一种抗菌涂层及其应用

1.本发明涉及牙种植体表面改性的技术领域，尤其涉及一种抗菌涂层，用于种植体表面改性。


背景技术：

2.目前，在口腔临床上，牙科种植体已成为牙列缺损的有效修复方式之一，为越来越多的患者所接受和认可。然而，种植体相关感染问题仍是种植术后最严重的并发症之一，最坏往往导致种植体的松动、脱落，有些需要进行二次手术，给患者带来心理创伤和经济负担。因此明确种植体周围感染的发病机制和探索种植体周围感染的预防方法，对于减少和预防种植体周围感染的发生，进而提高种植成功率和种植体的使用寿命至关重要。种植体周围感染本质上是一种破坏种植体周围组织的炎症性损害，依据发生时间可将其分为早期感染和晚期感染。早期感染发生在种植体与骨结合之前，即种植体植入后的初始愈合期，主要是因为细菌的侵入和手术的创伤，可能会损害或者妨碍到种植体与骨的结合；晚期感染发生在种植体与骨结合之后，主要和种植体周围炎有关，若感染没有及时治疗，将会对已形成的种植体-骨界面造成渐进性的破坏。相较于晚期感染，种植体早期的术后感染是导致治疗失败的主要原因。由于口腔环境是多菌环境，手术中对施术局部细菌量极难控制，严重时将导致种植体周围骨溶解，继而引发了种植体松动甚至脱落，故抗菌是保持种植体长效稳定性的重要因素之一。
3.口腔中的微生物群可能对新植入的种植体的生物膜形成具有实质性的影响。mirjamm.等人对种植体和牙齿周围初期黏附细菌的比较研究中发现，金黄色葡萄球菌在种植体表面早期定植的细菌中所占比例较高。目前，越来越多的证据表明，金黄色葡萄球菌可能是一些种植体牙周炎病例发病的重要病原体，许多研究也报道了金黄色葡萄球菌、肠杆菌和白色念珠菌与种植体周围炎症的联系。
4.钛及其合金因具有良好的生物相容性、机械性能，良好的耐腐蚀性被认为是最佳的种植体材料。然而，钛基材料不具备抗菌性，在种植的早期阶段，种植体周围的感染和不良的骨整合造成种植体周围支持组织丧失，往往是导致治疗失败的主要原因。与天然牙相比，种植义齿有其特殊性，种植体袖口，即包绕种植体穿龈处的口腔软组织，此处的结合上皮主要起屏障作用，对种植体周形成了良好的生物封闭。但与天然牙相比，种植体袖口处的结合上皮附着较薄，因此其屏障作用也就相对较弱。另外，种植体周围结缔组织内的血管相对于天然牙较少，种植体与骨的结合界面缺乏牙周膜，当有细菌入侵时，该区域的炎症反应就会较低，免疫防御能力也相应的较弱，细菌就会在此部位聚集繁殖，进而发生种植体周围感染。
5.抗生素类抗菌涂层主要通过各种抗生素独特的抗菌方式来抗菌，具有生物相容性好、针对性抗菌的优点，而耐药性的产生是其最大的缺点。杆菌肽是一种广泛使用的金属肽抗生素，由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产生，具有强大的杀菌活性，主要针对革兰氏阳性菌。这种抗生素需要一种二价金属离子(如zn)来获得其生物活性。尽管几十年的广泛使用，
细菌对杆菌肽的耐药性仍然罕见。最近发表的一篇文章表明，对抗生素多肽的耐药性的出现低于对传统抗生素的耐药性。因此，杆菌肽可以作为更好地理解抗生素肽的结构和功能关系的原型，并作为未来合理设计抗生素肽的主导药物。此外，杆菌肽化学合成的成功也使其使用成本大大降低。近年来，几个金属肽家族已被设计为探索金属蛋白结构和功能的模型系统。了解抗生素肽金属杆菌肽的结构和功能关系，也为合理设计金属肽作为金属蛋白的潜在模型指明了新的方向。杆菌肽可以通过特异性与细胞壁的主要物质肽聚糖的合成前体结合，阻断细胞壁的合成，但对于真核动物的细胞无明显作用，所以可以在具有杀菌性的同时无细胞毒性，并且自从20世纪80年代被提出至今未发现耐药性的产生，是一种理想的抗菌物质。
6.杆菌肽分子包含一个环十二肽、一个特殊的噻唑啉环，一个环七肽结构，以及4个d-氨基酸。这些不寻常的结构特征可以保护该肽不被蛋白酶降解，杆菌肽的“尾巴”向七元环弯曲，将噻唑啉环、glu和his靠近，在溶液中形成一个潜在的金属结合位点。通过杆菌肽上的氨基、我们寻找出一种可以与其共价结合的自聚合物质去甲基肾上腺素(ne),并且通过与zn的配位作用，正负点吸引作用，通过一步共混法帮助杆菌肽高效负载于涂层表面。
