一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法

1.本发明属于提取工艺技术领域，具体涉及一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法。


背景技术：

2.银杏(ginkgo biloba l.)为裸子植物中最古老的孑遗植物。银杏的叶、果、树皮均可入药，尤其叶的药用价值最高，性平，味甘、苦、涩，具有活血化瘀，化浊降脂等功效。现代研究表明，银杏叶具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、改善记忆力、治疗心脑血管疾病等多种药理活性。银杏叶化学成分复杂，其中，黄酮类化合物作为重要的活性成分之一，也是药物制剂和保健食品的主要成分，具有抗氧化、提高免疫力、抗炎等多种药理作用。以银杏叶总黄酮提取物为成分的中药制剂、保健产品具有非常大的市场规模。
3.目前提取银杏叶总黄酮一般直接采用醇溶液抽提法，细胞内的物质溶出较少，提取效率低。因此，故开发简便高效、效率较高的银杏叶黄酮类化合物的提取工艺有重要的现实意义。


技术实现要素：

4.本发明提出了一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，采用本发明的方法制备的银杏叶总黄酮醇苷含量明显提高，对中药资源的开发及提高经济价值具有重要的实践意义。
5.本发明技术方案如下：
6.一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，以银杏叶为原料，与水按料液比1g：15～25ml混合，采用菌种发酵；所述菌种为嗜酸乳杆菌。
7.具体步骤如下：
8.(1)将菌种接种到mrs培养基中培养得活化菌种；
9.(2)称取粉碎的银杏叶粉末，加入蒸馏水，密封超声混匀，调节ph，灭菌，冷却至室温，得银杏叶发酵基质；
10.(3)向银杏叶发酵基质中接种活化菌种，发酵得发酵液。
11.优选地，所述步骤(2)中，银杏叶：蒸馏水＝1g：15～25ml；更优选地，银杏叶：蒸馏水＝1g：20ml。
12.优选地，在步骤(2)中，所述ph调节至6.0。
13.优选地，在步骤(2)中，所述灭菌为121℃高压湿热灭菌20min。
14.优选地，所述步骤(3)中，活化菌种的接种量为银杏叶发酵基质总体积的1％～3％；更优选地，活化菌种的接种量为3％。
15.优选地，所述步骤(3)中，发酵条件为，密封静置，发酵温度37℃，发酵时间12～36h，ph为5.5～6.0；更优选地，发酵条件为，密封静置，发酵温度37℃，发酵时间12h，ph为5.5。
16.本方法得到的发酵液可进一步干燥得固态成品，用于银杏叶总黄酮的提取制备。
17.本发明的有益效果如下：
18.(1)本发明采用液体发酵技术，采用单一食用菌对银杏叶进行发酵，安全性高，明显提高银杏叶中活性成分的含量，该方法操作简单，发酵周期短，所得产物营养价值高，对银杏叶资源的开发及提高经济价值具有重要的实践意义；
19.(2)本发明对银杏叶发酵工艺进行筛选，最优发酵条件下银杏叶中总黄酮醇苷的含量相比于空白组未发酵的银杏叶明显增加，总黄酮醇苷提取率高，成本低，原料来源广，可以在银杏叶提取物的工业生产中得到推广应用。
附图说明
20.图1为本发明提供的混合对照品(a)、空白组未发酵样品(b)和发酵样品(c)的黄酮醇苷的hplc图谱；其中，1为槲皮素，2为山奈酚，3为异鼠李素。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.实施例1
23.1.1发酵银杏叶
24.一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，以银杏叶为原料，与水按料液比1g：20ml混合，采用嗜酸乳杆菌发酵；
25.具体步骤如下：
26.(1)将菌种接种到mrs培养基中培养得活化菌种；
27.(2)称取粉碎的银杏叶粉末，以料液比1g：20ml加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质；
