超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法

d9)和1-萘酚-d7(1-oh-nap-d7)混合而成；
10.步骤2、测定表层沉积物中羟基多环芳烃的含量：
11.采用hplc-ms/ms对地表水待测分析样品和沉积物待测分析样品上机检测，得到表层沉积物中的目标检测物羟基多环芳烃的含量数据。
12.进一步地，所述步骤1的有机相滤膜的孔径为0.22μm。
13.进一步地，所述步骤1中将溶液a转移至hlb和psa固相萃取小柱的流速均为3～5ml/min。
14.进一步地，所述步骤1的过筛是将冷冻干燥后的沉积物过200目筛。
15.进一步地，所述步骤1的漩涡振荡时间为10s。
16.进一步地，所述步骤1中的超声振荡并离心的具体过程为：先超声振荡20min，再静置12h，接着超声振荡20min，然后利用转速为3000r/min离心机离心5min。
17.进一步地，所述步骤1的负压抽干时间为20min。
18.进一步地，所述步骤2中的hplc-ms/ms是高效液相色谱仪与三重四级杆质谱的联用，以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
19.进一步地，所述液相色谱仪的检测条件为：流动相a是纯水，流动相b是乙腈，流速为0.4ml/min，进样体积为2μl，色谱柱为c18液相色谱柱，色谱柱温为25℃。
20.进一步地，所述质谱的检测条件为：ajs esi离子源为负离子；扫描方式为选择离子反应监测mrm模式扫描；干燥气温度为300℃，干燥气流速为5l/min；雾化气压力为35psi；鞘气温度为250℃，鞘气流速为11l/min；毛细管电压为4000v(+)和3500v(-)；喷嘴电压为500v(+)和500v(-)。
21.本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
22.本发明使用液相色谱-质谱联用技术进行oh-pahs的定性定量检测，利用离子对及它们的保留时间对oh-pahs进行准确定性鉴定，提高了检测的靶向性，克服了一般方法分析定性不精准的缺点；同时根据特异子离子的丰度对oh-pahs进行定量检测，极大提高了检测灵敏度。
23.本发明的方法优点如下：(1)准确度和灵敏度高、重现性好、回收率高；(2)有机溶剂消耗少、杂质干扰较少；(3)采用固相提取法富集净化目标产物，操作简单、分离效果好；(4)涵盖了水环境中常见的9种羟基多环芳烃的检测，适用性广泛，便于在不同实验室开展大量水环境沉积物样本的分析。
附图说明
24.图1、本发明表层沉积物中9种oh-pahs及其相应的内标物的液相色谱三重四级杆质谱出峰时间和色谱图；
25.图2、本发明高效液相色谱-串联质谱法测定的1-oh-nap、2-oh-nap和1-oh-nap-d7的标准曲线图；
26.图3、本发明高效液相色谱-串联质谱法测定的2-oh-phe、3-oh-phe、4-oh-phe、9-oh-phe和3-oh-phe-d9的标准曲线图；
27.图4、本发明高效液相色谱-串联质谱法测定的1-oh-pyr、1-oh-pyr-d9、2-oh-flu和2-oh-9,10-aq的标准曲线图。
具体实施方式
28.以下结合实施例对本发明的具体内容做进一步详细解释说明。
29.本实施例实验过程用到的仪器包括agilent 1260infinityii高效液相色谱仪、agilent 6470lc/tq三重四级杆质谱仪(美国agilent公司)、bsa224s电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)、kq-500db型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、fd-1a-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、tdz4-ws型台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)、re-2000b型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、nai-dcy-12y型圆形水浴氮吹仪(上海那艾精密仪器有限公司)、12孔固相萃取装置(supelco公司，美国)、pb-10型ph计(赛多利斯科学仪器有限公司)、色谱柱infinitylab poroshell 120ec-c18(3.0mm
×
