调节SRC-1凝聚体的方法与流程

调节src-1凝聚体的方法
技术领域
1.本发明主要涉及一种方法，即通过调节src-1凝聚体以调节一个或多个基因的转录，以及筛选调节src-1凝聚体的试剂的方法。


背景技术：

2.yes-associated protein(yap)是一个转录共激活因子，在促进细胞增殖、发育和干细胞命运中起着重要作用(meng,z.,et al.,genes.dev.30,1-17(2016))。yap激活异常在多种人类实体瘤中普遍存在(harvey,k.f.,et al.,nat.rev.cancer 13,246-257(2013))。在哺乳动物经典hippo通路中，包含mst1/2和lats1/2磷酸化yap的激酶级联反应，抑制yap转运入核，阻止tea结构域转录因子(如tead1-4)与其结合。以往的研究重点放在调节yap的hippo激酶级联的上游信号上(halder,g.,et al.,nat.rev.mol.cell biol.13,591-600(2012))，然而，对yap转录活性的表观遗传调节机制了解甚少。
3.p160家族的类固醇受体共激活因子src-1被称为核激素受体的转录共激活因子，以及许多其他转录因子(onate,s.a.,et al.,science 270,1354-1357(1995),lonard,d.m.&o’malley,b.w.mol.cell 27,691-700(2007),york,b.&o’malley,b.w..j.biol.chem.285,38743-38750(2010))。越来越多的证据表明，基因调节发生在转录凝聚体中，这些凝聚体聚集了转录因子、共激活因子、转录和延伸机制，以实现空间和时间上的转录控制(hnisz,d.,et al.,cell 169,13-23(2017),alberti,s.,et al.,cell 176,419-434(2019),lee,t.i.&young,r.a.cell 152,1237-1251(2013))。因此，有必要探索yap/tead和src-1在转录调节中的作用，以开发治疗癌症的新策略。


技术实现要素：

4.在本发明中，术语“一个”，“所述”等表示数量为一或一以上(即至少为一个)的该冠词所属宾语。举例而言，“一个抗体”表示一个抗体或者一个以上的抗体。
5.一方面，本文提供了一种在细胞或对象(subject)中调节一个或多个基因转录的方法，包括调节至少包含src-1的src-1转录凝聚体(transcriptional src-1condensate)，其中所述src-1转录凝聚体调节所述一个或多个基因的转录。
6.在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与src-1相互作用的第一组分。
7.在某些实施方式中，第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。
8.在某些实施方式中，所述src-1转录凝聚体进一步包括能够与第一组分相互作用的第二组分。
9.在某些实施方式中，第二组分包括tea结构域转录因子。
10.在某些实施方式中，tea结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。
11.在某些实施方式中，src-1转录凝聚体还包括rna聚合酶。
12.在某些实施方式中，通过调节或减少src-1转录凝聚体的形成、组成、稳定性和/或活性来调节src-1转录凝聚体。
13.在某些实施方式中，通过与src-1凝聚体抑制剂接触来调节src-1转录凝聚体。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂减少了src-1转录凝聚体的形成、组成、稳定性或其活性。
14.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂能：
15.a)减少src-1凝聚体的形成或稳定性，
16.b)减少或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分之间的相互作用，任选地以src-1选择性的方式，
17.c)降低或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分的结合，任选地以src-1选择性的方式，或
18.d)将src-1隔离在转录凝聚体之外。
19.在某些实施方式中，一种或多种组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。
20.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂与src-1的内在无序结构域相互作用。
21.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂与src-1的非idd区域结合，并任选地在idd中以别构方式诱发构象变化。
22.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂将src-1隔离在转录凝聚体之外，任选地，所述隔离不显著分解不含src-1的转录凝聚体。
23.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂包括肽、核酸或小分子。
24.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂以不超过20μm的浓度降低转录的src-1凝聚体的水平至少30％(例如至少40％，50％，60％或70％)。
25.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂包括埃替拉韦(evg)，或与evg竞争结合src-1，或者诱导src-1的构象变化，所述构象变化至少与evg诱导的构象变化相当。
26.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂在降低src-1转录凝聚体水平方面具有与evg相当的活性或更高的活性。
27.在某些实施方式中，所述一个或多个基因的转录与一个致癌信号通路相关联。
28.在某些实施方式中，所述一个或多个基因包括一个或多个癌基因。
29.在某些实施方式中，所述一个或多个基因包括一个或多个yap靶基因。
30.在某些实施方式中，一个或多个yap靶基因选自ankrd1,ctgf和cyr61。
31.在某些实施方式中，该细胞或对象的src-1表达水平高于参考水平。
32.另一方面，本发明提供了一种调节细胞或对象中一个或多个yap靶基因转录的方法，包括通过src-1抑制剂调节src-1。
33.在某些实施方式中，所述src-1抑制剂能够降低src-1的表达水平或降低其生物活性，或所述src-1抑制剂是src-1凝聚体抑制剂。
34.在某些实施方式中，所述src-1抑制剂包括肽、核酸或小分子。
35.在某些实施方式中，核酸包括能与src-1mrna特异性杂交的寡核苷酸，或者编码该寡核苷酸的多核苷酸。
36.在某些实施方式中，寡核苷酸包括sirna、shrna、mirna或反义寡核苷酸。
37.在某些实施方式中，src-1抑制剂是src-1类似物。
38.在某些实施方式中，一个或多个yap靶基因选自ankrd1,ctgf和cyr61。
39.在某些实施方式中，该细胞或对象的src-1表达水平高于参考水平。
40.另一方面，本发明提供了一种治疗对象的与src-1凝聚体相关的疾病或病症或者与yap相关的疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用具有药学上有效量的src-1抑制剂。
41.在某些实施方式中，该疾病或病症表现为src-1的表达水平高于参考水平。
42.在某些实施方式中，该疾病或病症与癌基因的异常表达相关。
43.在某些实施方式中，该疾病或病症与yap靶基因的异常表达相关。
44.在某些实施方式中，该疾病或病症与yap的转录活性异常相关。
45.在某些实施方式中，所述疾病或病症是癌症。
46.在某些实施方式中，所述癌症是转移性的。
