一种可被碱性磷酸酶和可见光激活的有机小分子及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种可被碱性磷酸酶和可见光激活的有机小分子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.药物疗法是目前包括恶性肿瘤在内的大多数疾病的主要治疗方式。然而，传统药物由于缺乏选择性、病灶部位吸收率低和耐药性，通常伴随着严重的毒副作用和疗效不佳等问题，甚至导致治疗失败。选择性差的根源在于药物起效在时间和空间上不受控制，即药物在生物体外部或体内非靶标部位无时无刻都具有活性，而到达靶标部位时浓度降低活性不明显。为了解决这些问题，设计药物活性动态可控的新型分子是一个有效的方法。
3.光药理学是一种新兴的医学方法，通过将光开关分子引入到药效团中，利用光操控分子药理活性的激活或暂时失活，实现靶向精准治疗。光作为一种非侵入性的远程控制参数，与生物体内绝大多数生化反应具有高度正交性，不会给生物环境带来污染，更为重要的是，光具有高的空间和时间传递精度，在控制生物活性分子的功能中具有独特优势。目前，通常用来“打开”和“关闭”药物活性的光开关分子结构有偶氮苯、螺吡喃或二芳基乙烯等。然而这些分子结构的光响应区域位于短波长的紫外光波段。紫外光存在生物毒性、组织穿透能力差等问题，严重制约了其在生命体系中的实际应用。此外，已有的光开关分子自身不具有治疗效果，必须与已知的药效团进行共价偶联，但化学修饰反应可能导致药效团活性的降低甚至丧失。因此，设计兼具药物活性和光开关性能的新型分子对于高效、高选择性候选药物的开发具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了克服现有光开关分子响应波长短、调控方式单一、自身不具有药效等问题，本发明提供一种可被碱性磷酸酶和可见光激活的有机小分子及其制备方法和应用。
5.第一方面，本发明保护一种可被碱性磷酸酶和可见光激活的有机小分子，其为式ⅰ所示化合物，
[0006][0007]
其中，选自顺式异构体(cis t-p)、反式异构体(trans t-p)或顺反异构体的混合物(t-p)。
[0008]
式ⅰ所示化合物是一种具有可见光响应的顺-反异构体作为新型光开关生物活性分子，所述光开关生物活性分子为一种可见光照射产生顺-反异构，并对碱性磷酸酶和白蛋白具有识别能力的有机小分子；
[0009]
其中，顺式异构体和反式异构体的结构式如下：
[0010][0011]
所述有机小分子在黑暗情况下为稳定的顺式(cis t-p)或反式(trans t-p)构型，没有毒性，在可见光照射下会发生顺-反异构。
[0012]
所述有机小分子是碱性磷酸酶的底物，发生水解反应后生成产物t-h。有机小分子与碱性磷酸酶的反应具有构型选择性，反式(trans t-p)构型与碱性磷酸酶的反应速度更快。
[0013]
所述有机小分子与白蛋白具有结合能力。有机小分子与白蛋白的结合力具有构型选择性，顺式(cis t-p)构型与白蛋白的结合力更强。
[0014]
第二方面，本发明提供式ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0015]
1)(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯与n,n-二甲基苯甲酰胺经布沃醛合成反应，得到式ⅱ所示化合物；
[0016][0017]
2)式ⅱ所示化合物与丙二氰经麦克默里反应，得到式ⅲ所示化合物；
[0018][0019]
3)式ⅲ所示化合物在三溴化硼作用下脱去甲基，得到式ⅳ所示化合物；
[0020][0021]
4)式ⅳ所示化合物与二乙氧基磷酰氯经酯化反应，得到式v所示化合物；
[0022][0023]
5)式v所示化合物在三甲基溴化硅烷作用下脱去乙基，得到顺反构型混合的式i所示化合物；
[0024]
6)顺反构型混合的式i所示化合物经高效液相色谱分离纯化，得到顺式构型的式i所示化合物和反式构型的式i所示化合物。
[0025]
进一步地，步骤1)的操作如下：将所述(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯用有机溶剂溶解，在-78℃氮气保护下加入正丁基锂，-78℃反应2h～4h(如2h)，再加入所述n,n-二甲基苯甲酰胺，反应1h后缓慢升至室温，加入10％盐酸溶液淬灭，继续反应0.5h～1h(如0.5h)；
[0026]
更进一步地，步骤1)中所述有机溶剂可为四氢呋喃；所述(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯与所述正丁基锂的摩尔比可为1:1.2～1.5，具体可为1:1.2；所述(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯与所述n,n-二甲基苯甲酰胺的摩尔比可为1:1.2～2.0，具体可为1:1.2；
[0027]
进一步地，步骤2)的操作如下：将所述式ⅱ所示化合物与所述丙二腈混合，溶解在无水有机溶剂中，在零度氮气保护下缓慢加入四氯化钛，反应30min，再加入吡啶，在40℃反应4h～8h(如4h)，反应后加水淬灭；
[0028]