150mm，2.7μm，美国agilent公司)、gf/f玻璃纤维滤膜(孔径0.47μm，英国whatman公司)、oasis hlb固相萃取小柱(500mg/6ml，美国waters公司)、c18、psa和mcx固相萃取柱(500mg/6ml，中国比克曼生物科技有限公司)、vortex型涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，有机系针筒式滤膜过滤器(孔径0.22μm，美国agilent公司)。
30.本实施例的目标检测物主要为1-羟基萘、2-羟基萘、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、2-羟基芴、1-羟基芘和2-羟基-9,10-蒽醌，这9种羟基多环芳烃。
31.本实施例选用的9种oh-pahs标准试剂包括1-萘酚(1-oh-nap)、2-萘酚(2-oh-nap)、2-羟基菲(2-oh-phe)、3-羟基菲(3-oh-phe)、4-羟基菲(4-oh-phe)、9-羟基菲(9-oh-phe)、2-羟基芴(2-oh-flu)、1-羟基芘(1-oh-pyr)、2-羟基-9,10-蒽醌(2-oh-9,10-aq)，选用三种内标物(即，替代物)为1-羟基芘-d9(1-oh-pyr-d9)、3-羟基菲-d9(3-oh-phe-d9)和1-萘酚-d7(1-oh-nap-d7)，且oh-pahs标准试剂和内标物的纯度均≥99％，采自百灵威科技有限公司，具体参见表1，其中，三种替代物均在地表水和沉淀物的前处理之前添加，通过添加的量和经过前处理后上机检测的值，来评价前处理过程中的损失，得到9种目标检测物的回收率r，根据公式(1)计算：
32.r ＝ (a/b)
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
33.式中，a为样品上机液中羟基多环芳烃所测得的质量，经工作曲线计算得出；b为样品中添加的替代物的质量。
34.本实施例选用的甲醇、乙腈、甲酸、二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯均为色谱纯(纯度≥99.0％)，购自美国fisher chemical公司，选用的超纯水为milli-q超纯水(18.2mω.cm)。
35.表1：9种oh-pahs标准试剂和3种内标物的信息
[0036][0037]
一种超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，包括如下步骤：
[0038]
步骤1、沉积物的前处理：
[0039]
取地表水体表层沉积物冷冻干燥并过200目筛，取5g过筛后的沉积物粉末，依次加入100ng替代物混标和300μl甲酸，漩涡振荡10s，再加入30ml乙酸乙酯，超声振荡20min，静置12h，再次超声振荡20min，然后用转速为3000r/min离心机离心5min，将上清液转移至旋蒸仪旋转蒸发至1ml，加入5ml质量浓度为30％的乙腈水溶液充分润洗残渣，得到溶液a；将500mg/6ml的hlb固相萃取小柱和500mg/6ml的psa固相萃取小柱从上向下串联，依次用5ml甲醇和5ml超纯水活化串联后的hlb和psa固相萃取小柱各2次，再将溶液a以3～5ml/min的流速转移至hlb和psa固相萃取小柱，转移过程中始终保持液面高于hlb和psa固相萃取小柱内填料的上表面，用6ml超纯水分别淋洗hlb和psa固相萃取小柱，负压抽干20min，接着用6ml由二氯甲烷和甲醇等体积混合的混合液洗脱hlb固相萃取小柱2次，并收集洗脱液b，用6ml由二氯甲烷和正己烷等体积混合的混合液洗脱psa固相萃取小柱2次，并收集洗脱液c，将洗脱液b和洗脱液c混合，用水浴氮吹仪吹至近干从而去除有机溶剂，最后用乙腈定容至1ml，用孔径为0.22μm的有机相滤膜过滤，得到沉积物待测分析样品；
[0040]
所述替代物混标由等质量的1-羟基芘-d9(1-oh-pyr-d9)、3-羟基菲-d9(3-oh-phe-d9)和1-萘酚-d7(1-oh-nap-d7)混合而成；
[0041]
步骤2、测定表层沉积物中羟基多环芳烃的含量：
[0042]
采用hplc-ms/ms对沉积物待测分析样品上机检测，得到地表水体表层沉积物中的目标检测物羟基多环芳烃的含量数据，hplc-ms/ms是高效液相色谱仪与三重四级杆质谱的联用，以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，其中：
[0043]
所述液相色谱仪的检测条件为：流动相a是纯水，流动相b是乙腈，流速为0.4ml/
