发光激发液b(氢氧化钠水溶液)各100μl进行发光反应，并记录发光值。结合已录入并校准后的计算曲线计算得到样本对应浓度值(pg/ml)。
[0179]
对上述不同的上机程序分别进行10例g1200平台溯源脑脊液样本检测，分析检测结果与所赋值的偏差。检测结果如下表12～14所示：
[0180]
表12
[0181][0182]
表13
[0183][0184]
表14
[0185][0186][0187]
实施例8试剂盒性能评估
[0188]
(1)准确度
[0189]
将溯源后的tau抗原配置成800pg/ml溶液，重复检测3次并进行数据分析。tau试剂盒检测准确度结果如下表15所示(浓度单位为pg/ml)。
[0190]
表15
[0191]
试剂盒批次检测结果1检测结果2检测结果3均值标示值偏差20221001805.657819.301858.511827.8238003.48％20221002828.331820.399839.22829.3178003.66％20221003801.535806.473779.436795.815800-0.52％
[0192]
综上，测量结果的相对偏差在
±
10％范围内，且3次结果都符合要求，以上3批试剂盒的准确度合格。
[0193]
(2)精密度
[0194]
依据美国临床实验室标准化委员会(nccls/clsi)文件ep5-a2方案进行，批内精密度和实验室间精密度采用多因素整合的嵌套设计进行实验，不同操作者，不同设备，不同地点，每天上、下午各检测一次，每个样本重复检测2次，连续检测20天，累计每批试剂盒各收集160个数据结果，计算其精密度。同时将溯源后的tau-abp抗原配置成200pg/ml和1500pg/ml溶液，重复检测3次并进行数据分析。检测结果如下表16所示：
[0195]
表16
[0196][0197]
综上，上述试剂盒对低、高浓度样本重复进行检测结果显示，其批内精密度和批间精密度cv均小于5％，说明上述试剂盒符合精密度性能评估要求。
[0198]
(3)线性范围
[0199]
分别选择1例补充tau-abp抗原的脑脊液，采用稀释液稀释13个浓度水平，每个稀释后的样本重复测试3次，计算其均值。依据结果逐渐减少浓度点计算相应的线性关系，确定试剂盒的最宽线性范围，tau试剂盒检测结果如下表17所示(浓度单位为pg/ml)。
[0200]
表17
[0201][0202]
上述表17显示，tau试剂盒在[10～4000]pg/ml的范围内相关系数r不低于0.9900
且无离群值。因此tau试剂盒线性范围为[10～4000]pg/ml。
[0203]
(4)灵敏度
[0204]
用上述试剂盒检测空白样本重复检测20次，进行灵敏度确定。tau试剂盒检测结果如下表18所示(浓度单位为pg/ml)：
[0205]
表18
[0206]
项目参数mean224.9sd12.964mean+2sd250.828对应浓度值2.549
[0207]
tau试剂盒测定的空白样本平均发光值平均值为224.9，将mean+2sd值带入反应曲线，得总tau试剂盒灵敏度为2.549pg/ml。
[0208]
(5)样本检测结果
[0209]
检测经g1200平台赋值的样本60例以确定试剂盒与该平台产品的一致性。对于超出对标试剂线性范围部分采用稀释上机的方式进行检测。分析结果如图1所示(浓度单位为pg/ml)，回归分析数据显示其y＝0.9788x+79.612，且r2＝0.9106，证明本产品与商业化产品具有良好一致性。
[0210]
由上述各实施例可以看出，本技术的tau试剂盒稳定性好、准确度高、精密度高，灵敏度高，试剂盒线性范围为[10～4000]pg/ml，试剂盒的线性范围远宽于现有技术的线性范围，试剂盒的检测上限为现有技术检出上限的8倍以上，同时本技术的试剂盒与商业化产品还具有良好一致性。
[0211]
以上所述，仅是本技术的较佳实施例而已，并非是对本技术作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本技术技术方案内容，依据本技术的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本技术技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种检测tau蛋白的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠；和经化学发光剂标记的靶向tau蛋白的第二抗体；其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体与磁珠的质量比为1:(20～60)，优选为1:(25～50)；优选地，所述靶向tau蛋白的第二抗体与化学发光剂的物质的量之比为1:(6～50)，优选为1:(10～30)；优选地，所述试剂盒还包括tau蛋白标准品、底物、包被缓冲液、标记物缓冲液、洗涤液、封闭液和样品稀释液；优选地，所述包被缓冲液和标记物缓冲液为tbs-t缓冲液，所述tbs-t缓冲液中包含吐温-20和bsa，优选所述tbs-t缓冲液还包含海藻糖；优选地，所述tbs-t缓冲液中包含0.7％～1.2％吐温-20和0.5％～1％bsa；优选地，所述tbs-t缓冲液中还包含30～50g/l海藻糖。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体包含三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，其中：所述cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:3所示；所述cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:5所示；所述cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:9所示；所述cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:11所示；所述靶向tau蛋白的第二抗体包含三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，其中：所述cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:2所示；所述cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:4所示；所述cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:6所示；所述cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:8所示；所述cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:10所示；所述cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:12所示。4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:13，或为与seq id no:13具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:15所示，或为与seq id no:15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述靶向tau蛋白的第二抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14，或为与seq id no:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示，或为与seq id no:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1～4中任一项所述的试剂盒，其中，其用于诊断阿尔兹海默症。6.权利要求1～5中任一项所述的试剂盒在制备用于检测tau蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。7.一种检测样品中tau蛋白含量的方法，其中，包括以下步骤：将被测样品、靶向tau蛋白的第一抗体包被的磁珠和化学发光剂标记的靶向tau蛋白的第二抗体混合，孵育后进行磁分离；洗涤后加入底物，测定被测样品的发光值；利用tau蛋白标准品的发光值计算出被测样品中tau蛋白的含量；其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体与磁珠的质量比为1:(20～60)，优选为1:(25～50)；优选地，所述靶向tau蛋白的第二抗体与化学发光剂的物质的量之比为1:(6～50)，优选为1:(10～30)。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述被测样品为脑脊液；优选地，所述被测样品至少为50μl，优选至少为100μl；更优选地，每微升被测样品，需要使用0.005～0.015μg靶向tau蛋白的第一抗体和0.05～0.15ng靶向tau蛋白的第二抗体；进一步优选地，孵育时间至少为15min。10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中，所述靶向tau蛋白的第一抗体、靶向tau蛋白的第二抗体为权利要求3或5中所述的靶向tau蛋白的第一抗体、靶向tau蛋白的第二抗体。

技术总结
本申请公开了一种检测Tau蛋白的试剂盒，其包括：靶向Tau蛋白的第一抗体包被的磁珠；和经化学发光剂标记的靶向Tau蛋白的第二抗体；其中，所述磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠或羧基磁珠。还公开了一种前述试剂盒在制备用于检测Tau蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途，以及一种检测样品中Tau蛋白含量的方法。本申请的试剂盒检测时间短、出限数值更低、线性范围更宽、检测灵敏度高，对阿尔兹海默病的早期发现以及治疗效果的动态追踪意义重大。的早期发现以及治疗效果的动态追踪意义重大。


技术研发人员：陈卓 王鹏
受保护的技术使用者：杭州星源华青生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/10/6