一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法及其在西洋参花皂苷鉴定中的应用

1.本发明关于中药成分分析鉴定技术领域，尤其涉及一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法及其在西洋参花皂苷鉴定中的应用。


背景技术：

2.西洋参花为五加科人参属植物西洋参(panax quinquefolium l
·
)地上部分的干燥花蕾。目前国内外对西洋参的研究主要集中于药用部位根部，对其地上部分花、茎叶及果实的研究报道相对较少。但花蕾作为植物营养成分的重要贮存器官，也含有丰富的皂苷类等成分，且近年来由于其大补元气、安神益智等功效被广泛用于保健品。为阐明其活性成分，证明其药理作用，对其化学物质进行基础研究非常有必要。
3.液质联用技术已被广泛应用于中药化学成分分析。二级或者多级质谱信息的采集方式，主要包括数据依赖采集(dda)与数据非依赖采集(dia)。dda得到的谱图准确度高、易于解析，但面对复杂成分时往往覆盖度低；而dia理论上能够采集所有母离子的裂解信息，但需要对母离子-子离子进行匹配，会引入一些假阳性结果。


技术实现要素：

4.针对以上技术问题，本发明提供一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法及其在西洋参花皂苷鉴定中的应用，本发明方法的构建基于超高效液相色谱/质谱以及迭代排除列表数据依赖采集模式(el-hddda)，能够实现西洋参花中多种微量皂苷成分的表征，可为其他人参属药材的分析鉴定提供参考。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，具体包括以下步骤：
7.s1、用甲醇水溶液对待测样品进行提取，得待测溶液；
8.s2、用超高效液相色谱/质谱联用分析方法对所述待测溶液进行检测，用高分辨数据依赖采集(hddda)方法采集离子的一级二级信息，并构建离子排除列表；
9.s3、用包含s2所得排除列表的hddda方法采集所述待测溶液的一级二级质谱信息，进行unifi处理后将所筛选的一级母离子质荷比和保留时间信息增添至排除列表，重复操作直至获得采集低丰度离子的二级信息。
10.该方法用hddda方法采集同一样品，unifi处理后增添排除列表，方法更新后重复采集同一样品，此时添加至排除列表的母离子将不再重复采集二级信息，最终经迭代排除后得以采集低丰度或一级响应不在前5强离子的二级信息，从而采集到更多有效的二级信息用于化合物的鉴定。
11.优选地，s1中所述甲醇水溶液的浓度为60％～80％v/v。可选70％v/v。
12.可选地，s1中提取的方法为超声提取，超声时间可选为1h左右，以确保化合物的充分提取。
13.结合第一方面，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
14.色谱柱：极性修饰十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
15.流动相a为0.095％～0.105％v/v甲酸水溶液，流动相b为0.095％～0.105％v/v甲酸乙腈溶液，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
[0016][0017][0018]
流速：0.28～0.32ml/min；
[0019]
柱温：25～35℃。
[0020]
在本发明所采用的色谱柱、流动相、线性洗脱程序、柱温等条件下，色谱峰分离效果好，检测离子数多，色谱峰形良好。
[0021]
以上线性梯度洗脱程序中，如果不同时间后流动相b的体积百分比有变化，则表示流动相在该时间段内是线性变化的，如，0min流动相b的比例为15％，2min流动相b的比例为20％，表示流动相b在0min至2min从15％线性增加到20％。4min与8min的流动相比例相同，表示这个时间段内流动相比例不变。
[0022]
优选地，所述色谱柱为csh c18。在本发明的色谱条件下，采用该色谱柱检测的离子数最多、保留效果最强且峰形及分离效果均较好。
[0023]
优选地，所述柱温为30℃。在本发明的色谱条件下，柱温30℃时色谱峰分离效果、检测离子数、色谱峰形的综合结果更好。
[0024]
优选地，所述流速为0.3ml/min。
[0025]
优选地，所述甲酸水溶液中的甲酸浓度为0.1％v/v。
[0026]
优选地，所述甲酸乙腈溶液中的甲酸浓度为0.1％v/v。
[0027]
结合第一方面，所述质谱采用离子淌度四极杆飞行时间质谱。
[0028]
优选地，所述质谱的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源，在负离子模式下采集
数据；所述离子源的参数为：毛细管电压1.5kv；锥孔电压40v；离子源温度120℃；脱溶剂气体温度500℃；脱溶剂气体流速(n2)800l/h；锥形气流速(n2)50l/h；ms1碰撞能量为6ev；hddda二级参数设置中ms2质量依赖梯度裂解能量为30/50
–
50/70ev，触发二级采集的母离子强度阈值为500计数，top n值设为5，即采集一级响应前5强离子的二级信息。
[0029]
优选地，所述质谱的质谱条件还包括：质谱扫描范围m/z 250
–
1500，每0.3s扫描一次；停止二级采集的时间(timeout)为1.2s；质量误差为80.00mda，碰撞截面积误差为
[0030]
优选地，所述质谱的质谱条件还包括：数据采集过程中连续注入外部校正液，用于进行负离子模式下质量数的精准校正。外部校正液可采用浓度为200pg/μl的lockspray tm
，以10μl/min的流速连续不断地注入，用于进行负离子模式下质量数(m/z 554.2620)的精准校正。