47.在某些实施方式中，癌症可以是乳腺癌、肺癌、肾上腺癌、淋巴上皮肿瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听觉神经瘤、急性淋巴细胞白血病、表浅黑素瘤、急性髓系白血病、腺样汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸性白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞性白血病、malt淋巴瘤、急性单核细胞性白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性周围神经鞘瘤、曼托细胞淋巴瘤、腺癌、边缘区b细胞淋巴瘤、恶性海马瘤、腺样囊性癌、腺瘤、类腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、髓样甲状腺癌、成人t细胞白血病/淋巴瘤、髓母细胞瘤，浸润性nk细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺横纹肌肉瘤、默克细胞癌、齿槽软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、转移性膀胱上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合黏液性肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、真菌性蕈样肉芽肿、星形胶质细胞瘤、黏液样脂肪肉瘤、非典型畸形的横纹肌肉瘤、黏液瘤、b细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、b细胞淋巴母细胞性白血病、鼻咽癌、b细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤病、膀胱癌、神经瘤、肉瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、brenner瘤、少突胶质瘤、棕色瘤、少突胶质细胞瘤、伯基特淋巴瘤、嗜酸性乳腺癌、脑癌、视神经肿瘤癌、口腔癌原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺沟肿瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果体细胞肿瘤、绒毛膜癌、垂体腺瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体腺瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、多发性胚胎细胞瘤、宫颈癌、前体t淋巴母细胞淋巴瘤、结肠直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、degos病、原发性浆液性淋巴瘤、增殖性小圆细胞瘤、原发性腹腔浆液瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、前列腺癌、神经上皮肿瘤的胚胎性畸形、胰腺癌、未分化细胞性肿瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假黏液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、肠病相关t细胞淋巴瘤、内胚层窦肿瘤、肾髓质癌、视网膜母细胞瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、体内联胎畸胎、横纹肌肉瘤、子宫肌瘤、里希变性、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、塞尔托里细胞瘤、生殖细胞瘤、性索-生殖间质肿瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞纤维母细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞
瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、脑胶质瘤、生长抑素瘤、脑胶质瘤、煤尘疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘淋巴瘤、颗粒性细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、塞萨病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈部癌、t细胞性淋巴瘤、血管上皮瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、肉瘤、肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾型t细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、尿囊癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌症、肠癌、膀胱上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性类似雀斑的痰、疣状癌、致命性中线肉芽肿、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特龙巴赫浓度异常症、腺样淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤、淋巴管肉瘤。
48.在某些实施方式中，癌症是乳腺癌，肺癌(任选是非小细胞肺癌)，葡萄膜黑色素瘤，肝癌，头颈癌和鳞状细胞癌，间皮瘤或恶性胸膜间皮瘤。
49.在某些实施方式中，src-1抑制剂能够降低src-1的表达水平或降低其生物活性。
50.在某些实施方式中，所述src-1抑制剂包括肽、核酸或小分子。
51.在某些实施方式中，核酸包括能与src-1mrna特异性杂交的寡核苷酸，或者编码该寡核苷酸的多核苷酸。
52.在某些实施方式中，所述寡核苷酸包括sirna、shrna、mirna或反义寡核苷酸。
53.在某些实施方式中，所述src-1抑制剂是src-1类似物。
54.在某些实施方式中，所述src-1抑制剂包括src-1凝聚体抑制剂。
55.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂能：
56.a)减少src-1凝聚体的形成或稳定性，
57.b)减少或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分之间的相互作用，任选地以src-1选择性的方式，
58.c)降低或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分的结合，任选地以src-1选择性的方式，或
59.d)将src-1隔离在所述转录凝聚体之外。
60.在某些实施方式中，所述一种或多种组分包含yap。
61.在某些实施方式中，所述src-1凝聚体抑制剂与src-1的内在无序结构域相互作用。
62.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂与src-1的非idd区域结合，并任选地在idd中以别构方式诱发构象变化。
63.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂可将src-1隔离在转录凝聚体之外，任选地，所述隔离不显著影响不含src-1的转录凝聚体。
64.在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂以不超过20μm的浓度降低转录的src-1凝聚体的水平至少30％(例如至少40％，50％，60％或70％)。
65.在某些实施方式中，所述src-1抑制剂包括埃替拉韦(evg)，或与evg竞争与src-1的结合，或者诱导至少与evg诱导的构象变化相当的src-1的构象变化。
66.在某些实施方式中，所述src-1凝聚体抑制剂在降低src-1转录凝聚体水平方面具有与evg相当的活性或更高的活性。
67.另一方面，本发明公开提供了一种筛选试剂的方法，所述试剂调节src-1凝聚体，
包括：
68.a)提供src-1凝聚体，并评估凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应，
69.b)使用测试试剂接触src-1凝聚体，和
70.c)评估测试试剂是否会对src-1凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应造成变化。
71.在某些实施方式中，如果测试试剂导致src-1凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应发生变化，则所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚体。
72.另一方面，本发明提供了一种鉴定试剂的方法，所述试剂调节src-1凝聚体的形成，所述方法包括：
73.a.提供能形成src-1凝聚体的组分；
74.b.在适于形成src-1凝聚体的条件下，使测试试剂与所述组分接触，和
75.c.评估测试试剂的存在是否影响src-1凝聚体的形成或src-1凝聚体的一个或多个生物学效应。
76.在某些实施方式中，如果测试试剂影响了凝聚体的形成或者影响了src-1凝聚体的一个或多个生物学效应，那么测试试剂被鉴定为能调节凝聚体的形成。
77.在某些实施方式中，src-1凝聚体是分离的合成凝聚体，或者是包含src-1凝聚体的分离的细胞组合物的形式。
78.在某些实施方式中，src-1凝聚体位于细胞内或细胞核内。
79.在某些实施方式中，src-1凝聚体是一种转录凝聚体。
80.在某些实施中，通过以凝聚体依赖的方式基于靶基因的表达来评估转录凝聚体的一个或多个生物学效应。
81.在某些实施方式中，所述靶基因是报告基因。
82.在某些实施方式中，所述靶基因是yap调节基因。
83.在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与src-1相互作用的第一组分。