28.(3)向银杏叶发酵基质中以接种量3％接种活化菌种，于温度37℃、ph5.5的条件下静置密封12h发酵得发酵液。
29.1.2发酵液中总黄酮醇苷的含量测定
30.1.2.1发酵样品溶液的制备
31.发酵结束后，将发酵液倒入在105℃下烘干至恒重的蒸发皿中，用无水乙醇洗涤广口瓶至发酵液完全转移至蒸发皿中，将发酵液蒸干至恒重。用25ml甲醇将残渣转移至圆底烧瓶中，加热回流提取4h，冷却至室温，离心，取上清液，过0.22μm滤膜，即得。
32.1.2.2含量测定
33.采用高效液相色谱法，以槲皮素、山奈酚和异鼠李素为混合对照品计算发酵液中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量，按照公式计算总黄酮醇苷含量，总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量)
×
2.51；取1.2.1中发酵样品溶液按以下色谱条件进行洗脱，色谱条件如下：
34.色谱柱：agilent zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；柱温30℃；进样量10μl；检测波长360nm；流动相0.4％磷酸水溶液(a)-乙腈(b)；梯度洗脱，洗脱程序见表1。
35.表1洗脱程序表
[0036][0037]
通过线性关系考察、精密度、稳定性和重复性等实验方法学研究，结果表明该含量测定方法稳定、可靠，色谱图见图1。
[0038]
经检测，本实施例下发酵液中总黄酮醇苷含量为0.58mg
·
g-1
。
[0039]
实施例2
[0040]
一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，以银杏叶为原料，与水按料液比1g：15ml混合，采用嗜酸乳杆菌发酵；
[0041]
具体步骤如下：
[0042]
(1)将菌种接种到mrs培养基中培养得活化菌种；
[0043]
(2)称取粉碎的银杏叶粉末，以料液比1g：15ml加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质；
[0044]
(3)向银杏叶发酵基质中以接种量2％接种活化菌种，于温度37℃、ph5.8的条件下静置密封36h发酵得发酵液。
[0045]
按实施例1中1.2的含量测定方法测得发酵液中总黄酮醇苷含量为0.55mg
·
g-1
。
[0046]
实施例3
[0047]
一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，以银杏叶为原料，与水按料液比1g：25ml混合，采用嗜酸乳杆菌发酵；
[0048]
具体步骤如下：
[0049]
(1)将菌种接种到mrs培养基中培养得活化菌种；
[0050]
(2)称取粉碎的银杏叶粉末，以料液比1g：25ml加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质；
[0051]
(3)向银杏叶发酵基质中以接种量2％接种活化菌种，于温度37℃、ph6.0的条件下静置密封24h发酵得发酵液。
[0052]
按实施例1中1.2的含量测定方法测得发酵液中总黄酮醇苷含量为0.56mg
·
g-1
。
[0053]
实施例4银杏叶发酵工艺研究
[0054]
4.1菌种的筛选
[0055]
本实验以嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌为发酵菌种进行筛选。
[0056]
称取粉碎的银杏叶粉末，以料液比1g：20ml加入蒸馏水，密封超声20min，用ph计调至各菌种的最适ph(嗜酸乳杆菌6.0，植物乳杆菌6.5，发酵乳杆菌6.2，凝结芽孢杆菌6.7)，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质。
[0057]
从-80℃冰箱取出用甘油保存的各菌种，室温解冻，在超净台内接种至各菌种适宜的培养基中，按表1活化条件进行培养。将活化好的各菌种分别以2％的接种量接种到银杏叶发酵基质中按表2所示条件进行发酵，发酵结束后，按实施例1中1.2的含量测定方法处理