[0031]
结合第一方面，s3的具体操作包括：
[0032]
第一步、用hddda方法采集60％～80％v/v甲醇水溶液进行unifi处理后筛选响应值大于500的离子并去重复，得到第一部分离子质量数及对应的保留时间列表，将其添加至排除列表中，更新采集方法；
[0033]
第二步、在包含第一步所得排除列表的hddda方法上继续采集同一待测溶液数据，结合数据库进行unifi处理，将与数据库匹配的离子筛选出来，去掉重复质量数，得到第二部分离子质量数及对应的保留时间列表，继续添加至排除列表中，更新采集方法；重复三次，并在第一次和第二次中分别筛出未匹配列表中响应值大于10000和大于5000的离子。
[0034]
以及，本发明还提供上述检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法在西洋参花皂苷表征与鉴定中的应用。上述方法灵敏度高、分辨率高、准确性高、重现性好、分析时间短，能够鉴定出西洋参花中大量的皂苷类化学成分，可对西洋参花和含有西洋参花的保健品进行西洋参花的表征与鉴定。
[0035]
本发明的有益效果在于：本发明基于超高效液相色谱/离子淌度四极杆飞行时间质谱联用技术(uhplc/im-qtof-ms)，依赖于液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度和准确定性能力，构建了检测西洋参花中皂苷类化学成分的迭代排除列表数据依赖采集质谱方法，并将其首次应用于西洋参花中皂苷类成分的研究。本发明在dda设置中添加排除列表(el)，在包含排除列表的多次数据采集中，能够提高质谱对待测样品中微量成分或一级响应不在前五强的离子的二级质谱的获取性能，避免高丰度化学成分的二级数据的重复采集，可同时检测到微量级和高丰度化合物，能够大幅提升鉴定的覆盖度，克服了传统的dda方法对微量成分覆盖率低的缺点；且该方法具有高灵敏度、高分辨率、高准确性、重现性好和分析时间短等优点，可采用常规的样品处理方法，避免了繁琐的样品前处理，同时能根据高分辨质谱获得的化合物精确分子质量、碎片离子峰、色谱保留时间及对照品信息，结合相关文献数据鉴定规律，能够鉴定出西洋参花中更多的皂苷类化学成分。本发明为西洋参花中皂苷类化学成分深入分析表征提供了一种高效、快速、准确的分析鉴定方法，也为西洋参花的化学物质基础和药效活性成分研究提供理论依据和技术参考，有利于西洋参花的后续开发和利用。此外，该方法也可为其它人参属药材的分析鉴定提供参考。
附图说明
[0036]
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0037]
图1是本发明迭代排除数据采集流程图；
[0038]
图2是本发明实施例中60种对照品结构式图；
[0039]
图3-1是本发明实施例1中原人参二醇型中性皂苷化合物#204裂解示意图；
[0040]
图3-2是本发明实施例1中原人参二醇型中性皂苷化合物#212裂解示意图；
[0041]
图3-3是本发明实施例1中原人参三醇型中性皂苷化合物#47裂解示意图；
[0042]
图3-4是本发明实施例1中原人参三醇型中性皂苷化合物#39裂解示意图；
[0043]
图3-5是本发明实施例1中奥克梯隆型中性皂苷化合物#128裂解示意图；
[0044]
图3-6是本发明实施例1中奥克梯隆型中性皂苷化合物#7裂解示意图；
[0045]
图4-1是本发明实施例1中齐墩果酸型酸性皂苷化合物#238裂解示意图；
[0046]
图4-2是本发明实施例1中齐墩果酸型酸性皂苷化合物#233裂解示意图；
[0047]
图4-3是本发明实施例1中丙二酸酰化型酸性皂苷化合物#187裂解示意图；
[0048]
图4-4是本发明实施例1中丙二酸酰化型酸性皂苷化合物#252裂解示意图；
[0049]
图5是本发明对比例1中本发明与传统hddda模式的二级数量的对比图；
[0050]
图6是本发明对比例2中10根反相色谱柱的bpi图和保留行为两两比较图；
[0051]
图7是本发明对比例3中色谱分离中csh c18色谱柱柱温比较图；
[0052]
图8是本发明对比例4中指标成分在不同毛细管电压下峰面积比较图；
[0053]
图9是本发明对比例5中指标成分在不同锥孔电压下峰面积比较图；
[0054]
图10是本发明对比例6中4种指标化合物的hddda方法的mdrce图。
具体实施方式
[0055]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0056]
西洋参花含有丰富的皂苷类等成分，被广泛应用。为阐明其活性成分，证明其药理作用，对其化学物质进行基础研究非常有必要。
[0057]
液质联用技术的二级或者多级质谱信息的采集方式中，dda仅采集一级响应前5强离子的二级信息，对于共流出时的微量成分(强度非前五强的离子)不能采集到二级数据，故这类成分在用液质分析时往往不能被表征；dia需要对母离子-子离子进行匹配，会引入一些假阳性结果。
[0058]
为提高鉴定效率及覆盖度，鉴定更多的微量成分，本发明构建了检测西洋参花中皂苷类化学成分的迭代排除列表数据依赖采集方法，能够实现西洋参花中皂苷类化学成分较为全面深度的表征。该方法具体包括以下步骤：
[0059]
s1、用甲醇水溶液对待测样品进行提取，得待测溶液；
[0060]
s2、用超高效液相色谱/质谱联用分析方法对所述待测溶液进行检测，用hddda方法采集离子的一级二级信息，并构建离子排除列表；
[0061]
s3、用包含s2所得排除列表的hddda方法采集所述待测溶液的一级二级质谱信息，进行unifi处理后将所筛选的一级母离子质荷比和保留时间信息增添至排除列表，重复操
作直至获得采集低丰度离子的二级信息。
[0062]