84.在某些实施方式中，第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。
85.在某些实施方式中，所述src-1转录凝聚体进一步包括能够与第一组分相互作用的第二组分。
86.在某些实施方式中，第二组分包括tea结构域转录因子。
87.在某些实施方式中，tea结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。
88.在某些实施方式中，所述转录凝聚体还包括rna聚合酶。
89.另一方面，本发明提供了一种合成的src-1凝聚体，其至少包含src-1或其包括src-1的内在无序结构域的片段。
90.在某些实施方式中，所述片段与诱导性寡聚结构域融合。
91.另一方面，本发明还提供了一种体外筛选系统，该系统包括src-1或其含有src-1的内在无序结构域的src-1片段，和可检测标签，其中，所述src-1或其片段能够形成src-1
凝聚体。
92.在某些实施方式中，可检测标签附接于src-1或其片段。
93.在某些实施方式中，可检测标签包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
94.在某些实施方式中，所述体外筛选系统还包括能够与src-1相互作用的第一组分。
95.在某些实施方式中，第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。
96.在某些实施方式中，所述src-1转录凝聚体进一步包括能够与第一组分相互作用的第二组分。
97.在某些实施方式中，第二组分包括tea结构域转录因子。
98.在某些实施方式中，tea结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。
99.在某些实施方式中，体外筛选系统还包括rna聚合酶。
100.在某些实施方式中，体外筛选系统还包括细胞裂解物或细胞核裂解物。
101.另一方面，本发明提供一种表达src-1或其包括内在无序结构域的片段的修饰的宿主细胞，其中src-1或片段能够形成src-1凝聚体，该宿主细胞还包括用于检测src-1凝聚体的可检测标签。
102.在某些实施方式中，所述可检测标签附接于src-1或其片段。
103.在某些实施方式中，所述可检测标签包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
104.在某些实施方式中，所述修饰的宿主细胞还包含yap响应性的报告构建物。
105.在某些实施方式中，src-1响应的报告基因构建物包括报告基因，所述报告基因可操作地连接对yap活性产生响应的启动子。
106.在某些实施方式中，宿主细胞是肿瘤细胞。
107.另一方面，本发明提供了一种修饰的宿主细胞，其表达：a)src-1或其包括内在无序结构域的片段；和b)yap或其功能等效物，其中宿主细胞包含yap响应性的报告构建物。
108.在某些实施方式中，yap响应的报告构建物包括报告基因，所述报告基因可操作地连接对yap活性产生响应的启动子。
109.另一方面，本发明公开提供了一种筛选试剂方法，所述试剂抑制src-1，所述方法包括：
110.a.在适合表达报告基因的条件下，将测试试剂与本文提供的修饰的宿主细胞接触；
111.b.评估所述报告基因响应测试试剂的表达变化；
112.其中，所述报告基因的表达改变表明src-1受到抑制。
附图说明
113.附图作为本说明书的一部分纳入其中。附图与说明书一起还用于解释所公开的实施方式的原理并能够使相关领域的技术人员实施和利用所公开的实施方式。
114.图1a显示从癌细胞系百科全书数据库(ccle)分析的各种癌细胞系中，yap mrna水
平与yap拷贝数之间的相关性。
115.图1b显示在所示的细胞系中，yap和taz的蛋白质丰度。
116.图1c展示了使用sirna文库对sf268细胞中的ctgf进行qpcr分析，其中sirna文库包含针对15种已知的靶向hat的两条sirna。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝3)。*p《0.05。**p《0.01。
117.图1d显示使用比较src-1敲低(sirnapool)和对照组细胞的特征绘制的gsea富集图，显示与yap靶基因对应的基因集的负富集。
118.图2a显示在活细胞成像中展示了tead4-mtagbfp(蓝色)凝聚体、mclover3-yap(绿色)凝聚体和mscarlet-src1(红色)凝聚体在细胞核中的共定位。这三种蛋白质在细胞核中都呈现出离散的点状分布，并在这些点上有明显的共定位。比例尺，5μm。
119.图2b-d展示了与tead4-mtagbfp(蓝色)、mclover3-yap(绿色)和mscarlet-src-1(红色)共表达的sf268细胞中frap实验的代表性图像。箭头指示光漂白区域。漂白后，液滴呈现出新月状。随着时间的推移，液滴逐渐重组并恢复到原始状态。图2b显示使用561nm激光光束对mscarlet-src1进行了漂白处理。图2c显示使用405nm激光光束对tead4-mtagbfp(蓝色)进行了漂白处理。图2d显示使用488nm激光光束对mclover3-yap(绿色)进行了漂白处理。
120.图2e说明了src-1的结构域结构和内在无序的趋势。pondr(predictor of natural disordered regions)数据库vsl2将序列的无序趋势分配了0到1的分数(分数大于0.5为无序)。
121.图2f展示了src-1液滴融合事件。比例尺，10μm。试验重复三次，结果相似。
122.图2g展示了sf268细胞中mscarlet-src1(红色)的frap实验的代表性图像。箭头指示光漂白区域。漂白后，红色点状物消失。随着时间的推移，点状物逐渐重组，并恢复到了原始状态。比例尺，5μm。
123.图2h展示了在sf268细胞中mscarlet-src1(红色)的融合事件。箭头指示融合区域。随着时间的流逝，两个液滴越来越接近，彼此碰触并融合成更大的液滴。比例尺，5μm。
124.图2i图示了使用抗-rna聚合酶ii-s5p(绿色，上部)和抗-h3k27ac(绿色，下部)染色后共表达yap5sa、tead4-mtagbfp(蓝色)和mscarlet-src1(红色)的h1299细胞。转录活化标记物h3k27ac和ctd的ser 5位磷酸化的活性rna聚合酶ii富集在src-1共占领的yap/tead凝聚体中。比例尺，5μm。
125.图3a在sf268细胞中内源性yap与src-1抗体免疫共沉淀。
126.图3b为在sf268细胞中内源性src-1与tead4抗体免疫共沉淀。
127.图3c图示了flag-src-1突变体(n/m/c截短)的示意图。
128.图3d图示293ft细胞转染yap、tead4和flag-src-1突变体(n/m/c截短)。通过蛋白质印迹(western blot)分析细胞裂解物和全细胞裂解物中的flag免疫沉淀。
129.图3e展示了yap(sf268细胞)和src1(k562和ly2细胞)在tead1、tead4、lats2和fzd1启动子处的chip(染色质免疫沉淀)富集情况。比例尺代表2kb。
130.图3f图示了在sf268和k562细胞中，yap、tead和src-1在axl、cyr61、fzd1和atad2基因启动子上的基因组占据位点分布视图。
131.图3g用热图展示了在全基因组内位于启动子或增强子区域的tead2/src-1共同占
据的峰值。
132.图3h所示在k562细胞中，通过chip-seq方法绘制的src-1和tead2靶基因的韦恩图，该图展示了二者的重叠部分。
133.图3i说明了yap和src-1在yap靶区域(#1、#2和#3)或对照区域上的占位情况。数据代表了2个独立实验。误差棒代表s.e.m。
134.图4a展示了sf268细胞中tead4-mtagbfp(蓝色)和mscarlet-src1(红色，上方)以及er-megfp(绿色)和mscarlet-src1(红色，下方)的定位的活细胞成像。分析皮尔逊相关系数(pcc)，右侧显示合并图像中两种蛋白质沿白线的荧光强度。er和yap均被发现与src-1斑点共定位。
135.图4b展示了sf268(上)和mcf7(下)细胞中tead4-mtagbfp(蓝色)、mscarlet-src1(红色)和er-megfp(绿色)的分布情况。右图为sf268和mcf7细胞中src1-tead4和src1-er之间的pcc比较结果。在yap驱动的sf268细胞中，src-1大部分和yap凝聚体共占据，而在er阳性mcf7细胞中分布于er凝聚体。
136.图4c展示了共转染tead4-mtagbfp(蓝色)、mscarlet-src1(红色)和er-megfp(绿色)的h1299细胞的活细胞成像，有或无yap(5sa)和e2处理。右侧显示了描绘e2和yap(5sa)条件下tead/yap，er和src-1定位的卡通图。融合图中白线为mscarlet-src1，er-megfp和tead4-mtagbfp荧光强度的量化。在不同细胞环境下，src-1可以在yap和er转录凝聚体之间发生相互作用。
137.图5a显示，在肺、肝脏、胃、结肠、乳腺和食管组织样本中，通过免疫组化确定代表性src-1蛋白水平。