7.本发明通过对杆菌肽分子特点的分析，为其寻找出一个适合其负载并发挥其抗菌功能的涂层构建方式，利用ne与杆菌肽之间的电荷作用、共价作用，ne与zn离子之间的配位作用，通过一步共混法形成稳定的涂层，在实现抗菌性的同时兼顾其细胞相容性，为类似结构的种植体表面改性提供一种新的策略。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是提供一种适合杆菌肽负载并发挥其抗菌功能的涂层。
9.为实现上述目的，本发明提供了一种抗菌涂层，其由儿茶酚胺、杆菌肽、金属离子聚合形成。
10.在本发明的较佳实施方式中，本发明提供了一种抗菌涂层，其制备方法为：在tris溶液、在常温、有氧条件下，将溶解的儿茶酚胺、杆菌肽、金属离子的混合物在钛片上反应24h，后超声清洗表面沉淀，吹干，制得抗菌涂层。
11.优选地，tris溶液的ph为7.5-9.5。
12.优选地，有氧条件为暴露在空气中。
13.优选地，儿茶酚胺为去甲基肾上腺素。
14.优选地，金属离子为zncl2。
15.优选地，所述去甲基肾上腺素浓度为1-5mg/ml，所述杆菌肽的浓度为0.12-1mg/ml，所述zncl2的浓度为0.5-2mg/ml。
16.更优选地，所述去甲基肾上腺素浓度为3mg/ml，所述杆菌肽的浓度为0.25mg/ml，所述zncl2的浓度为1mg/ml。
17.在本发明的另一较佳实施方式中，本发明所述抗菌涂层作为介入性医疗器械表面改性的应用。
18.优选地，所述介入性医疗器械为牙种植体。
19.本发明构建的抗菌涂层对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性能，抑菌率达到
72％，同时所述抗菌涂层对人体没有毒性，具有良好的生物相容性。
附图说明
20.图1是一步共混法和多步共混法制得的抗菌涂层抗金黄色葡萄球菌性能的检测结果，其中a组为多步接枝法制得的ne抗菌涂层(ne+杆+zn)，b组为多步接枝法制得的多巴胺(dopa)抗菌涂层(dopa+杆+zn)，c组为一步共混法制得的ne抗菌涂层(ne@杆@zn)，d组为一步共混法制得的多巴胺(dopa)抗菌涂层(dopa@杆@zn)，c为空白对照组；
21.图2是多种工艺制得抗菌涂层抗金黄色葡萄球菌性能的检测结果；
22.图3是不同浓度杆菌肽制备的ne@杆@zn抗菌涂层抗金黄色葡萄球菌性能的检测结果；
23.图4是不同浓度杆菌肽制备的ne@杆@zn抗菌涂层的cck-8增殖的检测结果；
24.图5是不同浓度杆菌肽制备的ne@杆@zn抗菌涂层对mc3t3-e1增殖的荧光染色结果。
具体实施方式
25.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
26.实施例1
27.本发明首先对基底材料进行了选择，在众多儿茶酚胺材料中，筛选到去甲基肾上腺素作为基底材料，能够制备得到具有抗菌性能的涂层，在本发明中以儿茶酚胺常用材料多巴胺作为对比材料。
28.1.涂层制备：
29.1)一步共混法：在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，将溶解的儿茶酚胺(3mg/ml)、杆菌肽(0.25mg/ml)、zncl2(1mg/ml)与钛片进行反应24h，后超声清洗表面沉淀，吹干，制得抗菌涂层。
30.2)多步接枝法：在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的儿茶酚胺(3mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；再在同样ph，温度和氧气条件下将杆菌肽(0.25mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；最后在同样ph，温度和氧气条件下将zncl2(1mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得抗菌涂层。
31.2.体外抗菌性能评价
32.采用浊度法对制备得到的儿茶酚胺涂层的抗金黄色葡萄球菌性能进行评价，a组为多步接枝法制得的ne抗菌涂层(ne+杆+zn)，b组为多步接枝法制得的多巴胺(dopa)抗菌涂层(dopa+杆+zn)，c组为一步共混法制得的ne抗菌涂层(ne@杆@zn)，d组为一步共混法制得的多巴胺(dopa)抗菌涂层(dopa@杆@zn)，c为空白对照组，如图1所示，仅由c组涂层展现出对金黄色葡萄球菌有明显的抗菌性能。
33.实施例2
