一种与杉虎杂交斑生长性状相关的SNP标记与应用

一种与杉虎杂交斑生长性状相关的snp标记与应用
技术领域
1.本发明属于snp分子标记技术领域，具体为一种与杉虎杂交斑生长性状相关的snp标记与应用。


背景技术：

2.石斑鱼主要分布于热带和亚热带海域，属鲈形目（perciformes）、 鲈亚目（percoidei）、石斑鱼科（epinephelidae）。因其肉味鲜美、营养丰富，而深受广大消费者的喜爱，属名贵海水养殖鱼类。石斑鱼类因具有雌雄同体、雌性先熟、繁殖世代周期较长等特征，极大地加长了优良石斑鱼养殖品种的培育进程，杂交可以有效的解决这一问题。此外，杂交还可快速动摇亲本原有的遗传结构，使子代获得兼具亲本的优良特征，展示出杂种优势。未经选育亲本培育的杂交子代，优势性状并不均一。此外对子一代进行自交，随着基因的分离重组，会在子二代造成优势性状衰退。杉虎杂交斑是以棕点石斑鱼为母本和清水石斑鱼为父本进行杂交而得到的。杉虎杂交斑在生长性状上表现出优于父本的优势性状。但未经选育的亲本进行杂交，在子一代中杉虎杂交斑的生长优势不能达到均一化。
3.单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, snp）是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。因其位点分布丰富，具有较高的信息含量，且snp位点信息获取简单快捷，现已成为重要的分子标记。通过将snp位点与重要性状进行关联分析，获取与性状紧密关联的分子标记用于选育，是现代水产动物分子育种技术的重要手段，在水产经济动物遗传育种中发挥重要作用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与杉虎杂交斑生长性状相关的snp标记，通过对所述snp标记的基因型进行检测，筛选获得具有生长优势的杉虎杂交斑，实现养殖经济效益最大化。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种与杉虎杂交斑生长性状相关的snp标记，所述snp标记位于mstn基因的第1003位，其碱基为t或c；所述mstn基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.本发明还提供了一种用于检测所述snp标记的引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示。
8.本发明还提供了一种用于检测所述snp标记的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。
9.本发明还提供了一种筛选具有生长优势的杉虎杂交斑的方法，所述方法包括：检测所述snp标记，筛选具有tt纯合型的个体。
10.优选地，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测杉虎杂交斑的基因组dna；（2）采用seq id no：2和seq id no：3，对所述待测杉虎杂交斑的基因组dna进行pcr扩增，以便获得
pcr扩增产物；（3）对所述pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；（4）基于所述测序结果，确定所述待测杉虎杂交斑的snp标记的基因型是否为tt纯合型个体。
11.更优选地，所述pcr扩增的反应体系为：以30μl总体积反应体系计，包括15μl 2
×
taq pcr master mix，1μl基因组dna，正反向引物各1μl，12μl水。
12.更优选地，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
13.本发明还提供了一种所述snp标记或所述引物组或所述试剂盒在杉虎杂交斑育种中的应用。
14.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.本发明通过对杉虎杂交斑肌肉生长抑制素连续设计多对引物对杉虎杂交斑个体进行pcr扩增，获得扩增产物进行测序后，通过bioedit软件对测序结果进行多重比对分析，筛选获得了位于该基因编码子区域的snp标记。本发明利用r包、cervus软件计算所述snp标记的基因型频率、基因频率、遗传多态性以及snp标记与体重、体长等数据的相关性，发现基因型为tt的纯合型个体在体重、全长、体长、头长、尾柄高和体高这6个表型数据中，都要显著高于tc型个体（p《0.01）。因此，利用本发明的snp标记进行早期筛选，可快速鉴别出杉虎杂交斑生长优良个体，实现养殖经济效益最大化。
附图说明
16.图1为本发明snp标记位点处tt基因型的反向互补链的测序峰图；
17.图2为本发明snp标记位点处tc基因型的反向互补链的测序峰图。
具体实施方式
