一种对再生障碍性贫血具有治疗作用的碳点

1.本发明涉及医药领域，具体涉及当归炭碳点(纳米粒子/纳米颗 粒/碳量子点/纳米类成分)的制备及其应用。


背景技术：

2.当归炭具有悠久的应用历史和确切的临床疗效，在被广泛应用于 治疗各种出血性疾病的同时，古代医籍中也有关于当归炭止血、补血 的记载。现代也有用当归炭改善贫血的研究，但遗憾的是，其物质基 础及药效作用机制至今尚未阐明，影响了当归炭临床应用的进一步发 展。
3.化疗作为临床常用的癌症治疗方法之一，可以有效抑制癌细胞的 生长和转移，但也会杀死正常细胞。大多数化疗药物都会引起不同程 度的骨髓抑制，严重影响患者的生活质量，已成为癌症治疗的最大障 碍。目前，化疗药物诱导的造血损伤的治疗主要采用重组人粒细胞集 落刺激因子、促红细胞生成素和造血干细胞移植。虽然疗效显著，但 长期频繁的重复治疗会给患者带来巨大的经济压力。
4.因此，寻找一种安全、廉价的治疗化疗药物所致造血损伤的策略 成为当前临床的迫切需求。


技术实现要素：

5.术语界定：当归炭纳米粒子(纳米颗粒/碳量子点/碳点/纳米类 成分)为从当归炭中分离纯化提取得到的一种粒径小于10nm的新型 纳米物质。
6.有鉴于此，本发明的目的在于：提供一种安全、廉价的治疗化疗 药物所致造血损伤的当归炭纳米类成分，该成分具有良好的生物安全 性，动物实验发现其可以有效改善化疗药物引起的造血损伤，从而揭 示当归炭治疗贫血的物质基础为碳点，并首次从当归炭中提取纯化出 该类成分。
7.具体而言，本发明是这样实现的，一种制备当归炭碳点的方法， 包括如下步骤：
8.1)将当归药材置于密封坩埚中，在60-500℃下煅烧0.5-1.5h，冷却 后，既得当归炭；将当归药材置锅内，开盖，80-900℃下炒至内 外均呈焦黑色，既得当归炭；并粉碎成粉末，备用；
9.2)当归炭粉末加入去离子水为，80-100℃下煎煮0.5-2.5小时，冷 却；
10.3)用微孔滤膜过滤，滤液混合并减压浓缩；
11.4)用500-10000da透析袋对浓缩物进行透析，收集透析袋内溶液； 或用500-1000da超滤管超滤，收集超滤管内截留的溶液，60℃ 以下干燥并称重，即得。
12.进一步优选地，步骤1)升温过程如下：第一阶段，升温至60-100℃， 升温过程时长1-10min，维持15-60min；第二阶段，升温至300-500℃， 升温过程时长10-35min，维持30-90min。坩埚可以是马弗炉或密闭的 反应釜中。
13.进一步优选地，步骤2)中当归炭粉∶去离子水＝1∶10-50。
14.进一步优选地，步骤3)微孔滤膜过滤的直径为0.22-0.46μm。
15.进一步优选地，步骤4)用1000da透析袋对浓缩物进行透析至少3 天。
16.进一步优选地，当归碳量子点，粒径为0.1-9.8nm。
17.所述的当归炭纳米类成分包括但不限于c元素、n元素和0元素。
18.所述的当归碳量子点在制备治疗造血损伤药物中的用途。
19.所述的造血损伤可以是化疗药物引起的、原发性造血功能障碍、或 辐射所导致的造血功能障碍症状。
20.所述的当归碳量子点与药学上可接受的辅料制备成临床用制剂；所 述药物的剂型包括但不限于注射剂、口服液体制剂、硬胶囊、软胶囊、 片剂、栓剂、水丸、蜜丸、浓缩丸、膏剂、散剂、乳剂、糊剂、涂抹剂。
21.本发明提供了一种当归荧光碳量子点的制备方法及应用，该方法操 作简单、绿色环保、成本低、重复性好且产品颗粒细小稳定，制得的荧 光碳量子点的荧光量子产率高，量子产率为3％以上。
附图说明
22.图1：当归炭纳米类成分表征图。
23.图2：当归炭纳米类成分表面元素分析图。
24.图3：小鼠体重变化如(3a)；图3b-e各组小鼠血象检查；如图3f-h 所示，小鼠的肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数。
[0025][0026]
图4：骨髓造血细胞比较图。
[0027]
图5：化疗药物诱导后小鼠血清中il-2、ifn-γ、il-17，tnf-α，tgf
‑ꢀ
β1，ifn-γ，m-csf和g-csf含量比较图。
[0028]
图6：western blot检测结果。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本 领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权 利要求所限定的范围。
[0030]
实施例1：一种制备当归炭碳量子点的方法，包括如下步骤：
[0031]