min，进样体积为2μl，色谱柱为c18液相色谱柱，色谱柱温为25℃，具体的洗脱程序如表2所示：
[0044]
表2：梯度洗脱程序表
[0045][0046]
所述质谱的检测条件为：ajs esi离子源为负离子；干燥气温度为300℃，干燥气流速为5l/min；雾化气压力为35psi；鞘气温度为250℃，鞘气流速为11l/min；毛细管电压为4000v(+)和3500v(-)；喷嘴电压为500v(+)和500v(-)，扫描方式为多反应监测mrm模式扫描，对各化合物的离子源条件进行了优化，各目标物的质谱参数见表3，各目标物的mrm色谱图如图1所示。
[0047]
表3：mrm模式下9种羟基多环芳烃和3种替代物的质谱参数
[0048][0049]
为了改善羟基多环芳烃的分离效果并提高分析效率，本实施例分别优化了色谱流动相、色谱柱和色谱柱柱温等色谱条件，这是因为色谱流动相的组成影响除保留时间和峰
形外，还会影响离子化效率，进而影响目标物的检测灵敏度，当甲醇作为有机流动相时，峰形较差，实验改用乙腈作为有机流动相时，峰形良好，且离子化效率和响应强度较高。
[0050]
对比infinitylab poroshell 120ec-c18色谱柱(3.0mm
×
150mm,2.7μm,agilent)和zorbax eclipse plus c18色谱柱(rapid resolution hd,3.0mm
×
150mm,1.8μm,agilent)对9种羟基多环芳烃的分离效果，结果表明，poroshell系列的色谱柱能够实现各目标物的离子峰更好的分离，且分离后的羟基多环芳烃峰形更佳。
[0051]
本实施例采用外标法进行定量分析，分别配制1、5、10、25、50、80ng/ml的六个系列质量浓度的oh-pahs标准混合溶液，按照上述质谱参数液相参数条件上机测试，根据测定结果绘制标准曲线，如图2～图4所示，可以看出9种羟基多环芳烃和3种替代物的浓度(x)与峰面积(y)之间的线性关系良好，相关系数r2均大于0.99，9种羟基多环芳烃和3种替代物的线性关系见表4：
[0052]
表4：9种羟基多环芳烃和3种替代物的线性范围
[0053][0054]
对前处理过程，本实施例考察了甲酸含量、萃取液、固相萃取小柱和洗脱液四个因素对沉积物萃取的影响，设计四因素四水平的正交实验，因素水平表如表5：
[0055]
表5：沉积物中oh-pahs前处理因素水平表
[0056][0057]
通过正交试验测试，得到的最优前处理条件是：乙酸乙酯作为萃取液、甲酸含量取萃取液的1％、萃取柱为psa柱和hlb柱、12ml二氯甲烷和正己烷混合液(v/v,1:1)洗脱psa固相萃取小柱以及12ml二氯甲烷和甲醇等体积的混合液(v/v,1:1)洗脱hlb固相萃取小柱，将
回收率相对较高且互补的两种方法结合，即将psa柱和hlb柱(hlb在上，psa在下)串联起来，作为我们表层沉积物中的前处理方法。
[0058]
为了考察本实施例对表层沉积物中沉积物检测分析方法的精密度以及目标物的回收率，对硅藻土进行加标实验，取3份5g的硅藻土，向其中均加入10ng的9种oh-pahs混合标准溶液和3种替代标，使硅藻土中oh-pahs浓度为0.01ng/g，经前处理方法后上机检测，按照3倍信噪比对应的浓度为检出限，10倍信噪比对应的浓度为定量限，通过qqq定量分析软件给出的相应浓度的信噪比，通过折算，可得沉积物中9种oh-pahs的方法检出限为0.007～0.319ng/g，定量限为0.024～1.063ng/g，如表6所示，沉积物中oh-pahs前处理后的回收率为64.53％～102.53％，回收率均高于60％。
[0059]
表6：9种羟基多环芳烃在硅藻土中的检出限、定量限、回收率和相对标准偏差(n＝3)
[0060][0061]
本实施例通过外标法进行定量，以标准系列浓度为横坐标，标准物质的峰面积为纵坐标，绘制公式(2)对应的标准曲线，如图2～图4所示，然后根据公式(3)进行样品中羟基多环芳烃含量的计算：
[0062]
y＝ax+b
………………………………
(2)
[0063]
式中，x、标准进样浓度，ng/ml；y、标准的响应峰面积；a、工作曲线的斜率；b、工作曲线的截距；
[0064][0065]
式中，ci，样品中羟基多环芳烃的浓度，ng/g；xi，上机液浓度，由样品上机液中羟基多环芳烃的峰面积，经工作曲线计算得出，ng/ml；v
t
，萃取液定容体积，ml；vs，萃取样品体积，g；r，羟基多环芳烃的回收率。
[0066]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。

技术特征：