更进一步地，步骤2)中所述有机溶剂可为二氯甲烷；所述式ⅱ所示化合物与所述丙二腈的摩尔比可为1:1.5～2，具体可为1:1.5，所述式ⅱ所示化合物与所述四氯化钛的摩尔比可为1:3～5，具体可为1:3，所述式ⅱ所示化合物与所述吡啶的摩尔比可为1:3～5，具体可为1:3；
[0029]
进一步地，步骤3)的操作如下：将所述式ⅲ所示化合物用有机溶剂溶解，在氮气保护下加入所述三溴化硼，室温下反应4h～6h(如4h)；
[0030]
更进一步地，步骤3)中所述有机溶剂可为二氯甲烷，所述式ⅲ所示化合物与所述三溴化硼的摩尔比可为1:1.7～2.2，具体可为1:1.7；
[0031]
进一步地，步骤4)的操作如下：在氮气保护下，将所述式ⅳ所示化合物和氢化钠混合，溶解在无水有机溶剂中，再加入所述二乙氧基磷酰氯，室温搅拌反应24h；
[0032]
更进一步地，步骤4)中所述有机溶剂可为四氢呋喃，所述式ⅳ所示化合物与所述
氢化钠的摩尔比可为1:2～3，具体可为1:2；所述式ⅳ所示化合物与所述二乙氧基磷酰氯的摩尔比可为1:2～4，具体可为1:2；
[0033]
进一步地，步骤5)的操作如下：将所述式v所示化合物用无水有机溶剂溶解，在零度氮气保护下，加入所述三甲基溴化硅烷，室温搅拌反应4h～12h(如4h)，再加入甲醇，室温搅拌反应0.5h～2h(如0.5h)；
[0034]
更进一步地，步骤5)中所述有机溶剂可为二氯甲烷，所述式v所示化合物与所述三甲基溴化硅烷的摩尔比可为1:2～4，具体可为1:2；
[0035]
进一步地，步骤6)的操作如下：将顺反构型混合的式i所示化合物用溶剂溶解后，进样到高效液相色谱仪，在梯度洗脱条件下，经反相色谱柱进行分离纯化，得到顺式构型的式i所示化合物和反式构型的式i所示化合物。
[0036]
更进一步地，步骤6)中所述溶剂可为二甲基亚砜，以c18为填料的色谱柱为固定相，以含体积分数为0.1％三氟乙酸的水作为流动相a，以含体积分数为0.1％三氟乙酸的乙腈作为流动相b，梯度洗脱程序如下：0～3min，流动相b的体积分数为25％；3～28min，流动相的体积分数由25％上升至100％(即0-3-28min，25％b-25％b-100％b)。
[0037]
其中，保留时间为18.3min和19.2min的组分分别对应式i化合物的反式和顺式构型。
[0038]
本发明中，所述室温为15～40℃，优选20～30℃，更优选25℃。
[0039]
第三方面，本发明保护一种调控式ⅰ所示化合物中顺反异构比例的方法，包括如下步骤：用可见光照射含有式ⅰ所示化合物的溶液，得到式ⅰ所示化合物中反式构型和顺式构型的摩尔比为53:47的顺反异构的混合物；或，
[0040]
用可见光照射含有式ⅰ所示化合物和血清白蛋白的溶液，得到式ⅰ所示化合物中反式构型和顺式构型的摩尔比为18:82的顺反异构的混合物。
[0041]
所述可见光具体可为波长为450nm的光源。
[0042]
第四方面，本发明保护式ⅰ所示化合物在如下a1)-a3)中至少一种中的应用：
[0043]
a1)制备以碱性磷酸酶为靶标的肿瘤靶向治疗的药物；
[0044]
a2)制备利用可见光和/或血清白蛋白控制顺反异构比例从而控制药物抗肿瘤活性的以碱性磷酸酶为靶标的肿瘤靶向治疗的药物；
[0045]
a3)制备利用与血清白蛋白的结合消除非靶标部位毒性的以碱性磷酸酶为靶标的肿瘤靶向治疗的药物。
[0046]
所述肿瘤为癌；所述癌具体为肝癌、宫颈癌或乳腺癌等碱性磷酸酶高表达的癌。
[0047]
第五方面，本发明保护式ⅳ所示化合物，
[0048][0049]
式ⅳ中，选自顺式异构体、反式异构体或顺反异构体的混合物。
[0050]
第六方面，本发明保护式ⅳ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0051]
式ⅰ所示化合物与碱性磷酸酶经水解反应，得到式iv所示化合物。
[0052]
第七方面，本发明保护式iv所示化合物在制备肿瘤治疗的药物中的应用或在体外非治疗目的的促进肿瘤细胞凋亡中的应用。
[0053]
所述肿瘤为癌；所述癌具体为肝癌、宫颈癌或乳腺癌等碱性磷酸酶高表达的癌。
[0054]
所述肿瘤细胞具体可为人肝癌细胞(hepg2)、人宫颈癌细胞(hela)和人乳腺癌细胞(mcf-7)。
[0055]
本发明与现有技术相比，具有以下技术效果：
[0056]
本发明公开的有机小分子及其顺反异构体，在黑暗情况下以稳定的顺式或反式构型存在，无细胞毒性。该有机小分子可作为碱性磷酸酶的底物，水解反应后生成具有促进肿瘤细胞凋亡活性的产物(结构如式ⅳ)。反式构型由于碱性磷酸酶反应活性高，因此促肿瘤细胞凋亡活性高；顺式构型则与血清白蛋白结合力更强，促凋亡活性低。在可见光照射下，有机小分子发生顺-反异构，且异构的效率受环境中血清白蛋白浓度的调控。基于此，可以利用生物相容性好的可见光和生物体内广泛存在的白蛋白作为双重调控手段，使有机小分子在高血清白蛋白生理条件下，没有毒副作用。在肿瘤细胞环境中，通过可见光照射和白蛋白浓度去除，使有机小分子处于反式构型，经碱性磷酸酶反应，发挥高效的肿瘤细胞杀伤能力，达到在时间和空间上控制药物活性，在肿瘤按需精准治疗中具有应用前景。
附图说明
[0057]
图1为本发明实施例1中式ⅰ所示化合物的合成路线图。
[0058]
图2为本发明实施例2中式i所示化合物异构体的高效液相色谱分离谱图。
[0059]
图3为本发明实施例3中式i所示化合物与碱性磷酸酶反应的示意图、化合物异构体与碱性磷酸酶或血清白蛋白作用后的荧光光谱图、化合物异构体与碱性磷酸酶反应前后的hplc色谱图以及化合物异构体与碱性磷酸酶反应的米氏常数。