本发明构建的包含迭代排除列表的数据依赖采集方法中，s3可主要从两个方面构建排除列表，一方面扣除空白溶剂及仪器本身的离子干扰，另一方面扣除西洋参花中已报道的化合物及响应高易鉴别的化合物。具体可采用如下构建规则：
[0063]
第一步、用hddda方法采集60％～80％v/v甲醇水溶液进行unifi处理后筛选响应值大于500的离子并去重复，得到第一部分离子质量数及对应的保留时间列表，将其添加至排除列表中，更新采集方法；
[0064]
第二步、在包含第一步所得排除列表的hddda方法上继续采集同一待测溶液数据，结合数据库进行unifi处理，将与数据库匹配的离子筛选出来，去掉重复质量数，得到第二部分离子质量数及对应的保留时间列表，继续添加至排除列表中，更新采集方法；重复三次，并在第一次和第二次中分别筛出未匹配列表中响应值大于10000和大于5000的离子。
[0065]
其迭代排除数据采集流程图如图1所示。基于4次排除列表的添加及方法更新，最终可获得一个包含重复采集或响应高的一级母离子质荷比和保留时间信息的排除列表。
[0066]
下面结合具体实施例来进一步说明。
[0067]
以下实施例中涉及的“自建人参属皂苷数据库”包括现有技术中已报道的人参属皂苷以及“advances and challenges in ginseng research from 2011 to 2020:the phytochemistry,quality control,metabolism,and biosynthesis.”(xue li1,jie liu1,tian-tian zuo1,ying hu,zheng li,hong-da wang,xiao-yan xu,wen-zhi yang*,de-an guo*.natural product reports,2022,in press.doi:10.1039/d1np00071c.)和“saponins in the genus panax l.(araliaceae):a systematic review of their chemical diversity”(wen-zhi yang,ying hu,wan-ying wu,min ye*,de-an guo*..phytochemistry,2014,106,7-24.doi:10.1016/j.phytochem.2014.07.012)中汇总的新发现的人参属皂苷，共计575种人参属皂苷的名称、分子式、中性质量数及结构式信息。
[0068]
以下实施例中所采用的试剂：
[0069]
乙腈(fisher，fair lawn，nj，usa)，甲醇(fisher，fair lawn，nj，usa)，甲酸(acs，wilmington，usa)均为lc-ms级纯；超纯水由milli-q水净化系统(millipore，bedford.ma，usa)制备，亮氨酸脑啡肽溶液(le；sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)。
[0070]
西洋参花药材购买产地为吉林省靖宇县；
[0071]
60种人参属皂苷对照品购买于上海诗丹德生物技术有限公司或成都德思特生物技术有限公司等(化合物名称、分子式、精确质量数、亚型对应具体信息如表1所示，对照品1-60的结构式见图2)。
[0072]
表1 60种人参属皂苷(1-60)对照品信息
[0073]
[0074]
[0075][0076]
以下实施例中所采用的分析仪器：
[0077]
超高效液相色谱系统(waters，milford，ma，usa)；离子淌度四极杆飞行时间质谱vion im-qtof(waters，milford，ma，usa)；milli-q integral 5纯水机(millipore，usa)；5804r型台式高速冷冻离心机(eppendorf，germany)；ms105du型十万分之一天平、me104型万分之一电子天平(mettler toledo，switzerland)；sb-4200dts/p超声波提取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，浙江，中国)；vortex-2旋涡混匀仪(上海泸析实业有限公司，上海，中国)。
[0078]
实施例1
[0079]
本发明实施例提供了一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的迭代排除列表数据依赖采集质谱方法。
[0080]
1、样品溶液的制备：
[0081]
1.1供试品溶液的制备
[0082]
取粉碎后(过三号筛)的西洋参花样品粉末，精密称定50.0mg，加入5ml70％的甲醇水溶液(v/v)，涡旋振荡2-3分钟，使其充分溶解，在30℃下超声提取样品1h，以4000rpm(3219g)离心10min，转移上清液至10ml容量瓶中；将残渣再加入3ml 70％的甲醇水溶液，重复以上提取方法，合并两次上清液至10ml容量瓶中；并用70％甲醇水溶液定容至10ml，摇匀静置，于14000rpm(11481g)离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜过滤，即得5mg/ml西洋参花供试品溶液，取100μl滤液用于lc-ms分析。
[0083]
1.2对照品溶液的制备
[0084]
分别精密称定表1中60种对照品各1.00mg，加入1ml 70％的甲醇水溶液(v/v)，涡旋振荡2-3分钟，使其充分溶解，于14000rpm(11481g)离心10min，取上清液，过0.22μm微孔
滤膜过滤，即得1mg/ml的60种对照品溶液母液。选择质量数不同的标准品母液等体积混合，将60种对照品分组最后得到3组混标溶液，浓度分别为0.047mg/ml、0.050mg/ml、0.052mg/ml，用作所采集的对照品溶液。
[0085]
1.3液相色谱方法
