尿液外泌体miRNA标志物在制备急性移植物抗宿主病诊断试剂盒中的应用

211-5p的基因和启动子序列设计三对定量引物和内参基因用于荧光定量pcr检测；
14.(2)提取人的尿液外泌体rna；
15.(3)检测尿液外泌体中hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p的丰度水平；
16.(4)根据hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p中至少两种在移植后患者中的表达是否有显著性差异来评估是否发生agvhd。
17.更进一步方案，步骤(4)中显著性差异是指has-mir-411-5p和/或has-mir-143-3p的表达显著降低，has-mir-211-5p的表达显著增加。
18.其中，所述定量引物的序列如下：
19.hsa-mir-411-5p：
20.f-primer ccctagtagaccgtatagcgtac(seq no.4)，
21.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt(seq no.5)；
22.hsa-mir-143-3p：
23.f-primer cctgagatgaagcactgtagctc(seq no.6)，
24.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt(seq no.7)；
25.hsa-mir-211-5p：
26.f-primer ttccctttgtcatccttcgcct(seq no.8)，
27.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt(seq no.9)。
28.所述内参基因的引物序列为：
29.f-primer ctcgcttcggcagcaca(seq no.10)，
30.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt(seq no.11)。
31.进一步方案，步骤(2)中提取人的尿液外泌体rna，是先将收集的新鲜晨尿进行分梯度离心，然后提取尿液外泌体蛋白。
32.其中，提取尿液外泌体rna是用trizol法提取外泌体rna，用genecopoe ia成熟体mirna定量检测试剂盒进行cdna合成以及mirna定量检测不同患者尿液样本间hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p丰度水平。
33.具体的，所述分梯度离心包括：先低速离心后高超速梯度离心，其中低速离心为：2000g尿液样本，室温离心20分钟去除细胞和碎片，收取上清液以0.22μm滤膜过滤；高超速梯度离心为：13500g，室温离心20分钟收取上清；在4℃下，200000g，离心120分钟保留沉淀；20mlpbs清洗后，在4℃下，200000g，离心120分钟，最后使用50ulpbs重悬外泌体。
34.进一步方案，所述诊断试剂盒为mirna定量检测试剂盒。
35.本发明公开的诊断标志物为：hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p中至少两种在agvhd患者和移植后病人尿液外泌体中的表达，并探讨其作为agvhd诊断标志物的可能性。根据hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p中至少两种在移植后患者中的表达是否有显著性差异来评估是否发生agvhd，即当has-mir-411-5p、has-mir-143-3p的表达显著降低、has-mir-211-5p的表达显著增加中发生两项的，则判断移植后患者发生agvhd。
36.目前agvhd的诊断主要基于临床症状并辅以侵入性检查，但agvhd患者的体征和症状随着时间推移而有所不同，使得agvhd诊断极具挑战性，同时以往针对agvhd诊断分子标
志物的研究多集中于血液上。本发明从尿液这一收取更方便无创的体液入手，通过高通量测序发现这些分子标志物在移植后病人和agvhd患者尿液外泌体中呈现差异表达，通过qpcr进行验证后进一步证明其与agvhd的进程相关。本发明提供的诊断标志物解决了现有agvhd的诊断局限性，具有早期、准确、无创的诊断优点。
37.即本发明采用超速离心法分离提取人尿液外泌体，实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)技术分析三种mirna标志物在骨髓移植后发生agvhd的患者和未发病的患者的尿液外泌体中表达和差异。该方法优于现有的agvhd诊断技术。
38.本发明的积极效果在于：
39.本发明成功分离鉴定了人尿液外泌体；并公开尿液外泌体标志物has-mir-411-5p/143-3p/211-5p作为agvhd的诊断标志物；其中has-mir-411-5p/143-3p在agvhd患者中的表达较未发病患者低(p＜0.05)，而has-mir-211-5p在agvhd患者中的表达则显著增加(p＜0.05)。
附图说明
40.图1为人尿液外泌体透射电镜下形态结构以及标志性蛋白cd63、tsg101和阴性标记calnexin鉴定；
41.图2为移植后病人以及agvhd患者尿液外泌体has-mir-411-5p/143-3p/211-5p表达水平。
具体实施方式
42.以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
43.实施例1
44.一、尿液样本收集：
45.1.尿液样本均收集于中国科学技术大学附属第一医院(后简称为科大附院)。
46.2021年6月至2023年2月期间对科大附院白血病移植患者进行晨尿留取，将晨尿样本分成训练组(患者入院当天、移植前一天、移植后第五天、第七天和第十天，若发生agvhd加取一天)，验证组(经临床诊断确诊为agvhd的患者)。