[0060]
图4为本发明实施例4中式i所示化合物在不同溶剂中可见光照射后的顺-反异构情况。
[0061]
图5为本发明实施例5中式i所示化合物异构体分别与肝癌细胞(hepg2)和正常胚肾细胞(hek293)孵育后的共聚焦激光扫描显微镜成像图和细胞裂解液的hplc分离图。
[0062]
图6为本发明实施例6中式i所示化合物异构体诱导肝癌细胞发生凋亡行为的流式细胞术分析谱图、以及mtt法测定化合物异构体对不同种类肿瘤细胞和正常细胞毒性。
[0063]
图7为本发明实施例7中式i所示化合物在大鼠血液中的抗降解情况、流式细胞术测定顺式构型在可见光照射和白蛋白清除条件下激活抗肿瘤活性。
具体实施方式
[0064]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0065]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0066]
实施例1、式ⅰ所示化合物的合成：
[0067]
化学反应流程图如图1所示，具体反应步骤条件如下：
[0068]
1)式ⅱ所示化合物的合成
[0069]
将(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯(2mmol)加入二口瓶中，用重蒸四氢呋喃溶解，氮气保护-78℃下将正丁基锂(2.4mmol)加入，-78℃继续反应2h，再加入n,n-二甲基苯甲酰胺(2.4mmol)反应1h后缓慢升至室温，加入10％盐酸溶液淬灭，继续反应30min。反应完毕用二氯甲烷萃取，取有机相干燥过滤，旋蒸去除溶剂后柱层析纯化，淋洗剂为石油醚/二氯甲烷(2:1，v/v)，得到化合物ⅱ(383mg，产率为41.1％)。
[0070]
结构确证数据如下：
[0071]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.77-7.72(t，2h)，7.60-7.42(m，5h)，7.16-6.92(m，14h)，6.67-6.63(t，2h)，3.75(s，3h)；
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ:158.5，143.4，137.8，132.6，132.2，131.4，131.2，129.9，129.8，129.6，128.4，128.2，127.9，127.8，127.7，126.9，126.6，113.4，113.1，55.1；
[0072]
质谱:计算值为c
32h26
o2[m]
+
:466.6，质谱峰位置：466.0；
[0073]
由上可知，该产物结构正确。
[0074]
2)式ⅲ所示化合物的合成
[0075]
将式ⅱ所示化合物(0.4mmol)和丙二腈(0.6mmol)混合溶解在无水二氯甲烷中，氮气保护，在0℃条件下缓慢注入四氯化钛(1.2mmol)，反应30min后，注入吡啶(1.2mmol)，继续在40℃条件下反应4h。反应完毕后加水淬灭，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，柱层析纯化，淋洗剂为石油醚/二氯甲烷(2:1，v/v)，得到橙色化合物ⅲ固体(171mg，产率83.4％)。
[0076]
结构确证数据如下：
[0077]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.61-7.35(m，5h)，7.21-7.01(m，14h)，6.94-6.90(m，2h)，6.68-6.65(t，2h)，3.76(s，3h)；
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ:158.8，149.4，143.2，142.9，140.8，138.7，136.2，135.3，133.6，132.6，132.5，131.6，131.4，131.3，130.4，130.1，128.8，128.0，127.7，126.9，126.8，114.2，114.0，55.2；
[0078]
质谱：计算值为c
37h26
n2o[m]-:513.6，质谱峰位置：513.4；
[0079]
由上可知，该产物结构正确。
[0080]
3)式ⅳ所示化合物的合成
[0081]
将式ⅲ所示化合物(0.3mmol)加入二口瓶中用二氯甲烷溶解，氮气保护，然后缓慢加入三溴化硼(0.5mmol)，室温(25℃)反应4h后，旋蒸去除溶剂，柱层析分离，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯(3:1，v/v)，得到化合物ⅳ(140mg，产率93.5％)。
[0082]
结构确证数据如下：
[0083]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.45(s，1h)，7.64-7.52(m，3h)，7.44-7.42(m，2h)，7.29-7.11(m，10h)，7.01-6.95(m，4h)，6.78-6.72(t，2h)，6.55-6.50(m，2h)；