138.图5b展示了通过ihc确定的src-1蛋白在乳腺和肺样品中分布的代表图。
139.图5c为根据src-1表达分层的患者的kaplan-meier图。
140.图5d显示转染有靶向src-1的sirna和对照sirna的a549/h1299/h661肺癌细胞的增殖。sictrl n＝3/sisrc1 n＝9。
141.图5e显示将稳定表达dox诱导型src-1shrna的h1299细胞接种到裸鼠体内。小鼠分别用载剂或补充有dox的饮用水处理，并以平均值
±
s.e.m.(n＝10)绘制肿瘤体积。*p《0.05；***p《0.001。
142.图5f说明了未经dox处理的dox诱导型h1299-tet-on-shrna-src1细胞的迁移能力。通过免疫印迹法检测了两种shrna的敲低效率，并使用雷达图记录了每个细胞的轨迹。展示了未经dox处理的细胞速度和定向性(d/d)的统计结果。
143.图5g显示使用稳定表达dox诱导型src-1shrna的h1299细胞进行的微流体实验。在fbs浓度梯度下，接种在一侧的细胞可以穿透基质凝胶并迁移到另一侧。
144.图5h显示使用稳定表达dox诱导型src-1shrna的h1299细胞的穿透孔(transwell)实验。显示穿透孔底部的结晶紫染色结果。
145.图5i为未经dox处理的稳定表达dox诱导型src-1shrna的h1299细胞中的集落形成实验。
146.图6a显示，通过ihc，研究了120个nsclc样品中src-1和yap蛋白的表达水平，并分析了两种蛋白水平之间的相关性。
147.图6b显示，通过ihc，120个nsclc样品中src-1和yap蛋白水平的代表性图示。
148.图6c展示了src-1和yap表现出相似的分布模式的代表图。
149.图6d展示了转染载剂、yap和/或src-1表达质粒的beas-2b细胞的集落形成实验。显示图像中的集落数量化结果。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝4)，*p《0.05。
150.图6e为转染了yap和/或src-1表达质粒的beas-2b集落的放大图像。比例尺，100μm。
151.图6f是时间序列图像，显示过表达yap或yap和src-1的beas-2b细胞的集落。比例尺，100μm。
152.图6g为第30天过表达yap和src-1的beas-2b细胞的显微图像。红箭头指示着集落之间的桥接连接。比例尺，100μm。
153.图7a的活细胞成像显示，在未使用20μm evg处理的条件下，转染了yap5sa质粒的h1299细胞中，tead4-mtagbfp(蓝色)和mneogreen-src1(绿色)在核内的分布情况。右侧合并图像中，沿着线显示tead4-mtagbfp和mneogreen-src1的荧光强度量。使用依赖于yap的tead凝聚体表征yap/tead转录凝聚体。src-1与yap/tead转录凝聚体共占位。evg处理后，src1相分离被打破，而yap/tead凝聚体保持完整。比例尺，5μm。
154.图7b展示了高通量筛选的结果。对449种fda批准的化合物进行了由细胞存活度和荧光素酶活性的z因子的筛选和评估(蓝点：筛选化合物；红点：阳性化合物)。筛选标准是荧光素酶z-因子＜-4，细胞存活率＞-4。(阳性化合物，pc:fedratinib)
155.图7c显示使用qpcr分析yap靶向ctgf和cyr61的表达来验证筛选出的候选阳性化合物。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝2)。
156.图7d展示了在dmso或20μm evg处理24小时后，sf268细胞中yap靶基因的qpcr分析结果。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝3)。
157.图7e显示对使用evg处理的sf268细胞进行rna-seq分析。涉及hippo/yap信号传导的基因的gsea富集图。
158.图7f为在指定时间内，用20μm埃替拉韦(evg)或20μm菲卓替尼(fedratinib，pc)处理sf268细胞，并进行蛋白质印迹。
159.图7g显示，通过yap phostag免疫印迹法检测用evg或pc(fedratinib，一种非受体酪氨酸激酶jak2的抑制剂，影响yap的核转位和磷酸化)处理的sf268细胞。
160.图7h为使用抗-yap抗体和dapi，对dmso、evg或pc(阳性化合物)处理的a549细胞进行染色。在pc处理后，yap从细胞核转移到细胞质中，而用evg处理的仍停留在细胞核中。比例尺，40μm。
161.图7i展示了在lats1/2双敲低细胞中，经过dmso或evg处理的ctgf和cyr61的qpcr分析结果。使用免疫印迹法评估了lats1/2的敲低效率。
162.图7j显示，通过chip-qpcr分析了dmso或埃替拉韦处理的细胞中yap与yap靶点区域(#1:ankrd1增强子，#2:pawr启动子，#3:nppb启动子，#4:ctgf启动子)的关联。数据代表了3次独立实验。误差棒表示三次qpcr数据的标准误差(s.e.m.)。
163.图7k显示，在使用evg或dmso处理的sf268细胞中，通过chip-qpcr分析yap与yap靶点区域的关联。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝3)。
164.图7l显示，通过chip-qpcr分析在使用dmso或evg处理的sf268细胞中yap靶区域#1上的指示的组蛋白修饰。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝3)，*p《0.05,***p《0.001。
165.图7m用20μm evg处理的共表达yap5sa、tead4-mtagbfp(蓝色)和mneogreen-src1(绿色)的h1299细胞中，使用抗-h3k27ac(红色，上)和抗rna聚合酶ii-s5p(红色，下)进行免疫荧光染色。evg削弱了src-1的llps。转录活性标记物h3k27ac和ctd的ser5磷酸化的活性rna聚合酶ii在src-1凝聚体中没有富集。比例尺，5μm。
166.图7n显示，在存在不断增加的evg浓度下，纯化的flag-src-1蛋白与yap和/或tead4混合，并经过三次独立的抗flag珠下拉实验。
167.图7o展示了在evg处理下，mneogreen-src1(绿色)凝聚体的活细胞成像时间过程。evg以时间依赖性方式削弱了src-1的llps。比例尺，5μm。
168.图7p为用evg处理的mscarlet-src1斑点的活细胞成像。evg以时间依赖性方式削弱了src-1的llps。比例尺，10μm。
169.图7q显示了在未经20μm evg处理的h1299细胞中，mscarlet-src-1斑点的高含量图像数据的量化结果。***p《0.001。
170.图7r为使用纯化的src-1蛋白和evg进行生物膜干涉(bli)实验。使用生物素标记的evg被固定在链霉亲和素生物传感器上，然后浸入含有不断增加浓度的src-1蛋白的孔中。
171.图7s展示了生物素-evg的结构。
172.图7t显示，将过表达flag-src-1的sf268细胞裂解物与20μm生物素或生物素-evg一起孵育，用于链霉亲和素珠联吸附实验。
173.图7u显示，通过蛋白质纯化方法，将flag-src1蛋白与evg-生物素一起孵育，在不断增加的evg浓度下进行链霉亲和素珠联吸附实验。
174.图7v为埃替拉韦治疗对细胞增殖(肺癌细胞和正常细胞)的影响。误差棒显示平均值
±
s.e.m.(n＝3)。
175.图7w展示了evg在src1敲低和对照细胞中的抗增殖作用。数据代表平均值
±
s.e.m(n＝3)。
176.图7x为未经evg处理的过表达yap和src-1的beas-2b细胞集落。
177.图7y为src-1和yap/tead共占据的转录凝聚体的示意图。(左侧)src-1参与yap和tead凝聚体，促进yap靶基因的表达。h3k27ac和rna聚合酶ii-s5p的共定位表明src-1共占据的yap/tead斑点的转录活跃。(右侧)evg可以通过破坏src-1/yap/tead转录凝聚体中的src1相分离来拮抗yap活性，但对yap/tead的llps无影响。在evg处理下，h3k27ac在tead凝聚体中未被富集，而聚合酶ii-s5p保持不变。
具体实施方式
178.以下描述仅为说明本文的各种实施方式。因此，在此讨论的具体变化等不应被解释为对本文公开范围的限制。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文公开范围的情况下，可以得出各种等同形式、改变和修改，应当明白，这样的等同实施方式均包括在本文范围之内。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，都通过引用全文方式纳入本文。
179.定义
180.如本文所用，用于本发明上下文的术语“一个”、“一种”、“所述”以及类似表达(尤
其在权利要求书的内容中)应解释为涵盖单数和复数，除非另有说明或者与上下文明显矛盾。