34.为了探究涂层负载机制与抗菌性能的关系，本发明制备了多种工艺的抗菌涂层。
35.1.涂层制备：
36.1)空白对照。
37.2)在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne涂层。
38.3)在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)和zncl2(1mg/ml)混合在钛片上反应24h，超声清洗，
39.吹干，制得ne@zn涂层。
40.4)多步接枝法：在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)和zncl2(1mg/ml)混合在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；再在同样ph，温度和氧气条件下将杆菌肽(0.25mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne@zn+杆抗菌涂层。
41.5)在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；再在同样ph，温度和氧气条件下将杆菌肽(0.25mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne+杆涂层。
42.6)在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)和杆菌肽(0.25mg/ml)混合在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne@杆涂层。
43.7)多步接枝法：在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)和杆菌肽(0.25mg/ml)混合在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；再在同样ph，温度和氧气条件下将zncl2(1mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne@杆+zn抗菌涂层。
44.8)一步共混法：如实施例1所示制得ne@杆@zn抗菌涂层。
45.9)在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；再在同样ph，温度和氧气条件下将zncl2(1mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne+杆涂层。
46.10)多步接枝法：如实施例1所示制得ne+杆+zn抗菌涂层。
47.11)多步接枝法：在碱性条件下，利用tris溶液(ph＝8.5，1.21mg/ml),在常温(25℃)、有氧条件下，首先将溶解的ne(3mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；再在同样ph，温度和氧气条件下将zncl2(1mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干；最后在同样ph，温度和氧气条件下将杆菌肽(0.25mg/ml)在钛片上反应24h，超声清洗，吹干，制得ne+zn+杆抗菌涂层。
48.2.体外抗菌性能评价
49.采用浊度法对制备得到的涂层的抗金黄色葡萄球菌性能进行评价，c为空白对照，ne为ne涂层，3为ne@zn涂层，4为ne@zn+杆抗菌涂层，5为ne+杆涂层，6为ne@杆涂层，7为ne@杆+zn抗菌涂层，8为ne@杆@zn抗菌涂层，9为ne+杆涂层，10为ne+杆+zn抗菌涂层，11为ne+zn+杆抗菌涂层。如图2所示，8和11涂层展现出对金黄色葡萄球菌明显的抗菌性能，我们对上述结果进行了猜想，ne@zn+杆无抗菌性、ne+zn+杆却有抗菌性，可能时ne@zn共混将zn包裹从而难以实现抗菌，而ne+zn+杆有大量的zn在涂层表面从而也产生良好的抗菌；ne@杆+zn和ne+杆+zn都无抗菌性，这可能是由于没有zn的加入杆菌肽难以大量负载与ne表面；一步
共混法并不会出现杆菌肽和zn的包裹而无法释放问题，抗菌性良好。
50.实施例3
51.由于一步共混法具有操作简单，制备工艺缩短的优势，本发明进一步针对一步共混法探究其抗菌性能。