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ:156.8，149.1，143.7，143.1，138.6，136.5，134.1，132.5，132.4，132.3，131.4，131.2，131.1，130.3，130.0，129.9，128.7，128.0，127.9，127.7，126.7，126.7，126.6，114.7，114.6；
[0084]
质谱:计算值为c
36h24
n2o[m]-:499.6，质谱峰位置：499.2；
[0085]
由上可知，该产物结构正确。
[0086]
4)式v所示化合物的合成
[0087]
将式ⅳ所示化合物(0.25mmol)在氮气保护下和氢化钠(0.5mmol)加入到20ml无水四氢呋喃中，然后加入二乙氧基磷酰氯(0.5mmol)，室温(25℃)搅拌反应24h。反应完成后，加入5ml水淬灭，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸去除溶剂。柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(50:1，v/v)，得到橙色化合物v固体(127mg，产率77.4％)。
[0088]
结构确证数据如下：
[0089]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.59-7.48(m，3h)，7.46-7.43(m，2h)，7.38-7.36(m，2h)，7.21-7.18(m，8h)，7.14-6.93(m，8h)，4.24-4.14(t，4h)，1.35-1.30(t，6h)；
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ:156.7，149.3，143.8，143.2，138.7，136.6，134.3，132.4，132.3，132.2，131.3，131.1，131.0，130.2，130.1，129.9，128.8，128.0，127.8，127.7，126.8，126.6，126.4，114.6，114.5，68.5，20.1；
[0090]
质谱:计算值为c
40h34
n2o4p[m+h]
+
:637.2251，质谱峰位置：637.2247；
[0091]
由上可知，该产物结构正确。
[0092]
5)式i所示化合物的合成
[0093]
将式v所示化合物(0.1mmol)置于二口瓶中，用10ml无水二氯甲烷溶解，抽真空n2保护，在0℃冰浴下用注射器加入三甲基溴化硅烷(0.2mmol)，室温(25℃)下搅拌反应4h。加入1ml甲醇继续室温搅拌30min。反应完成后，旋蒸除去溶剂，粗产品通过柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(4:1，v/v)，得到橙红色粉末(35.2mg，产率58％)。
[0094]
实施例2、式ⅰ所示化合物顺式与反式构型的分离与表征
[0095]
将柱层析分离得到的式ⅰ所示化合物用二甲基亚砜溶解，在高效液相色谱(hplc)系统上，使用c18为填料的色谱柱进行异构体分离。流动相体系为：a相：含0.1％三氟乙酸的水，b相：含0.1％三氟乙酸的乙腈；线性梯度为：0-3-28min，25％b-25％b-100％b。hplc分离色谱图如图2所示。保留时间为18.3min和19.2min的组分分别对应式i化合物的反式和顺式构型。
[0096]
cis t-p结构确证数据如下：
[0097]1h nmr(600mhz，dmso-d6)δ：7.67(t,j＝3.0hz,1h),7.60-7.57(m,2h),7.44-7.43(m,2h),7.29-7.24(m,4h),7.21-7.19(m,4h),7.16-7.14(m,2h),7.09-7.08(m,2h),7.02-6.98(m,6h)；
13
c nmr(150mhz，dmso-d6):174.40,151.27,151.23,148.76,143.55,142.62,140.25,138.90,136.85,134.84,133.40,132.76,131.83,131.54,131.10,131.02,129.77,128.98,128.81,127.85,127.77,120.22,120.19,115.29,115.23,82.23.
[0098]
高分辨质谱:计算值为c
36h25
n2nao4p[m-h+na]
+
:603.1444，质谱峰位置：603.1447；
[0099]
由上可知，该产物结构正确，为化合物的顺式构型。
[0100]
trans t-p结构确证数据如下：
[0101]1h nmr(600mhz，dmso-d6)δ：7.67(t,j＝3.0hz,1h),7.62-7.59(m,2h),7.46-7.45(m,2h),7.34-7.32(m,2h),7.22-7.16(m,8h),7.06-7.03(m,4h),7.00-6.95(m,4h)；
13
c nmr(150mhz，dmso-d6):174.31,148.78,143.46,143.23,142.67,140.24,138.99,136.85,134.76,133.38,132.67,131.82,131.63,131.56,131.04,130.85,129.73,129.11,128.82,127.95,127.86,120.20,82.28.