18.本发明提供了一种与杉虎杂交斑生长性状相关的snp标记，所述snp标记位于mstn基因的第1003位，其碱基为t或c；所述mstn基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。在本发明中，利用动物组织基因组dna提取试剂盒提取30尾杉虎杂交斑个体的肌肉组织基因组dna，然后针对肌肉生长抑制素（myostatin，mstn）基因序列采用primer 4.0在基因不同位置设计多对引物来扩增序列片段，获得扩增产物进行测序后，通过bioedit软件对测序结果进行多重比对分析，筛选获得了位于所述mstn基因编码子区域的snp位点。pcr扩增体系如下：5μl 2
×
taq pcr master mix，0.8μl基因组dna，正反向引物各0.5μl，加水补充至终体积10μl。pcr扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。在本发明中，所述杉虎杂交斑购自中国海南省东方市感城镇晨海水产有限公司。在本发明中，所述动物组织基因组dna提取试剂盒由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。
19.本发明还提供了一种用于检测所述snp标记的引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示。本发明涉及的引物组能够特异性地扩增出清晰目的片段。
20.本发明还提供了一种用于检测所述snp标记的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。在本发明中，所述试剂盒还包括但不限于2
×
taq pcr master mix。
21.本发明还提供了一种筛选具有生长优势的杉虎杂交斑的方法，所述方法包括：检
测所述snp标记，筛选具有tt纯合型的个体。在本发明的具体实施例中，利用cervus软件对扩增序列的第1003位snp位点的两种基因型频率以及遗传多态性进行分析；利用r包中的lm函数进行多线性回归分析，获得所述snp位点两种基因型与杉虎杂交斑体重、全长、体长、头长、尾柄高和体高的相关性数据。结果表明，筛选出的tt型杉虎杂交斑个体，其生长速度要显著高于tc型个体。
22.在本发明中，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测杉虎杂交斑的基因组dna；（2）采用seq id no：2和seq id no：3，对所述待测杉虎杂交斑的基因组dna进行pcr扩增，以便获得pcr扩增产物；（3）对所述pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；（4）基于所述测序结果，确定所述待测杉虎杂交斑的snp标记的基因型是否为tt纯合型个体。
23.在本发明中，所述pcr扩增的反应体系为：以30μl总体积反应体系计，包括15μl 2
×
taq pcr master mix，1μl基因组dna，正反向引物各1μl，12μl水。
24.在本发明中，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
25.本发明还提供了一种所述snp标记或所述引物组或所述试剂盒在杉虎杂交斑育种中的应用。
26.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
27.实施例1 筛选、鉴定snp标记
28.杉虎杂交斑肌肉生长抑制素mstn基因序列扩增。提取30尾杉虎杂交斑个体的肌肉组织基因组dna，然后针对肌肉生长抑制素基因序列采用primer 4.0在基因不同位置设计多对引物来扩增序列片段。pcr扩增体系如下：5μl 2
×
taq pcr master mix，0.8μl基因组dna，正反向引物各0.5μl，加水补充至终体积10μl。pcr扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
29.将扩增得到的产物在1%的凝胶电泳下进行检测后，将目的片段利用胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）回收，然后将回收产物与pmd18-t载体（宝生物工程有限公司）进行连接，将连接产物放置于4℃，过夜。然后将连接产物转化至大肠杆菌dh5α。将转化后的大肠杆菌涂布在加有氨苄的固体培养基上，于37℃下培养过夜。随后挑选大的、分布散开的阳性单克隆，将其接种至带有氨苄抗性的液体培养基中进行扩大培养。最后对大肠杆菌进行质粒提取，获得质粒dna后进行pcr扩增。将扩增条带为单一的、且与目的条带位置一致的个体进行sanger测序（生工生物工程(上海)股份有限公司）。
30.对测序结果进行峰图查看，在mstn基因序列的编码区内发现snp标记位点，该snp位点为存在t/c的双等位基因型。其扩增引物包括正向引物和反向引物。正向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示。测序获得序列如seq id no：4所示。
31.实施例2 snp标记与生长性状关联分析