47.2.样本收集与保存：使用50ml离心管编号后收集晨尿样本，2000g，室温离心20分钟去除细胞和碎片，收取上清液后以0.22μm滤膜过滤后保存于-80℃超低温冰箱。
48.二、尿液外泌体分离与鉴定：
49.1.解冻前期收集的晨尿样本，完全融化后13500g，室温离心20分钟收取上清；4℃条件下，200000g，离心120分钟保留沉淀；20mlpbs清洗后4℃条件下，200000g，离心120分钟，最后使用50ulpbs重悬外泌体分装到1.5mlep管里。
50.2.外泌体粒径分析：使用nanofcm仪器(福流生物flow nanoanalyzer)分析颗粒粒径分布。将超离得到的外泌体取出5ul稀释30倍检测。
51.3.透射电镜观察外泌体形态：将外泌体样品稀释两倍后滴加于200目铜网上沉淀1分钟，滤纸吸去浮液；2％磷钨酸10ul滴加于铜网上沉淀1分钟，滤纸吸去浮液；常温干燥数分钟；80kv进行电镜检测成像。透射电镜(hitachi，ht-7800)观察外泌体形态和大小。
52.4.westernblot检测外泌体标志蛋白：采用np-40裂解液(p0013f,beyot ime)提取外泌体蛋白，bca(p0010,beyot ime)测定蛋白浓度。12％sds-page分离蛋白，每道上样量为40ug总蛋白。湿转法将蛋白转移到pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1小时，剪膜后分别加入cd63、tsg101和calnexin抗体(1:1000)，4℃摇床封闭过夜，tbst洗5次每次7分钟，加入hrp标记的二抗(1:8000)，室温孵育1小时，孵育结束后tbst清洗5次每次7分钟，再按1:1比例配制显影液(p0018fs,beyot ime)，将显影液滴加到膜上，吸去多余显影液，曝光，拍照保存。
53.尿液外泌体透射电镜下形态结构如图1所示，其中a图为不同样本使用western blot检测外泌体特异性蛋白cd63和tsg101以及阴性蛋白calnexin的表达，结果显示符合外泌体的表征；b、c图分别为1.0um和200nm尺寸下所得的投射电镜扫描图，形态学符合外泌体的表征，说明提取到的囊泡为尿液外泌体。
54.尿液外泌体较血液外泌体提取难度高，本发明在参考以往文献和实验室实际操作的基础上，优化了超速离心法的条件，使用低速离心和过滤去除尿液里的细胞和碎片，再使用高超速离心提取尿液外泌体。以此方法得到的尿液外泌体呈杯状、部分有凹陷，粒径在80nm左右，表达cd63和tsg101等外泌体标志分子，不表达阴性蛋白calnexin，且训练组和验证组无明显差异。
55.hsa-mir-411-5p的诊断标记序列如seq no.1所示，hsa-mir-143-3p诊断序列如seq no.2所示，hsa-mir-211-5p诊断标记序列如seq no.3所示；
56.seq no.1：uaguagaccguauagcguacg
57.seq no.2：ugagaugaagcacuguagcuc
58.seq no.3：uucccuuugucauccuucgccu。
59.三、人尿液外泌体mirna测定
60.外泌体rna抽提和实时荧光定量pcr：50ul外泌体悬液中加入1mltrizol，反复吹打混匀后加入200ml氯仿，剧烈震荡2分钟，室温静置5-10分钟。4℃离心15000g，10分钟，离心后分三层分别是最下层红色酚-氯仿相，中间层，最上层无色水相。rna仅存在于水相中，取上清400ul至新ep管，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀后冰上静置10分钟，再4℃离心15000g，10分钟，弃上清得到rna沉淀。将新配制的75％乙醇1ml加入离心管混匀15000g，10分钟，弃上清重复洗涤一边再弃上清，吸尽管壁水珠后4℃离心15000g，30秒，等乙醇完全挥发，加入20uldepc水，用振荡器混匀后测浓度并保存于-80℃冰箱。
61.用genecopoe ia成熟体mirna定量检测试剂盒进行cdna合成以及mirna定量检测。
62.逆转录：(1)反应液配制：100ng总rna，2u/ul poly a polymerase 1ul，suresc irpt rtase mix(20
×
)1ul，5
×
pap/rt buffer i i 4ul，dd h2o补足至20ul，冰上操作。(2)反应条件：37℃孵育1小时，85℃温育5分钟。逆转录产物保存于-20℃。
63.qpcr定量检测mirna：(1)反应液配制：2
×
al l-in-one qpcr mix 10ul，相应mirna qpcr primer 2ul，universal adaptor pcr primer 2ul，cdna 2ul，加ddh2o补足至20ul，重复3次；(2)反应条件：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒，tm－2℃退火20秒，72℃延伸10秒(40个循环)；95℃15秒；30℃30秒。反应完成后应用graphpad pri sm分析数据。
64.其中三种mirna的定量引物序列分别为：
65.hsa-mir-411-5p：
66.f-primer ccctagtagaccgtatagcgtac，
67.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt；
68.hsa-mir-143-3p：
69.f-primer cctgagatgaagcactgtagctc，
70.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt；
71.hsa-mir-211-5p：
72.f-primer ttccctttgtcatccttcgcct，
73.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt。
74.内参基因u6的引物序列为：