[0086]
固定相：csh c18(2.1
×
100mm，1.7μm)色谱柱；
[0087]
流动相：a相为0.1％甲酸水溶液，b相为0.1％甲酸乙腈；
[0088]
梯度洗脱：0-2min，15-20％(b)；2-4min，20-22％(b)；4-8min，22-22％(b)；8-13min，22-29％(b)；13-16min，29-30％(b)；16-20min，30-30％(b)；20-35min，30-33％(b)；35-39min，33-35％(b)；39-43min，35-38％(b)；43-45min，38-65％(b)；45-48min，65-85％(b)；48-50min，85-95％(b)；50-53min，95％(b)；柱温：30℃；流速：0.3ml/min；进样量：3μl。
[0089]
1.4质谱方法
[0090]
离子源：电喷雾离子源(esi)；采集方法：hddda；扫描方式：负离子扫描；质谱扫描范围m/z 250
–
1500，设置为每0.3s扫描一次；毛细管电压1.5kv；锥孔电压40v；离子源温度120℃；脱溶剂气体温度500℃；脱溶剂气体流速(n2)800l/h；锥形气流速(n2)50l/h；ms1碰撞能量为6ev；hddda二级参数设置中ms2质量依赖梯度裂解能量为30/50
–
50/70ev，触发二级采集的母离子强度阈值为500计数，top n值设为5，即采集一级响应前5强离子的二级信息，停止二级采集的时间(timeout)为1.2s；在msms dynamic peak exclusion下勾选acquire and then exclude for a duration of：10s，质量误差为80.00mda，碰撞截面积误差为同时在构建离子排除列表时，勾选保留时间，且保留时间误差为20s。数据采集过程中通过以10μl/min的流速连续不断地注入浓度为200pg/μl的外部校正液(lockspray tm
)，用于进行负离子模式下质量数(m/z 554.2620)的精准校正。
[0091]
1.5迭代排除列表的构建及数据采集
[0092]
(1)首先用hddda方法采集70％v/v甲醇水溶液，进行unifi处理(不调用自建人参属皂苷数据库)后筛选响应值大于500的离子并去重复，得到180个离子质量数及对应的保留时间列表，将其手动添加至排除列表中，更新采集方法；
[0093]
(2)之后在包含排除列表(含有180个离子质量数及对应的保留时间)的hddda方法上继续采集同一西洋参花样品数据(el-1)，进行unifi处理(调用自建人参属皂苷数据库)，将与数据库匹配的离子(identified部分)筛选出来，去掉重复质量数，得到146个离子质量数及对应的保留时间列表，继续添加至排除列表中，更新采集方法；
[0094]
(3)在包含排除列表(含有326个离子质量数及对应的保留时间)的hddda方法上继续进行同一西洋参花样品数据采集(el-2)，进行unifi处理(调用自建人参属皂苷数据库)，将与数据库匹配的离子(identified部分)以及未匹配列表(unknown部分)中响应值大于10000的离子筛选出来，去掉重复质量数，得到479个质量数及对应的保留时间列表，继续添加至排除列表中，更新采集方法；
[0095]
(4)在包含排除列表(含有805个离子质量数及对应的保留时间)的hddda方法上继续重复第三步的采集(el-3)及数据处理步骤，将identified与unknown中响应值大于5000的离子筛选出来，去掉重复质量数，得到460个质量数及对应的保留时间列表，继续添加至排除列表中，更新采集方法；
[0096]
(5)在包含排除列表(含有1265个离子质量数及对应的保留时间)的hddda方法基
础上继续进行西洋参花样品数据采集(el-4)，经unifi调取数据库处理后发现所得鉴定列表结果较少，微量成分基本均被采集到，说明离子排除效果较为理想，故停止采集。
[0097]
2、数据处理
[0098]
将vion im-qtof所采集的西洋参花样品的未校正的数据导入unifi
tm
1.9.3.0软件(waters，美国)进行处理和分析。所采集的数据先由m/z 554.2620(esi)处的lock mass进行校正，然后通过调用自建人参属皂苷数据库进行自动峰检出和峰注释，其关键参数设置如下：保留时间范围0～50min；一级离子强度阈值为1000.0counts；二级离子强度阈值为500.0counts；目标质量数偏差范围为10.0ppm；选定筛选所有同位素中的一个候选者，从结构中生成预测碎片；启用在源代码中寻找碎片功能，碎片匹配偏差为10.0ppm；lock mass:combine width，3scans；质量窗口为0.5m/z。负离子模式加合离子包括+hcoo，-h，+cl，+e；参比质量数554.2620；参比电荷-1。
[0099]
3、结果分析
[0100]
基于unifi数据处理分析方法，获得西洋参花及混标样品中化合物对应的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息，采用与人参皂苷对照品数据比对(保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等)，结合自建人参属皂苷数据库及文献裂解规律比对等方法，对所采集的西洋参花样品的el-hddda数据进行分析，进行西洋参花样品中人参皂苷成分的系统鉴定。
[0101]
从基于el-hddda采集的西洋参花总提物样品中鉴定(或推测)出362个成分，其中包含144个未曾报道的化学成分。
[0102]
基于人参皂苷苷元的差异及丙二酰基的存在，将所鉴定的362个人参皂苷分为六个亚型：原人参二醇(ppd)型、原人参三醇(ppt)型、奥克梯隆(ot)型、齐墩果酸(oa)型、丙二酸酰化(mal)型及其它类型。其中包含ppd型85个、ppt型63个、oa型15个、ot型35个、mal型94个、其它类型70个。