[0102]
高分辨质谱:计算值为c
36h25
n2nao4p[m-h+na]
+
:603.1444，质谱峰位置：603.1447；
[0103]
由上可知，该产物结构正确，为化合物的反式构型。
[0104]
实施例3、式ⅰ所示化合物与碱性磷酸酶、血清白蛋白的识别及其立体选择性
[0105]
将式ⅰ所示化合物t-p的异构体(trans t-p和cis t-p)分别以二甲基亚砜为溶剂制备1mm的母液。trans t-p和cis t-p各取母液10μl，分别加入890μl三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲盐(10mm，ph＝8.0)稀释，再各加入100μl碱性磷酸酶(购自sigma-aldrich，产品名称为碱性磷酸酶(来源于牛肠粘膜)，产品目录号为p7640，)(母液的酶活性1000mu/ml)，室温孵育90min，荧光光谱仪测定溶液荧光强度，hplc分析溶液酶解反应后的成分。
[0106]
trans t-p和cis t-p各取母液10μl，分别加入980μl tris缓冲盐稀释，再各加入10μl血清白蛋白母液(1mm)，室温孵育90min，荧光光谱仪测定溶液荧光强度。
[0107]
本发明式ⅰ所示化合物t-p具有四苯乙烯结构，具有聚集诱导发光性质。如图3a所示，水溶性好的t-p与碱性磷酸酶(alp)发生酶催化的水解反应后，生成水溶性差的产物t-h，t-h发生聚集并产生荧光(t-h的结构确认数据如下：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.45(s，1h)，7.64-7.52(m，3h)，7.44-7.42(m，2h)，7.29-7.11(m，10h)，7.01-6.95(m，4h)，6.78-6.72(t，2h)，6.55-6.50(m，2h)；
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ:156.8，149.1，143.7，143.1，138.6，136.5，134.1，132.5，132.4，132.3，131.4，131.2，131.1，130.3，130.0，129.9，128.7，128.0，127.9，127.7，126.7，126.7，126.6，114.7，114.6；质谱:计算值为c
36h24
n2o[m]-:499.6，质谱峰位置：499.7)。trans t-p和cis t-p与alp反应后荧光光谱变化如图3b所示。利用hplc对反应前后的溶液进行分析，结果如图3c所示，cis t-p和trans t-p分别被alp水解，相应的色谱峰基本消失，在保留时间分别为22.4min和21.8min处产生了新的色谱峰，分别为水解产物cis t-h和trans t-h。根据米氏方程，监测酶解过程并计算了酶解反应动力学，结果如图3d所示，trans t-p与alp具有更强的反应活性，cis t-p与alp的反应活性较低，说明酶解反应的立体选择性。
[0108]
本发明式ⅰ所示化合物t-p具有四苯乙烯结构，具有聚集诱导发光性质。当t-p与蛋白质发生相互作用，如结合到蛋白质疏水口袋的时候，由于分子内单键旋转受限，也产生荧光信号。如图3b所示，cis t-p和trans t-p与血清白蛋白(购自北京索莱宝科技有限公司，产品名称为人血清白蛋白，产品目录号为a8230)孵育后，产生了显著的荧光信号，表明式i所示化合物与血清白蛋白具有特异性相互作用。根据荧光信号增强的幅度，判断cis t-p与血清白蛋白具有更强的结合力，trans t-p与血清白蛋白结合力较低。
[0109]
实施例4、式ⅰ所示化合物的光致异构行为及血清白蛋白的调控作用
[0110]
trans t-p和cis t-p各取母液10μl，分别加入990μl标准磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline，pbs)稀释。将稀释后的溶液用波长为450nm的光源(24mw/cm2)照射5分钟，进行hplc检测，考察顺-反异构情况。结果如图4a所示，不论以cis t-p或trans t-p为起始构型，光照后溶液中异构体最终的比例一致，均为反式：顺式＝53:47，反式构型略占优势。
[0111]
trans t-p和cis t-p各取母液10μl，分别加入890μl标准磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline，pbs)稀释，再各自加入100μl血清白蛋白母液(母液浓度40mg/ml)。将上述溶液分别用波长为450nm的光源(24mw/cm2)照射5分钟，进行hplc检测，考察血清白蛋白对光致顺-反异构的影响。结果如图4b所示，当溶液中存在血清白蛋白时，不论以cis t-p或trans t-p为起始构型，光照后溶液中异构体最终的比例一致，均为反式：顺式＝18:82，顺式构型占多数，表明血清白蛋白对化合物i光致顺-反异构行为具有调控作用。