75.f-primer ctcgcttcggcagcaca，
76.r-primer aacgcttcacgaatttgcgt。
77.荧光定量pcr定量检测mi crorna的相对表达变化量时，相对表达量的计算用公式rq＝2-δct，δct＝ctmir-ctmir-16。统计学分析采用spss22.0统计分析软件，p《0.05时，认为结果在统计学上有显著性差异。分析内容为mi crorna在尿液外泌体中表达的个体差异性分析、roc诊断分析以及spearman相关性分析。该结果说明mi crorna是否可作为急性移植物抗宿主病的生物标志物。
78.试验例
79.验证组尿液外泌体mirna表达：
80.采用qpcr检测前期测序得到的差异表达基因hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p(如图2所示)，has-mir-411-5p/143-3p在agvhd患者中的表达较未发病患者低(p＜0.05)，而has-mir-211-5p在agvhd患者中的表达则显著增加(p＜0.05)。因此它们可以作为骨髓移植后agvhd的诊断标志物，且本发明公开的诊断方法创新性和准确性优于现有活检技术。
81.应用例：
82.在实际诊断中，收取骨髓移植后患者尿液提取尿液外泌体rna后进行实时荧光定量pcr，检测其中hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p的表达，若hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p显著降低，hsa-mir-211-5p显著升高，三者满足其二则可说明患者发生agvhd。
83.本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

技术特征：
1.尿液外泌体mirna标志物在制备急性移植物抗宿主病诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述尿液外泌体mirna标志物是hsa-mir-411-5p，hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p中至少两种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述hsa-mir-411-5p的诊断标记序列如seq no.1所示，hsa-mir-143-3p诊断序列如seq no.2所示，hsa-mir-211-5p诊断标记序列如seq no.3所示；seq no.1：uaguagaccguauagcguacgseq no.2：ugagaugaagcacuguagcucseq no.3：uucccuuugucauccuucgccu。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒的判断步骤为：(1)先根据尿液外泌体mirna标志物hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p的基因和启动子序列设计三对定量引物和内参基因用于荧光定量pcr检测；(2)提取人的尿液外泌体rna；(3)检测尿液外泌体中hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p的表达变化量；(4)根据hsa-mir-411-5p、hsa-mir-143-3p和hsa-mir-211-5p中至少两种在移植后患者中的表达是否有显著性差异来评估是否发生agvhd。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(4)中显著性差异是指has-mir-411-5p和/或has-mir-143-3p的表达显著降低，has-mir-211-5p的表达显著增加。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(2)中提取人的尿液外泌体rna，是先将收集的新鲜晨尿进行分梯度离心，然后提取尿液外泌体蛋白。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述分梯度离心包括：先低速离心后高超速梯度离心，其中低速离心为：2000g尿液样本，室温离心20分钟去除细胞和碎片，收取上清液以0.22μm滤膜过滤；高超速梯度离心为：13500g，室温离心20分钟收取上清；在4℃下，200000g，离心120分钟保留沉淀；20mlpbs清洗后，在4℃下，200000g，离心120分钟，最后使用50ulpbs重悬外泌体。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒为mirna定量检测试剂盒。

技术总结
本发明公开尿液外泌体miRNA标志物在制备急性移植物抗宿主病诊断试剂盒中的应用，所述尿液外泌体miRNA标志物是hsa-miR-411-5p，hsa-miR-143-3p和hsa-miR-211-5p中至少两种。本发明成功分离和鉴定人尿液外泌体，并检测尿液外泌体miRNA中hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p和hsa-miR-211-5p的表达，若hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p显著降低，hsa-miR-211-5p显著升高，三者满足其二则可说明患者发生aGVHD。本发明提供的诊断标志物解决了现有aGVHD的诊断局限性，具有早期、准确、无创的诊断优点。断优点。断优点。


技术研发人员：胡杰 沈佐君
受保护的技术使用者：安徽省立医院（中国科学技术大学附属第一医院）
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/10/6