1.超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、沉积物的前处理：取沉积物冷冻干燥并过筛，取5g过筛后的沉积物粉末，依次加入100ng替代物混标和甲酸，漩涡振荡，再加入乙酸乙酯，超声振荡并离心，将上清液转移至旋蒸仪旋转蒸发至1ml，加入质量浓度为30％的乙腈水溶液充分润洗残渣，得到溶液a；将hlb固相萃取小柱和psa固相萃取小柱从上向下串联，依次用甲醇和超纯水充分活化串联后的hlb和psa固相萃取小柱，再将溶液a转移至hlb和psa固相萃取小柱，转移过程中始终保持液面高于hlb和psa固相萃取小柱内填料的上表面，用超纯水分别淋洗hlb和psa固相萃取小柱，负压抽干，接着用由二氯甲烷和甲醇等体积混合的混合液充分洗脱hlb固相萃取小柱，并收集洗脱液b，用由二氯甲烷和正己烷等体积混合的混合液充分洗脱psa固相萃取小柱，并收集洗脱液c，将洗脱液b和洗脱液c混合，用水浴氮吹仪吹至近干，最后用乙腈定容至1ml，用有机相滤膜过滤，得到沉积物待测分析样品；所述替代物混标由等质量的1-羟基芘-d9(1-oh-pyr-d9)、3-羟基菲-d9(3-oh-phe-d9)和1-萘酚-d7(1-oh-nap-d7)混合而成；步骤2、测定表层沉积物中羟基多环芳烃的含量：采用hplc-ms/ms对沉积物待测分析样品上机检测，得到表层沉积物中的目标检测物羟基多环芳烃的含量数据。2.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤1中有机相滤膜的孔径为0.22μm。3.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤1中将溶液a转移至hlb和psa固相萃取小柱的流速均为3～5ml/min。4.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤1的过筛是将冷冻干燥后的沉积物过200目筛。5.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤1的漩涡振荡时间为10s。6.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤1中的超声振荡并离心的具体过程为：先超声振荡20min，再静置12h，接着超声振荡20min，然后利用低速离心机以3000r/min的转速离心5min。7.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤1的负压抽干时间为20min。8.根据权利要求1所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述步骤2中的hplc-ms/ms是高效液相色谱仪与三重四级杆质谱的联用，以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。9.根据权利要求8所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述液相色谱仪的检测条件为：流动相a是纯水，流动相b是乙腈，流速为0.4ml/min，进样体积为2μl，色谱柱为c18液相色谱柱，色谱柱温为25℃。
10.根据权利要求8或9所述的超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，其特征在于，所述质谱的检测条件为：ajs esi离子源为负离子；扫描方式为选择离子反应监测mrm模式扫描；干燥气温度为300℃，干燥气流速为5l/min；雾化气压力为35psi；鞘气温度为250℃，鞘气流速为11l/min；毛细管电压为4000v(+)和3500v(-)；喷嘴电压为500v(+)和500 v(-)。

技术总结
本发明公开了超声波萃取-固相提取-液相色谱串联质谱分析沉积物中羟基多环芳烃的方法，包括：1、取沉积物干燥并过筛，加入替代物混标和甲酸，用乙酸乙酯超声萃取，加入乙腈水溶液得到溶液A；用甲醇和超纯水活化串联后的HLB和PSA固相萃取小柱并移入溶液A，用超纯水淋洗，用二氯甲烷和甲醇混合液、二氯甲烷和正己烷混合液洗脱HLB固相萃取小柱和PSA固相萃取小柱，将洗脱液B和C混合氮吹后，用乙腈定容得到待测样品；2、测待测样品中羟基多环芳烃的含量。本发明能够高效准确地检测地表水体表层沉积物中OH-PAHs。PAHs。PAHs。


技术研发人员：葛林科 车晓佳 曹胜凯
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/10/6