[0112]
实施例5、式ⅰ所示化合物以碱性磷酸酶为靶标被肿瘤细胞选择性摄入
[0113]
将肝癌细胞hepg2和正常胚肾细胞hek293以相同密度种入共聚焦显微镜观测专用培养皿，在细胞培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。trans t-p和cis t-p各取母液10μl，分别加入990μl标准细胞培养液稀释。将hepg2和hek293细胞的培养液移去，分别加入稀释后的trans t-p和cis t-p溶液，在培养箱中孵育1h。利用共聚焦激光扫描显微镜观测肿瘤细胞和正常细胞对t-p的摄入情况，观测条件均为：405-nm激光器，荧光接收波长范围550-650nm。结果如图5a所示，cis t-p和trans t-p孵育后的肝癌细胞hepg2中观测到明亮的荧光，而经过相同处理的hek293细胞中则没有荧光信号，表明trans t-p和cis t-p可以选择性进入肝癌细胞，而不进入正常细胞。
[0114]
将肝癌细胞hepg2和正常胚肾细胞hek293以相同密度种入6孔板中，在细胞培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。trans t-p和cis t-p各取母液20μl，分别加入980μl标准细胞培养液稀释。将hepg2和hek293细胞的培养液移去，分别加入稀释后的trans t-p和cis t-p溶液，在培养箱中孵育2h。孵育结束后，移去溶液，加入pbs清洗细胞一次，每孔加入细胞裂解液200μl，冰上裂解细胞10min。收集细胞裂解液，进行hplc分析，测定被细胞摄入的t-p。结果如图5b所示，trans t-p和cis t-p孵育后的hepg2细胞中分别检测到化合物与碱性磷酸酶反应后的酶解产物t-h，且hepg2细胞中trans t-p酶解产物的含量高于cis t-p酶解产物的含量，表明trans t-p和cis t-p通过识别肿瘤细胞中高表达的碱性磷酸酶实现肿瘤细胞的选择性摄入，由于trans t-p与碱性磷酸酶反应活性更强，因此肿瘤细胞中trans t-p的摄入和水解效率更高。
[0115]
实施例6、式ⅰ所示化合物通过促进肿瘤细胞凋亡实现肿瘤抑制
[0116]
trans t-p和cis t-p各取母液10μl，分别加入990μl标准细胞培养液稀释。收集悬浮的肝癌细胞hepg2，离心后弃去培养液，分别加入稀释后的trans t-p和cis t-p溶液，吹打使细胞悬浮，在培养箱中孵育3h。孵育结束后，离心移去溶液，用商品化的细胞凋亡试剂盒测定细胞凋亡状态，步骤如下：处理后的hepg2细胞用试剂盒中的binding buffer(195μl)重悬，加入试剂盒提供的annexin v-fitc(5μl)，混合均匀后室温避光10min。离心，弃去上清液，加入binding buffer(200μl)清洗细胞一次，然后加入binding buffer(200μl)重悬细胞，再加入10μl碘化吖啶(pi,20μg/ml)。利用流式细胞仪，测定处理后肝癌细胞hepg2的凋亡情况。结果如图6a所示，t-p处理后的hepg2细胞annexin v-fitc通道荧光信号增强，指示细胞凋亡标志物磷脂酰丝氨酸外翻，从而被annexin v-fitc结合，表明trans t-p和cis t-p均能诱导hepg2细胞发生凋亡。其中，cis t-p孵育后的hepg2细胞，凋亡的比例为45％，而trans t-p孵育后的hepg2细胞，凋亡的比例为100％(早期凋亡98％，晚期凋亡2％)，表明trans t-p具有更强的促进细胞凋亡的能力。
[0117]
利用mtt法测定式ⅰ所示化合物及其顺反异构体对人肝癌细胞(hepg2)、人宫颈癌细胞(hela)和人乳腺癌细胞(mcf-7)的抗增殖效应。实验过程注意避光。mtt，中文名叫噻唑蓝，是一种四唑盐，在活细胞中，线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将mtt还原，生成一种可溶于二甲基亚砜的蓝紫色产物——甲臜，且该产物在570nm处有吸收，故可用570nm处的吸光度来分析细胞增殖情况。具体可将细胞以5
×
104/ml的密度接种于96孔板(100μl/孔)，孵育过夜使细胞贴壁。将trans t-p和cis t-p的母液分别用细胞培养液稀释至浓度为10μm，替换每个孔中原有的培养液。将96孔板放回细胞培养箱，继续孵育24h。之后，将每个孔中的溶液替