将当归药材置于密封坩埚中，并用马弗炉下煅烧1h，马弗炉升 温流程如下：第一阶段，升温至75℃，升温过程时长5min，维持 25min；第二阶段，升温至350℃，升温过程时长25min，维持1h。 待马弗炉自然冷却至室温后，将碳化的当归取出并研磨成粉末。然后， 将当归碳粉末以20倍去离子水为溶剂，100℃下煎煮1小时。冷却后 的溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤，并重复上述操作两次。滤液混合 并减压浓缩后，用1000da透析袋对浓缩物进行透析，每天更换袋外 的去离子水，透析一周。最后，将透析袋内的透析溶液冷冻干燥并称 重，以便进行以下实验。
[0032]
实施例2：一种制备当归炭碳量子点的方法，包括如下步骤：
[0033]
将当归药材置于密封坩埚中，并用马弗炉下煅烧1.5h，马弗炉 升温流程如下：第
一阶段，升温至60℃，升温过程时长10min，维 持60min；第二阶段，升温至300℃，升温过程时长35min，维持 1.5h)。待马弗炉自然冷却至室温后，将碳化的当归取出并研磨成粉 末。然后，将当归炭粉末以10倍去离子水为溶剂，100℃下煎煮1小 时。冷却后的溶液用0.46μm的微孔滤膜过滤，并重复上述操作两次。 滤液混合并减压浓缩后，用500da透析袋对浓缩物进行透析，每天 更换袋外的去离子水，透析一周。最后，将透析袋内的透析溶液冷冻 干燥并称重，以便进行以下实验。
[0034]
实施例3：一种制备当归炭碳量子点的方法，包括如下步骤：
[0035]
将当归药材置于密封坩埚中，并用马弗炉在350℃下煅烧0.5h (马弗炉升温流程如下：第一阶段，升温至100℃，升温过程时长 1min，维持15min；第二阶段，升温至500℃，升温过程时长30min， 维持0.5h。待马弗炉自然冷却至室温后，将碳化的当归取出并研磨 成粉末。然后，将当归炭粉末以50倍去离子水为溶剂，100℃下煎煮 1小时。冷却后的溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤，并重复上述操作 两次。滤液混合并减压浓缩后，用10000da透析袋对浓缩物进行透 析，每天更换袋外的去离子水，透析3天。最后，将透析袋内的透析 溶液冷冻干燥并称重，以便进行以下实验。
[0036]
实施例4：一种制备当归碳量子点的方法，包括如下步骤：
[0037]
将当归药材置于密封坩埚中，并用马弗炉下煅烧2h，马弗炉升 温流程如下：第一阶段，升温至130℃，升温过程时长3min，维持 10min；第二阶段，升温至280℃，升温过程时长35min，维持2h)。 待马弗炉自然冷却至室温后，将碳化的当归取出并研磨成粉末。然后， 将当归炭粉末以5倍去离子水为溶剂，100℃下煎煮1小时。冷却后 的溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤，并重复上述操作两次。滤液混合 并减压浓缩后，用1000da透析袋对浓缩物进行透析，每天更换袋外 的去离子水，透析一周。最后，将透析袋内的透析溶液冷冻干燥并称 重，以便进行以下实验。
[0038]
实施例5：一种制备当归碳量子点的方法，包括如下步骤：
[0039]
将当归药材置锅内，开盖，80-900℃下炒至内外均呈焦黑色，既 得当归炭。将当归炭研磨成粉末。然后，将当归炭粉末以去离子水/ 不同浓度乙醇(0-100％)为溶剂，60-100℃提取1小时。冷却后的溶 液用0.22μm的微孔滤膜过滤，并重复上述操作两次。滤液混合并减 压浓缩后，用500或1000da超滤管超滤，收集超滤管内截留的溶液， 60℃以下干燥并称重，以便进行以下实验。
[0040]
一、物理外观、产率、表征结果检测
[0041]
1)对以上实施例的当归炭碳量子点的粒径以及量子产率进行结 果统计，统计结果如下表：
[0042]
表1各实施例的粒径以及量子产率
[0043][0044][0045]
注：量子产率的计算以349nm为激发波长，硫酸奎宁为对照品。
[0046]
2)采用电镜技术(高、低分辨电镜)、光学技术(紫光可见光分 析技术、荧光光谱分析技术、红外光谱分析技术)、以及x光电子能 谱技术表征并分析当归炭纳米类成分的形貌特征、官能团变化等物理 化学特征。
[0047]
图1：低分辨电镜图1a；当归炭纳米类成分的粒径为1.4-4.0nm (图1b)；高分辨电镜图，晶格间距为0.195nm(图1c)；x射线衍射 图(图1d)中23.08
°