181.本文所用术语“试剂”指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。所述“试剂”可以是任何化学、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白质和非蛋白质实体。在某些实施方式中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适配体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、dna酶、糖蛋白、sirna、脂蛋白、适配体及其修饰和组合等。在某些实施方式中，试剂选自核酸、小分子、多肽和肽。在具体实施方式中，试剂是有化学基团的小分子。在某些实施方式中，试剂足够小以扩散到凝聚物中。在某些实施方式中，试剂约小于4.4kda。
182.本文使用的术语“小分子”是指化学分子，不是肽或核酸的化合物。在某些实施方式中，小分子的质量可能约小于2kda。在某些实施方式中，小分子约小于1.5kda，或约小于1kda。在某些实施方式中，小分子约小于800da，600da,500da,400da,300da,200da,或100da。通常，小分子的质量至少为50da。在某些实施方式中，小分子是非聚合的。
183.术语“增加”、“上调”或“增强”可以是统计上显著量的增加或增强。在某些情况下，例如，与参考水平(例如对照)相比，元素可以增加或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％，并且这些范围应理解为包括其中的任何整数量(例如，2％、14％、28％等)，为简洁起见，未详尽列出。在其他情况下，与参考水平相比，元素可以增加或增强至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更多。
184.术语“减少”、“抑制”、“下调”可以是相对于参考(例如对照)减少或降低统计学上显著的量。在某些情况下，与参考水平相比，元素可以减少或降低至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、直至例如完全不包括所述元素。这些范围应理解为包括其中的任何整数量(例如，6％、18％、26％等)，为简洁起见，未详尽列出。
185.术语“多核苷酸”或“核酸”或“寡核苷酸”可互换使用，并且是指共价连接的核苷酸链。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并且彼此独立地修饰或未修饰。多核苷酸可以是单链或双链。
186.术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。蛋白质或多肽可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域技术人员将进一步理解，蛋白质有时可包括多于一条的多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式连接。
187.本文使用的术语“片段”是指任何长度的参考多肽或多核苷酸的部分序列。片段仍可保留参考多肽的至少部分生物活性。
188.术语“变体”是指相对于天然存在的多肽具有一个或多个氨基酸残基改变或修饰的多肽。
189.本文使用的“功能等效物”是指天然存在多肽(例如src-1或yap)的片段、变体或融合多肽，尽管其化学结构存在差异，但至少仍保留天然存在多肽的部分生物学功能。在某些实施方式中，功能等效物仍保留至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,
97％,98％,99％或100％的天然存在多肽的生物学活性。
190.本文中使用的术语“同源物”和“同源的”是可互换的，并且是指指进行最佳比对时与另一序列同一性至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
191.氨基酸序列(或核酸序列)的“百分比(％)序列同一性”定义为将序列对齐并根据需要引入空位以实现相同氨基酸(或核酸)数量最大化后，候选序列中氨基酸(或核酸)残基与参考序列中氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。氨基酸残基的保守取代可以被认为是相同的残基，也可以是不同的残基。可以通过例如使用公开可用的工具如blastn、blastp(可见于美国国家生物技术信息中心(ncbi)网站，也参见，altschul s.f.等，j.mol.biol.，215：403-410(1990)；stephen f.等人，nucleic acids res.，25：3389-3402(1997))，clustalw2(可见于欧洲生物信息研究所)网站，还参见higgins d.g.等，methods in enzymology,266:383-402(1996)；larkin m.a.等，bioinformatics(oxford,england),23(21):2947-8(2007))，以及align或megalign(dnastar)软件实现确认氨基酸(或核酸)序列的百分比同一性。本领域技术人员可以使用工具提供的默认参数，或者可以定制适合于比对的参数，例如通过选择合适的算法。
[0192]“分离”的物质经人工操作从自然状态改变了。如果自然界中存在“分离”的成分或物质，则它已被改变或从其原始环境中移除，或两者兼而有之。例如，天然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果相同的多核苷酸或多肽已与其天然状态的共存材料充分分离从而以基本上纯净的状态存在，则所述多核苷酸或多肽是“分离的”。
[0193]
本文使用的短语“宿主细胞”是指已引入外源多核苷酸和/或表达载体的细胞。
[0194]
本文所用的病症的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻病症、减缓病症的发作或发展速度、降低发展病症的风险、预防或延迟与病症相关的症状的发展、减少或结束与病症相关的症状、产生病症的完全或部分消退、治愈病症或其某种组合。
[0195]
术语“肿瘤”或“癌症”可互换使用，是指涉及异常细胞生长的任何疾病，并且包括影响体内任何组织、器官或细胞的疾病的所有阶段和所有形式。该术语包括所有已知的癌症和肿瘤病症，无论其特征为恶性、良性、软组织、实体或血液学，还是所有阶段和级别，包括转移前和转移后的肿瘤。一般来说，癌症可以根据肿瘤所在或起源的组织或器官以及癌组织和细胞的形态进行分类。
[0196]
术语“癌基因”涵盖核酸，所述核酸表达时能增加癌症发生或进展的可能性或有助于癌症的发生或进展。正常细胞序列(“原癌基因”)可以通过突变和/或异常表达被激活成为癌基因。在各种实施方式中，癌基因可包含基因产物的完整编码序列或一部分，所述一部分至少部分维持完整序列或编码融合蛋白的序列的致癌潜力。致癌突变可导致例如蛋白质活性改变(例如增加)、适当调控的丧失或rna或蛋白质水平的改变(例如增加)。
[0197]
本文使用的术语“标签”包括但不限于可检测标签，例如荧光团、放射性同位素、比色底物或酶；异源表位(其特定抗体可商购)，例如flag标签；异源氨基酸序列(作为市售结合蛋白的配体)，例如strep标记、生物素；荧光猝灭剂(通常与其他多肽上的荧光标签结合使用)；以及互补的生物发光或荧光多肽片段。。可以直接测量作为可检测标记物或互补生物发光或荧光多肽片段的标签(例如，通过测量适当底物或酶的荧光或放射性，或与未结合的多肽相比，与适当底物或酶一起孵育以产生相关多肽的分光光度计可检测的颜色变化)。
作为异源表位或配体的标签通常用与其结合的第二组分(例如抗体或结合蛋白)来检测，其中第二组分与可检测标签结合。在某些实施方式中，可检测标签是荧光标签。在某些实施方式中，凝聚体组分和试剂都包含可检测标签。在某些实施方式中，所述组分与试剂包含不同的可检测标签。
[0198]
凝聚体和基因表达调节
[0199]
除了典型的膜结合细胞器外，真核细胞还含有许多无膜区室或凝聚体，它们浓缩了特定的蛋白质和核酸集合。本文所用的“凝聚体”是指一种或多种蛋白质和/或其他大分子(例如rna和/或dna)基于它们固有的物理性质的相分离(包括相分离的所有阶段)形成的非膜封装的区室。凝聚体表现为相分离液体，导致特定蛋白质和/或大分子浓缩在凝聚体内部，而其他特定蛋白质和/或大分子被排除在外。凝聚体是液体且可逆的。当细胞生理学发生变化时，例如信号传导事件或一种大分子浓度的变化或局部环境的其他变化，细胞内的凝聚体将发生变化，改变其物理性质(例如，形成、稳定性、组成、形态等)，从而调节与凝聚体相关的生物活性。
[0200]
新的证据表明，基因表达伴随着大簇转录复合物的募集，这些转录复合物通过相分离形成凝聚体。转录凝聚体集中了转录因子、共激活因子、用于空间和时间转录控制的转录和延伸机制(hnisz,d.et al,cell 169,13-23(2017),alberti,s.,et al,cell 176,419-434(2019).lee,t.i.&young,r.a.cell 152,1237-1251(2013))。本文使用的“转录凝聚体”是指发生在转录位点的相分离的多分子组装体，并且是多种成分的高密度协同组装，可包括转录因子、共激活剂、染色质调节剂、dna、非编码rna、新生rna和rna聚合酶、组蛋白等。转录凝聚体还可包含改变、读取或检测染色质组分的结构的酶(例如，写入、读取或擦除组蛋白标记的dna甲基化酶或脱甲基酶、组蛋白甲基化酶或脱甲基酶、或组蛋白乙酰化酶或脱乙酰化酶，例如h3k4mel或h3k27ac)。由于许多疾病是由其基因表达谱的改变而引起或与之相关，，因此调节转录凝聚体，从而改变凝聚体的转录输出，可能提供一种新的治疗干预。