和计算发酵液中总黄酮醇苷含量，结果见表3。
[0058]
表1各菌种活化条件
[0059][0060]
表2各菌种发酵条件
[0061][0062]
表3不同菌种发酵条件下银杏叶中总黄酮醇苷的含量(x
±
sd)
[0063][0064][0065]
由表3可知，不同菌种对银杏叶发酵的影响不同，发酵乳杆菌也能提高发酵液中总黄酮醇苷含量，但效果不如嗜酸乳杆菌。以嗜酸乳杆菌为菌种进行发酵时，银杏叶中总黄酮醇苷的含量明显增加。因此，选择嗜酸乳杆菌作为银杏叶发酵的优化菌种。
[0066]
4.2发酵时间对银杏叶发酵的影响
[0067]
探究发酵时间对银杏叶发酵的影响，分别测定4个不同发酵时间条件下，银杏叶中总黄酮醇苷的含量。
[0068]
称取粉碎的银杏叶粉末，以料液比1g：20ml加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质。
[0069]
向银杏叶发酵基质中以接种量2％接种4.1筛选出的活化嗜酸乳杆菌，于ph6.0的条件下分别静置密封发酵0h、12h、24h、36h得发酵液。发酵结束后，按实施例1中1.2的含量测定方法处理和计算发酵液中总黄酮醇苷含量，结果见表4。
[0070]
表4不同发酵时间条件下银杏叶中总黄酮醇苷的含量(x
±
sd)
[0071][0072]
由表4可知，发酵银杏叶中总黄酮醇苷的含量呈现出先升高后降低的趋势，并且在发酵时间12h时，总黄酮醇苷含量有最大值。36h之后，随着发酵时间的延长，营养物质被消耗殆尽，从而影响嗜酸乳杆菌的生长，进而影响其分解和代谢作用，使得总黄酮醇苷的含量不断下降。因此，选择发酵时间12～36h作为银杏叶发酵的优化条件。
[0073]
4.3料液比对银杏叶发酵的影响
[0074]
探究料液比对银杏叶发酵的影响，分别测定4个不同料液比条件下，银杏叶中总黄酮醇苷的含量。
[0075]
称取粉碎的银杏叶粉末，分别以1g：10ml、1g：15ml、1g：20ml、1g：25ml的料液比加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质。
[0076]
向银杏叶发酵基质中以接种量2％接种活化嗜酸乳杆菌，于ph6.0的条件下静置密封发酵12h得发酵液。发酵结束后，按实施例1中1.2的含量测定方法处理和计算发酵液中总黄酮醇苷含量，结果见表5。
[0077]
表5不同料液比发酵条件下银杏叶中总黄酮醇苷的含量(x
±
sd)
[0078][0079]
由表5可知，发酵银杏叶中总黄酮醇苷的含量随料液比的增加，呈现出先升高后降低的趋势，并且料液比在1g：20ml时，发酵银杏叶中总黄酮醇苷含量有最大值。料液比过小或过大时，都会对嗜酸乳杆菌的生长繁殖造成影响，使得菌种对银杏叶的分解和代谢作用减弱，总黄酮醇苷的含量也相应减少。因此，选择料液比1g：15～25ml作为银杏叶发酵的优化条件。4.4接种量对银杏叶发酵的影响
[0080]
探究接种量对银杏叶发酵的影响，分别测定4个不同接种量的条件下，银杏叶中总黄酮醇苷的含量。
[0081]
称取粉碎的银杏叶粉末，分别以1g：20ml的料液比加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质。
[0082]
向银杏叶发酵基质中分别以接种量1％、2％、3％、4％接种活化嗜酸乳杆菌，于ph6.0的条件下静置密封发酵12h得发酵液。发酵结束后，按实施例1中1.2的含量测定方法处理和计算发酵液中总黄酮醇苷含量，结果见表6。
[0083]
表6不同接种量发酵条件下银杏叶中总黄酮醇苷的含量(x
±
sd)
[0084][0085]
由表6可知，发酵银杏叶中总黄酮醇苷的含量随接种量的增加，呈现出先升高后降低的趋势，并且在接种量3％时，总黄酮醇苷含量有最大值。随着接种量的不断增加，嗜酸乳杆菌之间会相互竞争营养物质，使得嗜酸乳杆菌的生长受到一定的制约，对银杏叶的分解和代谢作用减弱，不利于发酵的进行。因此，选择接种量1％～3％作为银杏叶发酵的优化条件。
[0086]
4.5ph对银杏叶发酵的影响