处明显的衍射峰；荧光光谱表明(图1e)；当 归炭纳米类成分的最大激发波长为349nm，最大发射波长为455nm (图1f)。
[0048]
图2：傅里叶变换红外光谱(图2a)显示，当归炭纳米类成分在 3440cm-1
、2923cm-1
、1631cm-1
和1128cm-1
处出现一系列特征吸收 峰。
[0049]
图2b：x射线光电子能谱中观察到的三个主峰284ev、399ev 和531ev。
[0050]
图2c：高分辨率测量光谱表明，c 1s被拟合为287.7ev、285.6 ev和284.1ev三个峰，分别对应c＝o、c-o/c＝n和c-c/c＝c。
[0051]
图2d：高分辨率测量光谱表明，01s被拟合为532.3ev和530.8 ev的两个峰，分别对应c＝o和o-h。
[0052]
图2e：高分辨率测量光谱表明，n 1s被拟合为400.2ev和399.1 ev的两个峰，分别对应n-h和c-n。
[0053]
二、当归炭纳米类成分对化疗药物诱导的造血损伤小鼠的治疗作 用
[0054]
1.造模及给药
[0055]
1)分组以及给药方式：
[0056]
成年雄性balb/c小鼠体重20
±
2g，自由进食和饮水。将50只 小鼠随机分为五组，每组10只，分别为对照组(cg)、模型组(mg)、 当归炭纳米类成分高剂量组(ahg，0.76mg/kg)、当归炭纳米类成分 中剂量组(amg，0.38mg/kg)、当归炭纳米类成分低剂量组(alg， 0.19mg/kg)以及当归提取物组。
[0057]
2)造模：在实验开始的第一周，mg、ahg、amg和alg每天腹 腔注射环磷酰胺60mg/kg和灌胃给予白消安20mg/kg，同时cg给 予等量的生理盐水。从第一天开始，治疗组通过灌胃给予不同剂量的 当归炭纳米类成分，每天一次，连续21天。实验期间每天记录小鼠 体重。
实验结束时，小鼠摘眼球取血，以颈椎脱位处死小鼠后，立即 收集肝脏、脾脏和胸腺并称重。
[0058]
2.检测项目以及说明
[0059]
1)组织病理学检测
[0060]
小鼠处死后，收集小鼠一侧股骨，立即置入4％多聚甲醛中固定 留待病理检测，乙醇梯度脱水后进行石蜡包埋与he染色，于光学显 微镜下观察肝脏组织学特点。
[0061]
2)造血相关细胞因子检测
[0062]
采用elisa法检测小鼠血清中的白细胞介素2(il-2)，白细胞 介素10(il-10)，白细胞介素17(il-17)，肿瘤坏死因子α(tnf-α)， 转化生长因子β1(tgf-β1)，干扰素γ(ifn-γ)，巨噬细胞集落 刺激因子(m-csf)和粒细胞集落刺激因子(g-csf)。
[0063]
3)体重变化
[0064]
测量各组小鼠1-21天内体重的变化情况，以及肝脏/身体重 量％)、脾脏指数(脾脏/身体重量％)和胸腺指数(胸腺/身体重量％)
[0065]
5)骨髓病理学检测
[0066]
6)elisa检测
[0067]
化疗药物诱导后小鼠血清中il-2、ifn-γ、il-17和tnf-α的 含量变化。
[0068]
7)western blot检测结果
[0069]
小鼠脾脏组织中g-csf、p-stat3和p-jak2的蛋白表达水平。
[0070]
3.检测结果以及分析
[0071]
在实验期间，统计各组小鼠的各项生理、生化指标，采用spss22.0 软件统计。
[0072]
分析结果如下
[0073]
体重变化如(图3-1a)；图7b-e各组小鼠血象检查；如图7f-h 所示，小鼠的肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数
[0074]
图4所示，cg骨髓中大量的造血细胞(黑色箭头)反映了有核 细胞增殖活跃。相反，mg组造血细胞减少，脂肪细胞(黑色箭头) 增加，表明造血损伤小鼠骨髓组织的增殖受到抑制，并被脂肪组织取 代。当归炭纳米类成分可显著改善小鼠造血损伤的典型病理变化，特 别是在高剂量组，造血细胞显著增加，脂肪细胞几乎消失。
[0075]
图5所示，化疗药物诱导后小鼠血清中il-2、ifn-γ、il-17和 tnf-α的含量变化。化疗药物诱导后小鼠血清中il-2、ifn-γ、il-17 和tnf-α的含量显著升高(p＜0.01)。与mg相比，amg和ahg的il-17 水平表现出明显的下降(p＜0.01)。
[0076]
图6所示，mg小鼠脾脏组织中g-csf、p-stat3和p-jak2的蛋 白表达水平明显降低(p＜0.01)。相反，三个给药组均可显著提高 g-csf、p-stat3和p-jak2的表达(p＜0.01)，尤其是高剂量组。