[0103]
皂苷类化学成分多为不同苷元发生不同糖基取代，故在二级碰撞能量下会脱去不同的糖基，产生对应的中性丢失，总结已报道的人参皂苷相关文献，产生较多的为葡萄糖(glc，162.05da)，鼠李糖(rha，146.05da)，葡萄糖醛酸(glca，176.03da)，木糖(xyl，132.04da)及阿拉伯糖(p-ara和f-ara，132.04da)，因木糖和阿拉伯糖产生一样的中性丢失，仅通过质谱数据无法确证，故本发明中发生132.04da中性丢失的均以xyl表示；同时在糖基上也可能会发生乙酰基取代(ace，42.01da)，丙二酰基取代(mal，86.00da)等，以上取代基中性丢失适用于多种类型人参皂苷。
[0104]
以下为根据对照品等相关信息，采用比对的方法，对西洋参花中中性皂苷(ppd、ppt、ot)和酸性皂苷(oa、mal)化学成分鉴定的举例信息。
[0105]
3.1中性皂苷
[0106]
3.1.1 ppd型人参皂苷
[0107]
在所鉴定的人参皂苷类成分中，ppd型皂苷所占比例较高，该类成分也是人参皂苷中最为常见的中性皂苷之一，在负离子模式下一般以减氢峰([m-h]-)或加甲酸峰([m-h+hcooh]-)的形式存在，其苷元在负离子模式下易产生特征二级碎片m/z 459.38以及低质量端的诊断碎片m/z 391.29。
[0108]
以化合物#204(26.14min，c
53h90o22
)为例，对其裂解方式进行解析，如图3-1所示。
在负离子模式下产生准分子离子峰m/z 1123.5895[m-h+hcooh]-，同时可以观察到以下二级碎片m/z 1077.5863[m-h]-，m/z 945.5469[m-h-xyl]-，m/z 783.4715[m-h-xyl-glc]-，m/z 621.4312[m-h-xyl-2glc]-，再脱去一分子葡萄糖得到ppd型皂苷元m/z 459.3746，表明该化合物为含有3个葡萄糖和一个木糖(或阿拉伯糖)的ppd型皂苷，与对照品的保留时间，二级质谱图比对，最终将该化合物鉴定为人参皂苷rb3。
[0109]
根据对化合物#204的鉴定结果，参照ppd型皂苷裂解规律，对含有相似裂解规律的未知化合物#212(27.30min，c
54h92o22
)进行解析，质谱裂解图如图3-2所示，在负离子模式下产生准分子离子峰m/z 1137.6050[m-h+hcooh]-，进一步裂解产生二级碎片m/z 1091.5990[m-h]-，之后丢失一分子鼠李糖产生碎片m/z 945.5286，进一步逐级丢失葡萄糖产生与rb3相同的二级碎片m/z 783.4895，621.4394，459.3894，表明其为含有3个葡萄糖和1个鼠李糖的ppd型皂苷，由此可推测该未知化合物为ppd-3glc-rha。
[0110]
3.1.2 ppt型人参皂苷
[0111]
在常见的中性人参皂苷中，占比较多的除ppd型外，另一大类型为ppt型皂苷，ppt型皂苷在负离子模式下一般以减氢峰([m-h]-)或加甲酸峰([m-h+hcooh]-)的形式存在，其苷元在负离子模式下易产生特征二级碎片m/z 475.38以及低质量端的诊断碎片m/z 391.29。
[0112]
以化合物#47(8.07min，c
48h82o18
)为例，对ppt型皂苷裂解方式进行解析，如图3-3所示。在负离子模式下产生准分子离子峰m/z 945.5479[m-h]-，同时可以观察到以下二级碎片m/z 783.4983[m-h-glc]-，m/z 637.4321[m-h-glc-rha]-，ppt型苷元m/z 475.3788[m-h-2glc-rha]-，以及ppt型诊断碎片m/z 391.2858，表明该化合物为含有两个葡萄糖，一个鼠李糖的ppt型皂苷，通过与对照品的保留时间，二级碎片进一步比对，鉴定该化合物为人参皂苷re。
[0113]
同时在另一未知化合物#39(6.44min，c
53h90o22
)的二级谱图中(图3-4)观察到二级碎片m/z 475.3817及391.2856，确定该化合物为ppt型，参考化合物#47的鉴定结果，有和人参皂苷re相同碎片m/z 637.4377，783.4865，945.5360，说明该部分结构与re相似，除此之外还有其他碎片m/z 1077.5836[m-h]-，证明该化合物与re相比多了一分子木糖或阿拉伯糖(132.04da)，据此可推测该化合物为ppt-2glc-rha-xyl。
[0114]
3.1.3ot型人参皂苷
[0115]
ot型人参皂苷在西洋参药材中较为常见，为西洋参药材的特征性成分，在负离子模式下多以减氢峰([m-h]-)的形式存在，其ot型苷元在负离子模式下易产生特征二级碎片m/z 491.38。
[0116]
化合物#128(15.35min，c
42h72o14
)在负离子模式下观察到准分子离子峰m/z 799.4885[m-h]-，其二级质谱图见图3-5，脱去一分子鼠李糖产生m/z 653.4276[m-h-rha]-，进一步失去一分子葡萄糖得到ot型特征苷元碎片m/z 491.3727，表明该化合物为含有一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的ot型皂苷，经与对照品24(r)-p-f11比对，其色谱保留时间及二级质谱行为均一致，故鉴定该化合物为24(r)-pseudoginsenoside f11。
[0117]
根据化合物#128的裂解行为以及糖基的中性丢失行为，对未知化合物#7(2.64min，c
48h82o19
)进行解析鉴定，其二级质谱图及裂解规律见图3-6，主要二级碎片有m/z 961.5290[m-h]-，其余二级碎片与24(r)-p-f11基本相同，为m/z 799.4921[m-h-glc]-，