52.如实施例1所示工艺制备0.125mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml杆菌肽的ne@杆@zn抗菌涂层。采用浊度法对制备得到的涂层的抗金黄色葡萄球菌性能进行评价。如图3所示，杆菌肽浓度增加到0.25mg/ml后，抗菌效果趋于稳定。
53.进一步考虑一步共混法制备的ne@杆@zn抗菌涂层的生物相容性。在我们先前的研究中，ne涂层具有良好的生物相容性，现针对不同浓度的杆菌肽和zn浓度进行生物相容性的探究。
54.如实施例1所示工艺制备0.125mg/ml，025mg/ml，0.5mg/ml杆菌肽的ne@杆@zn抗菌涂层。
55.以bmsc/mc3t3-e1作为实验材料，进行cck-8(cellcountingkit-8)检测，定量检测细胞生长数量，分别测量1/3d的od值；同时采用荧光染色法观察细胞形态，分别培养1d/3d，拍摄荧光照片。如图4a所示，0.125mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml杆菌肽的ne@杆@zn抗菌涂层生物相容性均表现为良好，荧光染色法与cck-8检测的结果一致，如图4b所示。出于经济角度考虑，杆菌肽浓度选择0.25mg/ml。
56.进一步探究zn浓度对生物相容性的影响。
57.如实施例1所示工艺制备025mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml zncl2的ne@杆@zn抗菌涂层。
58.以bmsc/mc3t3-e1作为实验材料，进行cck-8(cellcountingkit-8)检测，定量检测细胞生长数量，分别测量1/3d的od值；同时采用荧光染色法观察细胞形态，分别培养1d/3d，拍摄荧光照片。如图5a所示，0.25mg/ml，0.5mg/ml zncl2制得的ne@杆@zn抗菌涂层表现出了毒性，1mg/ml zncl2的ne@杆@zn抗菌涂层生物相容性良好。荧光染色法与cck-8检测的结果一致，如图5b所示。本发明抗菌涂层使用zncl2较好的浓度为1mg/ml。
59.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种抗菌涂层，其由儿茶酚胺、杆菌肽、金属离子聚合形成。2.一种抗菌涂层，其制备方法为：在tris溶液、在常温、有氧条件下，将溶解的儿茶酚胺、杆菌肽、金属离子的混合物在钛片上反应24h，后超声清洗表面沉淀，吹干，制得抗菌涂层。3.根据权利要求2所述的抗菌涂层，其特征在于，所述tris溶液的ph为7.5-9.5。4.根据权利要求2所述的抗菌涂层，其特征在于，所述有氧条件为暴露在空气中。5.根据权利要求2所述的抗菌涂层，其特征在于，所述儿茶酚胺为去甲基肾上腺素，所述金属离子为zncl2。6.根据权利要求5所述的抗菌涂层，其特征在于，所述所述去甲基肾上腺素浓度为1-5mg/ml，所述杆菌肽的浓度为0.12-1mg/ml，所述zncl2的浓度为0.5-2mg/ml。7.根据权利要求6所述的抗菌涂层，其特征在于，所述去甲基肾上腺素浓度为3mg/ml，所述杆菌肽的浓度为0.25mg/ml，所述zncl2的浓度为1mg/ml。8.权利要求1-7所述的抗菌涂层作为介入性医疗器械表面改性的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述介入性医疗器械为牙种植体。

技术总结
本发明公开了一种抗菌涂层及其应用，涉及牙种植体表面改性的技术领域，尤其是一种抗菌涂层，所述抗菌涂层的制备方法为：在Tris溶液、在常温、有氧条件下，将溶解的儿茶酚胺、杆菌肽、金属离子的混合物在钛片上反应24h，后超声清洗表面沉淀，吹干，制得抗菌涂层。所述抗菌涂层对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性能，抑菌率达到72％，同时所述抗菌涂层对人体没有毒性，具有良好的生物相容性。具有良好的生物相容性。具有良好的生物相容性。


技术研发人员：李向阳 牛维睿 陈佳龙 邱华 王延凯 李媛
受保护的技术使用者：安徽医科大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/10/8