[0087]
探究ph对银杏叶发酵的影响，分别测定4个不同ph条件下，银杏叶中总黄酮醇苷的含量。
[0088]
称取粉碎的银杏叶粉末，以1g：20ml的料液比加入蒸馏水，密封超声20min，调节ph至6.0，121℃高压湿热灭菌20min，冷却至室温，得银杏叶发酵基质。
[0089]
向银杏叶发酵基质中以接种量3％接种活化嗜酸乳杆菌，分别于ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0的条件下静置密封发酵12h得发酵液。发酵结束后，按实施例1中1.2的含量测定方法处理和计算发酵液中总黄酮醇苷含量，结果见表7。
[0090]
表7不同ph发酵条件下银杏叶中总黄酮醇苷的含量(x
±
sd)
[0091][0092]
由表7可知，银杏叶中总黄酮醇苷的含量呈现出不断下降的趋势，在该ph范围内，当ph为5.5时，发酵银杏叶中总黄酮醇苷的含量有最大值。嗜酸乳杆菌的适宜生长ph范围为5.5～6.0，当超出这一ph范围，嗜酸乳杆菌的生长活性受到制约，甚至失活。因此，选择ph5.5～6.0作为银杏叶发酵的优化条件。
[0093]
综上所述，本实施例对银杏叶发酵工艺进行了筛选，经过实验得到最终银杏叶发酵的最优条件为：以嗜酸乳杆菌为菌种进行发酵，优化的发酵工艺条件为：料液比1g：15～25ml、菌种接种量1％～3％、发酵时间12～36h、ph5.5～6.0。
[0094]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，以银杏叶为原料，与水按料液比1g：15～25ml混合，采用菌种发酵；所述菌种为嗜酸乳杆菌。2.根据权利要求1所述的微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将菌种接种到mrs培养基中培养得活化菌种；(2)称取粉碎的银杏叶粉末，加入蒸馏水，密封超声混匀，调节ph，灭菌，冷却至室温，得银杏叶发酵基质；(3)向银杏叶发酵基质中接种活化菌种，发酵得发酵液。3.根据权利要求2所述的微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述ph调节至6.0。4.根据权利要求2所述的微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述灭菌为121℃高压湿热灭菌20min。5.根据权利要求2所述的微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，活化菌种的接种量为1％～3％。6.根据权利要求2所述的微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，发酵条件为，密封静置，发酵温度37℃，发酵时间12～36h，ph为5.5～6.0。7.根据权利要求2所述的微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法，其特征在于，还包括发酵液中总黄酮醇苷的检测，所述总黄酮醇苷包括槲皮素、山奈酚和异鼠李素；具体色谱条件如下：色谱柱：agilent zorbax sb-c18，4.6mm
×
250mm，5μm；流动相0.4％磷酸水溶液-乙腈；柱温30℃；进样量10μl；检测波长360nm。

技术总结
本发明属于提取工艺技术领域，具体涉及一种微生物发酵技术制备银杏叶总黄酮的方法。本发明以银杏叶为原料，采用嗜酸乳杆菌发酵；称取粉碎的银杏叶粉末，以1g：15～25mL的料液比加入蒸馏水，密封超声混匀，调节pH，灭菌，冷却至室温，得银杏叶发酵基质；向银杏叶发酵基质中以接种量1％～3％接种活化嗜酸乳杆菌，于37℃、pH5.5～6.0的条件下静置密封12～36h得发酵液。本发明所用方法可以明显提高银杏叶中总黄酮提取率，且操作简单，发酵周期短，对银杏叶资源的开发及提高经济价值具有重要的实践意义。义。义。


技术研发人员：车勇 张芳 李佳楠 范润泽 马丽虹 战戈
受保护的技术使用者：山东医药技师学院
技术研发日：2023.08.03
技术公布日：2023/10/6