653.4276[m-h-glc-rha]-，491.3742[m-h-2glc-rha]-，由此推测该化合物比24(r)-p-f11多一分子葡萄糖，故最终推测该化合物为ot-2glc-rha。
[0118]
3.2酸性皂苷
[0119]
3.2.1 oa型人参皂苷
[0120]
oa型人参皂苷为人参属药材已报道的皂苷类酸性成分之一，在负离子模式下仅产生去质子的[m-h]-准分子离子峰，除六碳糖五碳糖外多会发生葡萄糖醛酸(glca，176.03da)取代，其对应的苷元特征碎片为m/z 455.35。
[0121]
以化合物#238(32.09min，c
42h66o14
)为例进行该类化合物的解析，二级质谱图见图4-1，在负离子模式下观察到准分子离子峰m/z 793.4386[m-h]-，失去一分子葡萄糖得m/z 631.3851[m-h-glc]-，且响应最高的二级碎片为m/z 569.3853[m-h-glc-co
2-h2o]-，这是3位葡萄糖醛酸在高能量碰撞下交叉断裂产生的典型碎片，证明有葡萄糖醛酸的存在，同时m/z 631.3851发生葡萄糖醛酸中性丢失(176.03da)产生oa型皂苷特征碎片m/z 455.3540，由此表明该化合物为含有一分子葡萄糖和一分子葡萄糖醛酸的oa型皂苷，经与对照品保留时间及二级质谱行为比对，最终鉴定该化合物为chikusetsusaponin iva。
[0122]
借此裂解规律以及特征碎片离子对未知化合物#233(31.43min，c
47h74o18
)进行解析，其二级质谱图及裂解规律见图4-2，主要二级碎片有m/z 925.4844[m-h]-，脱去一分子葡萄糖生成m/z 763.4276[m-h-glc]-，同时典型碎片m/z 569.3864[m-h-glc-xyl-co
2-h2o]-的存在证明含有葡萄糖醛酸，且含有oa型皂苷元的特征碎片455.3540，由此表明该化合物为含有一分子葡萄糖、一分子葡萄糖醛酸和一分子木糖(或阿拉伯糖)的oa型皂苷，推测该化合物为oa-glca-xyl-glc。
[0123]
3.2.2 mal型人参皂苷
[0124]
丙二酸酰化型人参皂苷也是人参属药材已报道的皂苷类酸性成分，在负离子模式下也仅产生去质子的[m-h]-准分子离子峰，在其西洋参花中含量较为丰富。该类型化合物往往是在ppt或ppd型皂苷母核或者糖基上发生丙二酸酰化，由此构成不同的丙二酰酸性皂苷。且在质谱能量碰撞裂解下，其二级容易发生co2(44.01da)、丙二酰基(86.00da)或者双丙二酰基(172.09da)的中性丢失，为推测丙二酰基存在的重要证据。
[0125]
以化合物#187(22.68min，c
57h94o26
)为例，对其裂解方式进行解析，如图4-3所示。在负离子模式下产生准分子离子峰m/z 1193.5941[m-h]-，在二级质谱图中可以观察到以下二级碎片m/z 1149.6123[m-h-co2]-，m/z 1107.5979[m-h-mal]-，其余二级碎片m/z 945.5474，m/z 783.4948，m/z 621.4367，m/z 459.3899均与rb1一致，为rb1母离子m/z 1107.5963依次脱去葡萄糖所得，共脱去四分子葡萄糖，由此表明该化合物为含有一个单丙二酰基和四分子葡萄糖的ppd型皂苷，进一步与对照品的保留时间，二级质谱图比对，最终鉴定为丙二酰人参皂苷rb1。
[0126]
同时在未知化合物#252(34.38min，c
59h94o28
)二级谱图(图4-4)中可以观察到母离子m/z 1249.5867[m-h]-，脱去一个丙二酰基及co2产生m/z 1119.5986[m-h-mal-co2]-，脱去两个丙二酰基得到m/z 1077.5871[m-h-dimal]-，之后便是糖基的脱落，脱去木糖或阿拉伯糖依次产生二级碎片m/z 945.5421[m-h-dimal-xyl]-，随后均为葡萄糖的依次脱落，得到二级碎片m/z 783.4947，m/z 621.4383，以及ppd型皂苷元m/z 459.3852，证明该化合物为含有3分子葡萄糖，一分子木糖(或阿拉伯糖)及一个双丙二酰基的ppd型皂苷，推测该化
合物为ppd-3glc-xyl-dimal。
[0127]
对比例1
[0128]
本对比例对本发明所构建的el-hddda与用传统的hddda方法(即不添加排除列表)所采集的西洋参花样品数据进行了对比，其所捕获的有效二级数量对比图如图5所示，a图表示未添加排除列表所采集的二级数目为1298(m/z》400，响应值》0)，b图表示添加排除列表4次重复采集的二级数目为2933(m/z》400，响应值》0)，对比图可清晰表明在添加排除列表的4次重复采集后，所采集有效二级信息的离子数显著增加。
[0129]
此外，基于用传统hddda与本发明所采集的西洋参花样品数据unifi处理结果，通过手动鉴定并将结果进行对比后可见，不添加排除列表(即传统的hddda)时鉴定个数为196个，添加排除列表(即本发明的el-hddda)时鉴定个数为362个，进一步证明在数据依赖采集模式下增添排除列表可获得更多有效二级信息，补充鉴定数目。同时在两种采集方法的鉴定结果中找寻了鉴定数目有明显差异的9组质量数，均为添加排除列表的采集模式下对传统hddda模式下鉴定结果作以补充，具体信息如表2。
[0130]
表2 9组质量数在两种采集模式下的鉴定个数
[0131][0132][0133]
对比例2
[0134]