换为0.5mg/ml的mtt溶液(100μl/孔)，继续放回培养箱。孵育4小时后，将mtt溶液全部换成二甲基亚砜(150μl/孔)，充分溶解甲臜后，用酶标仪读取每孔溶液在570nm处的吸光度值。细胞存活率(vr)按以下公式计算:vr＝(a/a0)
×
100％，其中a为实验组的吸光度，a0为在培养液中不加任何处理的细胞的吸光度。式i所示化合物顺反异构体对不同肿瘤细胞的杀伤能力如图6b所示。trans t-p和cis t-p均能抑制不同种类肿瘤细胞增殖，trans t-p对hepg2、hela和mcf-7的杀伤效果均高于cis t-p，这与trans t-p具有更强的促肿瘤细胞凋亡能力相一致。
[0118]
实施例7、利用可见光和蛋白质激活化合物的靶向抗肿瘤活性
[0119]
药物分子在血液递送过程中发生分解会导致到达肿瘤部位药效降低，也是非病变组织毒副作用的主要原因。t-p具有血清白蛋白结合作用，因此可以利用白蛋白作为保护，避免被血液中的碱性磷酸酶分解，提高稳定性从而提高肿瘤部位的药效，同时降低毒副作用。取trans t-p母液40μl，直接注入960μl大鼠血液中，分别在0h和4h取血液进行离心，取血浆。血浆中加入乙腈，离心后取上清液，进行hplc分析。结果如图7a所示，经过在血液中停留4h，trans t-p仍然保持完整，其色谱峰强度与起始(0h)相比没有下降，表明trans t-p在血液中可以被血清白蛋白保护，不会发生水解而产生有毒的化合物t-h。在到达肿瘤细胞后，trans t-p被肿瘤细胞膜上高表达的碱性磷酸酶水解，激活抗肿瘤活性。
[0120]
式i所示化合物可以通过可见光和白蛋白去除激活抗肿瘤活性，具体步骤如下：取cis t-p母液10μl两份，分别加入990μl标准细胞培养液(含白蛋白)和990μl dmem细胞培养基(无白蛋白)稀释。收集悬浮的肝癌细胞hepg2，均分为2份，离心后弃去培养液，分别加入稀释后的两种cis t-p溶液，吹打使细胞悬浮。将细胞悬浮液分别用波长为450nm的光源(24mw/cm2)照射5分钟，之后在培养箱中孵育3h。孵育结束后，离心移去溶液，用商品化的细胞凋亡试剂盒测定细胞凋亡状态。hepg2细胞用试剂盒中的binding buffer(195μl)重悬，加入试剂盒提供的annexin v-fitc(5μl)，混合均匀后室温避光10min。离心，弃去上清液，加入binding buffer(200μl)清洗细胞一次，然后加入binding buffer(200μl)重悬细胞，再加入10μl碘化吖啶(pi，20μg/ml)。利用流式细胞仪，测定处理后hepg2细胞的凋亡情况。结果如图7b所示，hepg2细胞在含白蛋白的cis t-p溶液中可见光照射后，进入凋亡的比例为63％(早期凋亡61％，晚期凋亡2％)，高于cis t-p在未经光照处理hepg2的结果(凋亡比例45％，图6a)，表明光致顺
→
反异构可提高抗肿瘤活性。在不含白蛋白的cis t-p溶液中，hepg2细胞经可见光照射，凋亡比例为97％(早期凋亡92％，晚期凋亡5％)，凋亡率进一步大幅提高，表明利用可见光和白蛋白可以控制顺
→
反异构，进而实现cis t-p促凋亡活性和抗肿瘤活性大幅度激活。化合物i特有的可见光响应和蛋白质识别性质对于提高药物在肿瘤部位的疗效、消除在非靶标部位的毒副作用具有很大的应用前景。
[0121]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.式ⅰ所示化合物，式ⅰ中，选自顺式异构体、反式异构体或顺反异构体的混合物。2.权利要求1所述的式ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：1)(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯与n,n-二甲基苯甲酰胺经布沃醛合成反应，得到式ⅱ所示化合物；2)式ⅱ所示化合物与丙二氰经麦克默里反应，得到式ⅲ所示化合物；3)式ⅲ所示化合物在三溴化硼作用下脱去甲基，得到式ⅳ所示化合物；4)式ⅳ所示化合物与二乙氧基磷酰氯经酯化反应，得到式v所示化合物；
5)式v所示化合物在三甲基溴化硅烷作用下脱去乙基，得到顺反构型混合的式i所示化合物；6)顺反构型混合的式i所示化合物经高效液相色谱分离纯化，得到顺式构型的式i所示化合物和反式构型的式i所示化合物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)的操作如下：将所述(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯用有机溶剂溶解，在-78℃氮气保护下加入正丁基锂，-78℃反应2h～4h，再加入所述n,n-二甲基苯甲酰胺，反应1h后缓慢升至室温，加入10％盐酸溶液淬灭，继续反应0.5h～1h；步骤2)的操作如下