32.试验材料：随机挑选同一生长环境、生长周期的51尾杉虎杂交斑，利用游标卡尺对其体重、全长、体长、头长、尾柄高和体高进行测量，测量数据精准到小数点后两位。
33.试验方法：取51尾杉虎杂交斑肌肉组织，采用动物组织基因组dna提取试剂盒提取肌肉基因组dna用于后续测序。
34.利用实施例1的正向引物和反向引物对上述提取的肌肉基因组dna进行pcr扩增。反应体系共30μl：15μl 2
×
taq pcr master mix，1μl基因组dna，正反向引物各1μl，12μl水。pcr扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。将扩增得到的产物用1%的凝胶电泳进行检测。然后进行胶回收、连接和转化至大肠杆菌dh5α中进行扩大培养。最后将菌液送至生工测序，获得测序峰图。图1为snp标记位点处tt基因型的测序峰图，图2为snp标记位点处tc基因型的测序峰图，峰图均为反向互补序列。
35.利用cervus软件对扩增序列的第1003位snp位点的两种基因型频率以及遗传多态性进行分析，结果见表1。利用r包中的lm函数进行多线性回归分析，获得该snp位点两种基因型与杉虎杂交斑体重、全长、体长、头长、尾柄高和体高的相关性数据，结果见表2。
36.表1 杉虎杂交斑在第1003位snp标记基因及基因型频率
[0037][0038]
表2 杉虎杂交斑在第1003位snp标记多态性与生长性状的最小二乘法分析（平均值
±
标准差）
[0039][0040]
注：同列中字相邻字母为差异显著(p《0.01)
[0041]
由表2中可知，基因型为tt的纯合型个体在体重、全长、体长、头长、尾柄高和体高这6个表型数据中，都要显著高于tc型个体（p《0.01）。通过检测本发明所提供的snp标记所筛选出的tt型杉虎杂交斑个体，其生长速度要显著高于tc型个体。
[0042]
综上结果表明，通过使用本发明的snp引物和方法筛选的杉虎杂交斑tt基因型个体，其生长速度显著高于tc型个体，对杉虎杂交斑品种的选育工作提供了快速准确的检测
方法。
[0043]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种与杉虎杂交斑生长性状相关的snp标记，其特征在于，所述snp标记位于mstn基因的第1003位，其碱基为t或c；所述mstn基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。2.一种用于检测权利要求1所述snp标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示。3.一种用于检测权利要求1所述snp标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述引物组。4.一种筛选具有生长优势的杉虎杂交斑的方法，其特征在于，所述方法包括：检测权利要求1所述snp标记，筛选具有tt纯合型的个体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测杉虎杂交斑的基因组dna；（2）采用seq id no：2和seq id no：3，对所述待测杉虎杂交斑的基因组dna进行pcr扩增，以便获得pcr扩增产物；（3）对所述pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；（4）基于所述测序结果，确定所述待测杉虎杂交斑的snp标记的基因型是否为tt纯合型个体。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：以30μl总体积反应体系计，包括15μl 2
×
taq pcr master mix，1μl基因组dna，正反向引物各1μl，12μl水。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。8.权利要求1所述snp标记或权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒在杉虎杂交斑育种中的应用。

技术总结
本发明提供了一种与杉虎杂交斑生长性状相关的SNP标记与应用，涉及SNP分子标记技术领域。本发明所述SNP标记位于杉虎杂交斑肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因序列的第1003位，其碱基为T或C。本发明通过分析所述SNP标记的基因频率与杉虎杂交斑生长性状的相关性，基因型为TT的纯合型个体在体重、全长、体长、头长、尾柄高和体高这6个表型数据中，都要显著高于TC型个体。本发明所述SNP标记可用于快速筛选、鉴定具有生长优势的杉虎杂交斑个体，从而实现高效、精准选育。精准选育。精准选育。


技术研发人员：曹柳 陈攀 马军 侯兴蓉 杨宁 黄海
受保护的技术使用者：海南热带海洋学院
技术研发日：2023.09.01
技术公布日：2023/10/6