本对比例列举了不同色谱柱对西洋参花中皂苷类化学成分检测的影响：在实施例1的梯度和其他色谱条件下，考察了10种不同类型的反相色谱柱，均为亚2μm超高效液相色谱柱，10种色谱柱主要来自于waters、agilent和phenomenex不同厂家(csh c18、beh c18、beh shield rp18、hss t3、hss c18 sb、cortecs c18、cortecs uplc c18+、zorbax extend c18、zorbax sb-c18、luna omega 1.6μpolar c18)。
[0135]
将所得数据在vion/im-qtof-ms上进行数据采集，并用unifi软件进行处理分析，每种色谱柱的bpi图及数据校正后所能检测到的样品离子总数如图6左图所示；根据色谱峰的整体峰形和提取离子数，选取较好的6种色谱柱做色谱柱保留行为两两比较图，结果如图6右图所示，保留行为用保留因子值表示，其值计算方法为先计算每根色谱柱上选取目标成分对应的保留时间与死时间的差值，再计算差值与对应色谱柱死时间的比值，结果表明色谱柱保留效果排序为csh c18》hss t3》luna omega 1.6u polar c18》beh shield rp18》beh c18》cortecs uplc c18+。由结果可见，用csh c18(2.1
×
100mm，1.7μm)色谱柱检测的离子数最多、保留效果最强且峰形及分离效果均较好。
[0136]
对比例3
[0137]
本对比例比较了不同柱温对西洋参花中皂苷类化学成分检测的影响：柱温分别选择25℃、30℃、35℃、40℃，其他色谱条件同实施例1。不同柱温数据采集后进行unifi处理分析，结果如图7所示。可见，柱温为30℃时，色谱峰分离效果、检测离子数、色谱峰形的综合结果最好。
[0138]
对比例4
[0139]
本对比例考察了不同毛细管电压下的西洋参花中皂苷类化学成分峰面积。
[0140]
根据毛细管电压常设的质谱参数优化范围，分别比较了1.0kv、1.5kv、2.0kv、2.5kv、3.0kv、3.5kv这6组不同水平的电压值。共选取8种人参皂苷标准品为指标化合物：丙二酸酰基人参皂苷rb1(m-rb1)、人参皂苷ra3(ra3)、丙二酸酰基人参皂苷rb2(m-rb2)、丙二酸酰基人参花蕾皂苷-rd5(m-rd5)、拟人参皂苷rh2(p-rh2)、拟人参皂苷f11(p-f11)、人参皂苷rg2(rg2)、人参皂苷ro(ro)，在每个电压值水平下平行进样三次后，提取不同水平下的化合物峰面积作为考察指标，从而计算8种指标成分在不同水平下平行进样三次所得峰面积的平均值与rsd(％)值，结果发现不同毛细管电压条件下所得rsd(％)均《15.0％，表明建立的实验方法较为稳定可靠，具体结果如图8所示。从图中可以看出，8种化合物均在1.0kv和1.5kv时峰面积呈现较高水平，且1.5kv的水平误差较1.0kv时较小，同时考虑到毛细管电压值过低时离子化效率会相对较低，毛细管电压为1.5kv时可获得最大且误差更小的峰面积。
[0141]
对比例5
[0142]
本对比例考察了不同锥孔电压下的西洋参花中皂苷类化学成分峰面积。
[0143]
根据锥孔电压常设的质谱参数优化范围，分别比较了20v、40v、60v、80v、100v、120v这6组不同水平的电压值。共选取8种人参皂苷标准品为指标化合物：丙二酸酰基人参皂苷rb1(m-rb1)、人参皂苷ra3(ra3)、丙二酸酰基人参皂苷rb2(m-rb2)、丙二酸酰基人参花蕾皂苷-rd5(m-rd5)、拟人参皂苷rh2(p-rh2)、拟人参皂苷f11(p-f11)、人参皂苷rg2(rg2)、人参皂苷ro(ro)，在每个电压值水平下平行进样三次后，提取不同水平下的化合物峰面积作为考察指标，从而计算8种指标成分在不同水平下平行进样三次所得峰面积的平均值与rsd(％)值，结果发现不同锥孔电压条件下所得rsd(％)均《10.0％，表明建立的实验方法较为稳定可靠，具体结果如图9所示。从图中可以看出，随着锥孔电压值的升高，ra3和ro两种化合物峰面积呈单向增长的趋势；但剩余6种化合物峰面积均在达到60v后呈现明显骤降趋势，且在40v或60v达到最高响应值；同时对3种丙二酰化合物源内裂解碎片强度进行分析，当锥孔电压达到60v之后升高时，源内裂解情况也越来越严重，因此综合来看，锥孔电压为40v时，各指标化合物的峰面积均较为理想。
[0144]
对比例6
[0145]
本对比例考察了不同高能裂解能量下的西洋参花中皂苷类化学成分母离子和特征离子的响应强度及二级碎片的丰富度。
[0146]
本实验中，在dda模式(ms-ms/ms)下采用质量依赖裂解能量(mdrce)功能，选取隶属于人参皂苷各个亚型的4种不同指标化合物：人参皂苷re(re)、人参皂苷rb1(rb1)、拟人参皂苷f11(p-f11)、人参皂苷ro(ro)，在不同水平下进行裂解能量优化，主要考察二级质谱图中母离子强度及碎片丰富度信息。首先设置了6组mdrce进行了比较，分别为10
–
40ev/20
–
50ev、20
–
50ev/30
–
60ev、30
–
60ev/40
–
70ev、40
–
70ev/50
–
80ev、50
–
80ev/60
–
90ev、60
–
90ev/
70
–
100ev。综合考察4种指标化合物的二级谱图质量，观察其指标化合物的母离子及特征碎片，30
–
60ev/40
–
70ev和40
–
70ev/50
–
80ev两个水平下各个亚型二级谱图相对较好，故在这两个水平下进一步比较两组不同水平30
–
50ev/50
–
70ev和30
–
70ev/40
–
80ev，不同能量水平下4种化合物的hddda-ms2光谱如图10所示，综合考察二级谱图，当mdrce为30
–
50ev/50
–
70ev，各化合物的准分子离子峰以及二级碎片信息较为清晰且丰富，干扰较小，可提高鉴定成分的数量和鉴定结果的可靠性。
[0147]
对比例7
[0148]
本对比例考察了不同hddda采集方式对西洋参花中皂苷类化学成分检测数目的影响：
[0149]