技术特征：
1.一种制备当归炭碳点的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将当归药材置于密封坩埚中，在60-500℃下煅烧0.5-1.5h，或将当归药材置锅内，开盖，80-900℃下炒至内外均呈焦黑色，冷却后，并粉碎成粉末，备用；2)当归炭粉末加入去离子水，80-100℃下煎煮0.5-2.5小时，冷却；3)用微孔滤膜过滤，滤液混合并减压浓缩；4)用500-10000da透析袋对浓缩物进行透析，收集透析袋内溶液；或用500-1000da超滤管超滤，收集超滤管内截留的溶液，60℃以下干燥并称重，即得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)升温过程如下：第一阶段，升温至60-100℃，升温过程时长1-10min，维持15-60min；第二阶段，升温至300-500℃，升温过程时长10-35min，维持30-90min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以体积比计算，步骤2)中当归炭粉∶去离子水＝1∶10-50。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)微孔滤膜过滤的直径为0.22-0.46μm。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)用1000da透析袋对浓缩物进行透析至少3天。6.权利要求1至5任一项所述方法制得的当归炭碳点，粒径为1.4-4.0nm。7.根据权利要求6所述的当归炭碳点，其特征在于，所述的当归碳纳米类成分包括但不限于c元素、n元素和o元素。8.根据权利要求6所述的当归炭碳点在制备治疗造血损伤药物中的用途。9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的造血损伤可以是化疗药物引起的、原发性造血功能障碍、或辐射所导致的造血功能障碍症状。10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的当归炭碳点与药学上可接受的辅料制备成临床用制剂；所述临床用制剂包括但不限于注射剂、口服液体制剂、硬胶囊、软胶囊、片剂、栓剂、水丸、蜜丸、浓缩丸、膏剂、散剂、乳剂、糊剂、涂抹剂。

技术总结
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种制备当归碳量子点的方法及其应用。方法包括为将当归药材置于密封坩埚中煅烧或置锅内开盖炒黑，研磨成粉末备用；当归炭粉末加入去离子水，煎煮并用微孔滤膜过滤，用透析袋对浓缩物进行透析或超滤管超滤，冷冻干燥，即得。与现有技术相比，该方法操作简单、绿色环保、成本低、重复性好且产品颗粒细小稳定，制得的荧光碳量子点的荧光量子产率高，量子产率为3％以上。制备的产品具有良好的生物安全性，动物实验发现其可以有效改善化疗药物引起的造血损伤的作用。以有效改善化疗药物引起的造血损伤的作用。以有效改善化疗药物引起的造血损伤的作用。


技术研发人员：赵琰 屈会化 孔慧 张越 王庆国 刘育含
受保护的技术使用者：北京中医药大学
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2023/10/6