[0201]
本发明发现转录共激活因子src-1参与yap靶基因的表达。src-1和yap共同促进癌症进展。此外，本发明发现src-1能够进行相分离以形成凝聚体。src-1凝聚体可以是包含另外的转录因子、共激活剂(例如，yap)等的转录凝聚体。转录src-1凝聚体占据与致癌信号通路相关的基因(例如yap靶基因)。src-1凝聚体的调节导致这些基因表达模式的变化。
[0202]
src-1凝聚体
[0203]
一方面，本文提供了一种在细胞或对象中调节一个或多个基因转录的方法，包括调节至少包含src-1的src-1转录凝聚体，其中src-1转录凝聚体调节一个或多个基因的转录。
[0204]
如本文所述，“src-1”或“类固醇受体辅激活剂-1”是指含有数个核受体相互作用结构域和内在组蛋白乙酰转移酶活性的转录辅激活剂。src-1也成为核受体辅激活因子1或ncoa1。src-1协助核受体上调dna表达。在通过配体激活的核受体招募到dna促进位点后，src-1酰化组蛋白，使下游dna更容易转录。如本文所述，src-1不仅指天然存在的src-1，而且还可以指其任何功能等效物。
[0205]
src-1包含三个不同的结构域，包括n末端的b-hlh-pas结构域，负责与转录因子和共激活子相互作用以激活基因转录，中间由3个lxxll基序组成的核受体(nr)相互作用结构域，用于结合并激活核受体，以及c末端的两个激活结构域ad1和ad2，负责招募额外的共激
活因子进行组蛋白修饰和染色质重塑，以增强基因转录。除了这些结构化结构域之外，src-1还包含遍布整个蛋白质的广泛的内在无序结构域(idd)。如本文所述，“内在无序结构域”或“idd”是指蛋白质中缺乏固定或有序二级和三级结构的区域。idd的范围可以从完全非结构化到部分结构化。在某些实施方式中，idd可以通过公开的方法来识别，所述方法记载于ali,m.,&ivarsson,y.(2018).高通量发现功能无序区域(high-throughput discovery of functional disordered regions).molecular systems biology,14(5),e8377。
[0206]
在某些实施方式中，idd具有单独的离散区域。在某些实施方式中，idd是至少约5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150或更多个无序氨基酸(例如，连续无序氨基酸)。在某些实施方式中，如果d2p2使用的算法中至少75％预测该残基是无序的，则该氨基酸被认为是无序氨基酸(oates et al.，2013，nucleic acids res.41，d508-16.)。
[0207]
在某些实施方式中，src-1经历相分离以形成凝聚体，其中src-1在体外和细胞内均高度浓缩。本文所述的src-1凝聚体是指至少包含src-1的凝聚体。src-1凝聚体可以是仅包含src-1的同型凝聚体，或者包含附加组分的异型凝聚体。在某些实施方式中，src-1凝聚体占据细胞中活性基因转录的位点。在某些实施方式中，src-1凝聚体是一种src-1转录凝聚体。
[0208]
在某些实施方式中，src-1凝聚体包含至少一个附加组分。凝聚体的“组分”是指在生理或病理条件下可与凝聚体凝聚或掺入其中的分子。在某些实施方式中，src-1凝聚体的组分是一种能够自行发生相分离的大分子。在某些实施方式中，src-1凝聚体的组分是大分子，其本身不能相分离，但通过与src-1相互作用达到局部高浓度。在某些实施方式中，src-1转录凝聚体内的组分通常是与src-1相互作用或结合的大分子，例如核受体、转录因子、转录共激活剂、组蛋白或rna聚合酶。在某些实施方式中，src-1转录凝聚体除src-1外还包含多种成分。本文所述的“转录因子”或tf，是通过结合特定dna序列从而调节转录的一种蛋白。tf通常包含dna结合域和激活域。在某些实施方式中，tf受信号传导因子调节(例如，转录通过tf与信号传导因子相互作用来调节)。本文所述的“转录共激活剂”是指与转录因子相互作用以刺激基因转录的蛋白质或蛋白质复合物。在某些实施方式中，转录因子是核受体。本文所述的“核受体”或nr是指进化相关的dna结合转录因子超家族的成员，其表现出由五至六个同源结构域组成的特征性模块结构(指定为a至f，来自n-端到c端末端)。nr的活性至少部分受到多种小分子配体与配体结合结构域中口袋的结合的调节。
[0209]
在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与src-1相互作用的第一组分。在某些实施方式中，第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。
[0210]
如本文所述，“yes相关蛋白”或“yap”(也称为yap1或yap65)是在促进细胞增殖、发育和干细胞命运中发挥重要作用的转录共激活因子。yap激活参与细胞增殖的基因转录并抑制凋亡基因。yap在hippo信号通路中受到抑制，该信号通路允许细胞控制器官大小和抑制肿瘤。在哺乳动物中，激酶级联反应包括mst1/2和lats1/2磷酸化yap，防止其核转运及其后续与tea结构域转录因子tead1-4(统称为tead)在经典的hippo通路中结合。yap与tead(或其他转录因子)一起诱导多种基因的表达，包括结缔组织生长因子(ctgf)、gli2、birc5、birc2、成纤维细胞生长因子1(fgf1)、含锚蛋白重复结构域的蛋白(ankrd)、富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61(cyr61)、tgb2、areg、foxf2、igfbp3、rassf2和双调蛋白。许多由yap激
活的基因介导细胞存活和增殖。因此yap作为癌基因。yap异常激活在多种人类实体瘤中普遍存在。
[0211]
本文所述的“雌激素受体”或er是指一组核受体，包括核雌激素受体er-α和er-β，其被雌激素激活。本文所述的“雄激素受体”或ar是指被雄激素激活的核受体的成员。一旦被雌激素或雄激素激活，er或ar能够在细胞核中易位并与dna结合以调节不同基因的激活。本文所述的“维生素d受体”或vdr是指被活性形式维生素d激活并在激活后与类视黄醇-x受体形成异二聚体的核受体成员。本文所述的“激活蛋白1”或ap-1是指响应于多种刺激(包括细胞因子、生长因子、应激以及细菌和病毒感染)调节基因表达的转录因子。ap-1通常是由属于c-fos、c-jun、atf和jdp家族的蛋白质组成的异二聚体。
[0212]
在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与第一组分相互作用的第二组分。在某些实施方式中，第一组分包含yap。在某些实施方式中，第二组分与yap相互作用。在某些实施方式中，第二组分包括tea结构域转录因子。在某些实施方式中，tea结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。
[0213]
本文所述的“tea域转录因子”或tead是指一组转录因子，其由tead1、tead2、tead3和tead4组成，充当hippo通路的最终核效应子，调节细胞生长、增殖和通过转录靶基因实现组织稳态。tead活性一直作为hippo-yap通路的功能读数。tead的每个家庭成员都有多个名字tead1(tef-1/ntef)、tead2(tef-4/etf)、tead3(tef-5/etfr-1)和tead4(tef-3/etfr-2/fr-19)。所有tead在n端共享高度保守的dna结合域，在c端共享用于与yap相互作用的反式激活域。
[0214]
在某些实施方式中，src-1转录凝聚体还包括rna聚合酶。在某些实施方式中，所述聚合酶是rna聚合酶ii。
[0215]
本文所述“rna聚合酶ii”或pol ii是指12个亚基的多蛋白复合物，其将dna转录成前mrna和大多数小核rna和微rna。pol ii需要多种转录因子才能与上游基因启动子结合并开始转录。rna聚合酶ii(pol ii)合成前mrna涉及转录起始复合物的形成和向延伸复合物的转变。pol ii的大亚基含有内在无序的c末端结构域(ctd)，在起始到延伸的转变过程中，该结构域被细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)磷酸化，从而影响ctd与起始不同成分的相互作用。
[0216]
在某些实施方式中，src-1转录凝聚体还包括一种组蛋白。真核转录受染色质结构调节，其改变是由保守的翻译后组蛋白尾部修饰介导的。组蛋白尾部修饰包括但不限于乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。组蛋白乙酰化通常由组蛋白乙酰转移酶(例如src-1)催化，该酶乙酰化组蛋白尾内的赖氨酸残基，减少组蛋白与dna的相互作用，从而将凝聚的染色质转化为更松弛的结构，以促进更高水平的基因转录。在某些实施方式中，组蛋白包括h3k27ac。