在其他质谱条件与实施例1相同的情况下，分别用hddda采集一级响应前1强离子的二级信息(top 1)、一级响应前3强离子的二级信息(top 3)、一级响应前5强离子的二级信息(top 5)，并将所得3种质谱数据导入unifi并调用自建人参属皂苷数据库进行处理，将处理所得鉴定列表里的检测离子总数与identified列表的离子数目进行比较，均为top 5》top 3》top 1，表明hddda采集一级响应前5强离子的二级信息时，检测和鉴定的离子数均更多，同时在top 5参数设置下平行采集3针数据，出峰重现性良好。
[0150]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：s1、用甲醇水溶液对待测样品进行提取，得待测溶液；s2、用超高效液相色谱/质谱联用分析方法对所述待测溶液进行检测，用高分辨数据依赖采集方法采集离子的一级二级信息，并构建离子排除列表；s3、用包含s2所得排除列表的高分辨数据依赖采集方法采集所述待测溶液的一级二级质谱信息，进行unifi处理后将所筛选的一级母离子质荷比和保留时间信息增添至排除列表，重复操作直至获得采集低丰度离子的二级信息。2.根据权利要求1所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，s1中所述甲醇水溶液的浓度为60％～80％v/v。3.根据权利要求1所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：极性修饰十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相a为0.095％～0.105％v/v甲酸水溶液，流动相b为0.095％～0.105％v/v甲酸乙腈溶液，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：腈溶液，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：流速：0.28～0.32ml/min；柱温：25～35℃。4.根据权利要求1所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，所述色谱柱为csh c18；和/或所述柱温为30℃；和/或所述流速为0.3ml/min；和/或所述甲酸水溶液中的甲酸浓度为0.1％v/v；和/或
所述甲酸乙腈溶液中的甲酸浓度为0.1％v/v。5.根据权利要求1所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，所述质谱采用离子淌度四极杆飞行时间质谱。6.根据权利要求5所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，所述质谱的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源，在负离子模式下采集数据；所述离子源的参数为：毛细管电压1.5kv；锥孔电压40v；离子源温度120℃；脱溶剂气体温度500℃；脱溶剂气体流速800l/h；锥形气流速50l/h；ms1碰撞能量为6ev；高分辨数据依赖采集二级参数设置中ms2质量依赖梯度裂解能量为30/50
–
50/70ev，触发二级采集的母离子强度阈值为500计数，top n值设为5。7.根据权利要求6所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，所述质谱的质谱条件还包括：质谱扫描范围m/z 250
–
1500，每0.3s扫描一次；停止二级采集的时间为1.2s；质量误差为80.00mda，碰撞截面积误差为8.根据权利要求6或7所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，所述质谱的质谱条件还包括：数据采集过程中连续注入外部校正液，用于进行负离子模式下质量数的精准校正。9.根据权利要求1所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法，其特征在于，s3的具体操作包括：第一步、用高分辨数据依赖采集方法采集60％～80％v/v甲醇水溶液进行unifi处理后筛选响应值大于500的离子并去重复，得到第一部分离子质量数及对应的保留时间列表，将其添加至排除列表中，更新采集方法；第二步、在包含第一步所得排除列表的高分辨数据依赖采集方法上继续采集同一待测溶液数据，结合数据库进行unifi处理，将与数据库匹配的离子筛选出来，去掉重复质量数，得到第二部分离子质量数及对应的保留时间列表，继续添加至排除列表中，更新采集方法；重复三次，并在第一次和第二次中分别筛出未匹配列表中响应值大于10000和大于5000的离子。10.权利要求1～9任一项所述的检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法在西洋参花皂苷表征与鉴定中的应用。

技术总结
本发明关于中药成分分析鉴定技术领域，尤其涉及一种检测西洋参花中皂苷类化学成分的方法及其在西洋参花皂苷鉴定中的应用。本发明基于超高效液相色谱/离子淌度四极杆飞行时间质谱联用技术，构建了迭代排除列表数据依赖采集质谱方法，能够大幅提升鉴定的覆盖度，为西洋参花中皂苷类化学成分深入分析表征提供了一种高效、快速、准确的分析鉴定方法，可对西洋参花和含有西洋参花的保健品进行西洋参花的表征与鉴定，为西洋参花的化学物质基础和药效活性成分研究提供理论依据和技术参考，有利于西洋参花的后续开发和利用。西洋参花的后续开发和利用。西洋参花的后续开发和利用。


技术研发人员：杨文志 李雪 孙梦晓 胡莹 王洪达 荆绮 李晓航 徐晓艳
受保护的技术使用者：天津中医药大学
技术研发日：2022.03.25
技术公布日：2023/10/6