：将所述式ⅱ所示化合物与所述丙二腈混合，溶解在无水有机溶剂中，在零度氮气保护下缓慢加入四氯化钛，反应30min，再加入吡啶，在40℃反应4h～8h，反应后加水淬灭；步骤3)的操作如下：将所述式ⅲ所示化合物用有机溶剂溶解，在氮气保护下加入所述三溴化硼，室温下反应4h～6h；步骤4)的操作如下：在氮气保护下，将所述式ⅳ所示化合物和氢化钠混合，溶解在无水有机溶剂中，再加入所述二乙氧基磷酰氯，室温搅拌反应24h；步骤5)的操作如下：将所述式v所示化合物用无水有机溶剂溶解，在零度氮气保护下，加入所述三甲基溴化硅烷，室温搅拌反应4h～12h，再加入甲醇，室温搅拌反应0.5h～2h；步骤6)的操作如下：将顺反构型混合的式i所示化合物用溶剂溶解后，进样到高效液相色谱仪，在梯度洗脱条件下，经反相色谱柱进行分离纯化，得到顺式构型的式i所示化合物和反式构型的式i所示化合物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述有机溶剂为四氢呋喃；所述(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯与所述正丁基锂的摩尔比为1:1.2～1.5；所述(1-(4-溴苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯-1,2-二基)二苯与所述n,n-二甲基苯甲酰胺的摩尔比为1:1.2～2.0；步骤2)中所述有机溶剂为二氯甲烷；所述式ⅱ所示化合物与所述丙二腈的摩尔比为1:1.5～2，所述式ⅱ所示化合物与所述四氯化钛的摩尔比为1:3～5，所述式ⅱ所示化合物与所述吡啶的摩尔比为1:3～5；步骤3)中所述有机溶剂为二氯甲烷，所述式ⅲ所示化合物与所述三溴化硼的摩尔比为1:1.7～2.2；步骤4)中所述有机溶剂为四氢呋喃，所述式ⅳ所示化合物与所述氢化钠的摩尔比为1:2～3，所述式ⅳ所示化合物与所述二乙氧基磷酰氯的摩尔比为1:2～4；步骤5)中所述有机溶剂为二氯甲烷，所述式v所示化合物与所述三甲基溴化硅烷的摩
尔比为1:2～4；步骤6)中所述溶剂为二甲基亚砜，以c18为填料的色谱柱为固定相，以含体积分数为0.1％三氟乙酸的水作为流动相a，以含体积分数为0.1％三氟乙酸的乙腈作为流动相b，梯度洗脱程序如下：0～3min，流动相b的体积分数为25％；3～28min，流动相的体积分数由25％上升至100％。5.一种调控权利要求1所述的式ⅰ所示化合物中顺反异构比例的方法，包括如下步骤：用可见光照射含有式ⅰ所示化合物的体系，得到式ⅰ所示化合物中反式构型和顺式构型的摩尔比为53:47的顺反异构的混合物；或，用可见光照射含有式ⅰ所示化合物和血清白蛋白的体系，得到式ⅰ所示化合物中反式构型和顺式构型的摩尔比为18:82的顺反异构的混合物。6.权利要求1所述的式ⅰ所示化合物在如下a1)-a3)中至少一种中的应用：a1)制备以碱性磷酸酶为靶标的肿瘤靶向治疗的药物；a2)制备利用可见光和/或血清白蛋白控制顺反异构比例从而控制药物抗肿瘤活性的以碱性磷酸酶为靶标的肿瘤靶向治疗的药物；a3)制备利用与血清白蛋白的结合消除非靶标部位毒性的以碱性磷酸酶为靶标的肿瘤靶向治疗的药物。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为癌；所述癌具体为肝癌、宫颈癌或乳腺癌。8.式ⅳ所示化合物，式ⅳ中，选自顺式异构体、反式异构体或顺反异构体的混合物。9.权利要求8所述的式ⅳ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：权利要求1所述的式ⅰ所示化合物与碱性磷酸酶经水解反应，得到式ⅳ所示化合物。10.权利要求8所述的式ⅳ所示化合物在制备肿瘤治疗的药物中的应用或在体外非治疗目的的促进肿瘤细胞凋亡中的应用。

技术总结
本发明公开了一种可被碱性磷酸酶和可见光激活的有机小分子及其制备方法和应用。本发明有机小分子的结构式如式Ⅰ所示。本发明有机小分子及其顺反异构体，在黑暗情况下以稳定的顺式或反式构型存在，无细胞毒性。在可见光照射下，有机小分子发生顺-反异构，且异构的效率受环境中血清白蛋白浓度的调控。基于此，可以利用生物相容性好的可见光和生物体内广泛存在的白蛋白作为双重调控手段，使有机小分子在高血清白蛋白生理条件下，没有毒副作用。在肿瘤细胞环境中，通过可见光照射和白蛋白浓度去除，使有机小分子处于反式构型，经碱性磷酸酶反应，发挥高效的肿瘤细胞杀伤能力，达到在时间和空间上控制药物活性，在肿瘤按需精准治疗中具有应用前景。中具有应用前景。中具有应用前景。


技术研发人员：张德清 黄嫣嫣 战驰 杨阳 张关心 赵睿
受保护的技术使用者：中国科学院化学研究所
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/6