[0217]
在某些实施方式中，src-1转录凝聚体与一个或多个基因相关。这些基因通常是指特定基因，其基因座可以被细胞中的src-1凝聚体占据。src-1凝聚体对这些遗传位点的定位可能需要结构化的tf-dna相互作用(例如，由掺入src-1凝聚体的tead介导的相互作用)和/或idd介导的相互作用。在某些实施方式中，与src-1转录凝聚体相关的一个或多个基因是yap与tead共同靶向的基因(即，yap靶基因，参见下面的描述)。
[0218]
在某些实施方式中，与src-1转录凝聚体相关的一种或多种基因包含与致癌信号
传导途径相关的一种或多种基因。在某些实施方式中，一个或多个基因的转录与癌症等疾病的标志(hallmark)相关。在某些实施方式中，与src-1转录凝聚体相关的一种或多种基因包含一种或多种癌基因。示例性癌基因包括myc、src、fos、jun、myb、ras、abl、hoxi1、hoxi11l2、tal1/scl、lm01、lm02、egfr、mycn、mdm2、cdk4、gli1、igf2、活化的egfr、突变基因，例如flt3-itd、突变的tp53、pax3、pax7、bcr/abl、her2/neu、flt3r、flt6-itd、src、abl、tan1、ptc、b-raf、pml-rar-α、e2a-prx1和npm-alk，以及pax和fkhr基因家族成员的融合。其它示例性癌基因是本领域已知的。在某些实施方式中，癌基因选自c-myc和irf4。在某些实施方式中，基因编码致癌融合蛋白，例如mll重排、ews-fli、ets融合、brd4-nftt、negr98融合。
[0219]
src-1凝聚体调节
[0220]
src-1转录凝聚体可以调节与src-1凝聚体相关的一种或多种基因的转录。例如，基因转录的调节可以包括以下事件中的一个或多个：增加或减少基因转录的速率或频率，增加或减少基因转录的抑制，以及增加或减少mrna转录起始、mrna延伸或mrna剪接活性。
[0221]
在某些实施方式中，通过调节src-1转录凝聚体来调节一种或多种基因的转录。本文所述“调节”(及其动词形式，例如“调节”)意指引起或促进定性或定量的变化、改变或修改。但不限于此，这种改变可以是定性或定量方面的增加或减少。在某些实施方式中，通过调节或减少src-1转录凝聚体的形成、组成、稳定性和/或活性来调节src-1转录凝聚体。在某些实施方式中，调节凝聚体包括调节凝聚体的形成、组成、稳定性和/或活性中的一者、二者、三者、四者或全部五者。在某些实施方式中，调节凝聚体还包括调节凝聚体的形态或形状，和/或调节涉及一种或多种凝聚体相关组分的细胞信号传导级联。
[0222]
本文所述关于凝聚体的“形成”是指产生具有明确的物理边界但没有脂质膜屏障的凝聚的生物组装体。凝聚体的形成可以由相分离驱动，特别是驱动蛋白(例如，内在无序蛋白或包含能够在体外自行相分离的内在无序区域)的相分离。
[0223]
在某些实施方式中，src-1凝聚体的形成是由src-1的相分离驱动的。在某些实施方式中，干扰src-1相分离的能力破坏src-1凝聚体的形成。在某些实施方式中，src-1凝聚体的形成是由src-1凝聚体的非src-1组分相分离驱动。在某些实施方式中，src-1凝聚体的形成是由yap或tead驱动的。在某些实施方式中，调节src-1凝聚体的形成包括增加或减少形成速率或形成是否发生。
[0224]
如本文所述，“组合物”是指在凝聚体内相关的组分的集合。转录凝聚体通常包含多种组分，包括蛋白质和/或核酸。凝聚体的每个组分没有必要与驱动分相的组分相互作用。在某些实施方式中，除了src-1之外，src-1凝聚体还包含与src-1相互作用的第一组分(例如，yap)和与第一组分相互作用的第二组分(例如，tead)，其中第二个组分可能与src-1相互作用或不与src-1相互作用。
[0225]
在某些实施方式中，凝聚体的组成响应环境的变化或对凝聚体的刺激(例如，ph、蛋白质浓度、另外的微分子或大分子的添加等)而变化。当转录凝聚体中缺少单个组分时，它可能会变得无功能(即无法进行有效的转录)。此外，将新颖的组分合并到现有的凝聚体中可以改变、减弱或放大它们的输出。在某些实施方式中，调节凝聚体的组成包括增加或减少与凝聚体相关的组分的水平。
[0226]
在某些实施方式中，通过调节src-1或与转录凝聚体相关的组分(例如，如本文所
述的第一组分或第二组分)的量或水平来调节src-1转录凝聚体。在某些实施方式中，与转录凝聚体相关的组分或src-1的量或水平通过与降低或消除src-1水平的试剂接触来调节。该试剂不受限制并且可以是本文所述的任何试剂。
[0227]
本文所述的“稳定性”是指当平衡状态受到干扰时，凝聚体恢复其原始状态的性质。凝聚体的稳定性可以通过凝聚体的维持或分解(部分或完全)来反映。维持是指保持凝聚体的组成和物理性质。分解是指凝聚体部分或完全解体。在某些实施方式中，调节凝聚体的稳定性包括增加或降低凝聚体维持或的速率，或者促进或抑制凝聚体分解。
[0228]
如本文所述，“活性”是指src-1凝聚体在调节与src-1凝聚体相关的基因在转录中的活性。在某些实施方式中，凝聚体的活性与凝聚体的组成或稳定性相关。凝聚体的组成或稳定性的变化可能影响凝聚体的活性。在某些实施方式中，调节凝聚体活性包括改变凝聚体的转录活性。
[0229]
src-1凝聚体抑制剂
[0230]
在某些实施方式中，通过与src-1凝聚体抑制剂接触来调节src-1转录凝聚体。本文所述的“src-1凝聚体抑制剂”是指能够下调src-1凝聚体的水平或活性的试剂。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂扰乱、减少或抑制了src-1转录凝聚体的形成、组成、稳定性或其活性。
[0231]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂减少了src-1转录凝聚体的形成、组成或稳定性。例如，src-1凝聚体抑制剂可以破坏src-1凝聚体的形成或维持所需的相互作用，或者可以诱导src-1凝聚体的分解，或者诱导src-1隔离于src-1之外，或者可能导致src-1凝聚体中的组分发生变化，从而影响其稳定性或减少src-1凝聚体中的src-1。
[0232]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂任选地以src-1选择性方式减少或消除src-1与转录凝聚体中的一种或多种组分之间的相互作用。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂(任选地以src-1选择性方式)减少或消除src-1与转录凝聚体中的一种或多种组分的结合。在某些实施方式中，一种或多种组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。本文使用的“src-1选择性”方式是指src-1凝聚体抑制剂影响src-1依赖性相互作用或活性，但不显著影响凝聚体内src-1独立相互作用或活性。例如，src-1抑制剂可以抑制src-1本身和/或src-1与凝聚体的另一组分的相互作用，但不抑制凝聚体中除src-1之外的某些组分的任何相互作用，作为单个组分交互或除src-1之外的这些组分之间的交互。
[0233]
在某些实施方式中，src-1与转录凝聚体中的一种或多种组分之间的相互作用由src-1的idd介导。在某些实施方式中，src-1与转录凝聚体中的一种或多种成分之间的结合是由src-1的结构化结构域(例如，b-hlh-pas结构域、ad1、ad2或nr相互作用结构域)介导的。不受任何理论的束缚，相分离或凝聚体形成是由多价相互作用驱动的，或者涉及由结构化结构域介导的特异性、高亲和力相互作用，或者由idd介导的弱相互作用。.如本文所述，“化合价”是指组分的不同结合配对物的数量和与一种或多种结合配对物的结合强度。src-1包含结构化结构物域和广泛的idd，能够介导与多个配对物的多价相互作用。因此，调节由src-1的idd介导的相互作用或由src-1的结构化结构域介导的结合可以调节src-1转录凝聚体。在某些实施方式中，该调节降低src-1的化合价以便抑制或防止凝聚体形成。
[0234]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂与src-1的idd相互作用。在某些实施方式
中，src-1凝聚体抑制剂与src-1的非-idd域结合。在某些实施方式中，该抑制剂和与src-1凝聚体相关的组分竞争与src-1的结合或相互作用。例如，抑制剂可以取代与src-1相互作用或结合的组分，并抑制src-1凝聚体的形成。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂变构地诱导idd中的构象变化。变构作用的抑制剂可以与src-1中的区域结合或相互作用，并引起相互作用或结合区域外部或远端的构象变化。
[0235]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂将src-1隔离在转录凝聚体之外。例如，src-1凝聚体抑制剂可以与src-1结合并防止其掺入凝聚体中。又例如，可以通过添加合适的试剂(例如，外源添加的小分子、蛋白质、dna或rna)来诱导形成第二src-1凝聚体。通过限制对src-1的接近，将src-1隔离在转录凝聚体之外或隔离在第二src-1凝聚体中来调节src-1转录凝聚体。
[0236]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂隔离src-1，而不会显著分解含降低的src-1或不含src-1的转录凝聚体。在某些实施方式中，尽管存在src-1隔离，转录凝聚体仍然存在并且可以功能性调节转录活性，除了其具有降低的src-1依赖性转录活性或没有src-1依赖性转录活性。例如，转录凝聚体可以至少包含yap和tead(但不含或减少的src-1)，并且保留由yap和tead介导但不依赖于src-1的转录活性。凝聚体的此类转录活性可以使用任何合适的方法来测定，例如通过检测dna或rna水平的转录活性(例如通过dna-fish或rna-fish)、通过检测yap调节的基因表达来确定，这些检测例如通过报告基因测定、定量pcr、蛋白质印迹等。
[0237]
在某些实施方式中，该细胞或对象的src-1表达水平高于参考水平。src-1先前已被证实与乳腺癌有关。本文公开了非小细胞肺癌中src-1表达升高与恶性特征和不良预后相关。因此，src-1转录凝聚体的扰动可能导致癌细胞死亡。在某些实施方式中，src-1转录凝聚体抑制剂与src-1相互作用或结合以干扰、减少或抑制src-1转录凝聚体的形成、组成、稳定性和/或活性。
[0238]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂包括肽、核酸或小分子。肽、核酸或化学小分子可以与src-1的结构性结构域或idd相互作用。这种相互作用可能会影响凝聚体的形成、组成、稳定性或活性，从而导致src-1转录凝聚体的转录输出的改变。因此，可以通过用包含肽、核酸或小分子的src-1凝聚体抑制剂调节转录凝聚体来影响一种或多种基因的表达。
[0239]
在某些实施方式中，src-1转录凝聚体是多价的，包含至少一种锚定部分和至少一种干扰部分。“干扰”部分与凝聚体的组分微弱地相互作用以破坏或改变相互作用的性质。“锚定”部分对凝聚体中或附近的蛋白质的结构化区域具有强亲和力，从而用于将干扰分子集中在凝聚体(例如，src-1转录凝聚体)中或其附近。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂与src-1的idd相互作用并进一步结合src-1的结构化结构域(例如，ad1、ad2、nr相互作用结构域或b-hlh-pas结构域)。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂结合src-1的idd并进一步结合与转录凝聚体相关的其他组分。
[0240]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂以不超过20μm(例如，不超过10um、5um、1um、500nm、200nm、100nm、50nm、20nm或10nm)的浓度降低src-1转录凝聚体的水平至少30％(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。
[0241]
src-1转录凝聚体的水平可以通过src-1转录凝聚体的量表示。src-1转录凝聚体
的量可以通过本文公开的方法或本领域已知的任何合适的方法测量。例如，src-1可以与可检测标签(例如荧光分子)缀合，使src-1凝聚体在显微镜下可视化为点状物，并且荧光强度与src-1凝聚体的水平相关。如果src-1不与凝聚体结合，则荧光强度通常均匀分布在细胞核或细胞质中。src-1凝聚体的水平可以通过合适的方法进一步测定，例如，通过计算在显微镜选定视野下可视化src-1凝聚体的数量，或通过计算相对于背景信号增加的荧光强度信号，或通过计算荧光强度高于预定阈值的区域。
[0242]
或者，src-1转录凝聚体的水平可以通过src-1转录凝聚体的活性来表示。src-1凝聚体的活性可以通过任何合适的方法测定，包括但不限于通过测定与src-1凝聚体相关的基因的表达水平(例如，通过诸如qpcr、rna-seq的方法)和/或与src-1凝聚体相关的组蛋白的乙酰化水平(例如，通过chip-qpcr或chip-seq等方法)。
[0243]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂包括埃替拉韦(evg)，或与evg竞争结合src-1，或者诱导src-1的构象变化，所述构象变化至少与evg诱导的构象变化相当。evg由吉利德科学公司开发，商品名为vitekta，是一种用于治疗hiv感染的整合酶抑制剂。其iupac名称为6-[(3-氯-2-氟苯基)甲基]-1-[(2s)-1-羟基-3-甲基丁-2-基]-7-甲氧基-4-氧代喹啉-3-羧基酸并具有以下结构
[0244][0245]
如本文所述“竞争结合”的能力是指试剂(例如，小分子)将两个分子(例如，evg和src-1)之间的相互作用抑制至任何可检测的程度(例如，至少85％，或至少90％，或至少95％)的能力。本领域技术人员将认识到，无需过多的实验就可以确定给定试剂是否与evg竞争与src-1的结合或相互作用。
[0246]
在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂在降低src-1转录凝聚体水平方面具有与evg相当的活性或更高的活性。
[0247]
yap靶基因的调节
[0248]
另一方面，本发明提供了一种调节细胞或对象中一个或多个yap靶基因转录的方法，包括通过src-1抑制剂调节src-1。
[0249]
如本文所述“yap靶基因”是指其表达(例如，转录的激活或抑制)受到yap与tead(或与其他转录因子)共同调节的基因。在某些实施方式中，yap靶基因的转录被yap激活或上调。许多yap靶基因介导细胞增殖和存活，包括驱动g1/s相变、dna复制和修复、核苷酸代谢和有丝分裂细胞的基因。这反映了yap在促进细胞生长和防止细胞衰老方面具有强大的促肿瘤活性。在某些实施方式中，yap靶基因还包括那些编码hippo途径以及整合素和细胞骨架机制上游调节因子的基因。这些基因可以限制或增强yap的活性。在某些实施方式中，yap靶基因与致癌途径相关。在某些实施方式中，yap靶基因是癌基因。
[0250]
在某些实施方式中，yap靶基因包括结缔组织生长因子(ctgf)、gli2、birc5、birc2、成纤维细胞生长因子1(fgf1)、含锚蛋白重复结构域的蛋白(ankrd)、富含半胱氨酸
的血管生成诱导剂61(cyr61)、tgb2、areg、foxf2、igfbp3、rassf2和双调蛋白。在某些实施方式中，一个或多个yap靶基因选自ankrd1,ctgf和cyr61。
[0251]
鉴于yap与包含src-1的转录凝聚体相关，本发明认为通过调节src-1转录凝聚体从而调节一种或多种yap靶向基因的转录。在某些实施方式中，src-1凝聚体抑制剂或src-1抑制剂用于调节一个或多个yap靶向基因的转录。
[0252]
在某些实施方式中，该细胞或对象的src-1表达水平高于参考水平。据报道，src-1与乳腺癌和前列腺癌有关(redmond,a.m.,et al.,clin cancer res15,2098-2106(2009))。本发明公开了非小细胞肺癌中src-1表达升高与恶性特征和不良预后与yap表达升高相关。在某些实施方式中，该细胞或对象的src-1和yap表达水平均高于参考水平。参考水平可以从一个或多个参考样品(例如，从健康对象或从患者的健康组织获得的样品)获得。参考水平也可以从数据库获得，该数据库包括来自一个或多个参考样品的数据、标准或水平的集合。在某些实施方式中，此类数据收集、标准或水平均已标准化。
[0253]
src-1抑制剂
[0254]
本文所述的“src-1抑制剂”是指能够下调src-1水平或活性的试剂。src-1抑制剂包括但不限于src-1凝聚体抑制剂。例如，src-1抑制剂降低src-1的表达水平，但不影响src-1的相分离行为。在某些实施方式中，src-1抑制剂包括肽、核酸或小分子。
[0255]
在某些实施方式中，核酸包括能与src-1mrna可以特异性杂交的寡核苷酸，或者编码该寡核苷酸的多核苷酸。
[0256]
本发明公开的寡核苷酸为在严格条件下与src-1mrna杂交。如本文所述“严格条件”是指序列将与其靶序列(即互补序列)杂交但不会与其他非互补序列杂交的条件。严格条件取决于序列并且在不同情况下有所不同。
[0257]
在某些实施方式中，寡核苷酸与src-1mrna中的靶向部分互补并抑制其表达或功能。寡核苷酸可以与src-1mrna的任何合适的靶向部分杂交。本文使用的术语“部分”是指寡核苷酸或核酸的限定数量的连续核苷酸。src-1mrna的合适靶标部分可由本领域技术人员确定，例如，具有足够独特的序列，从而最小化不理想的脱靶结合，和/或足以进行寡核苷酸结合，无论src-1mrna的二级或三级结构如何。在某些实施方式中，src-1mrna的靶向部分是长度为6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或更多个核苷酸，或者在由上述长度中的任意两个限定的范围之间。寡核苷酸序列和src-1mrna靶向部分之间可能不需要100％互补。在某些实施方式中，寡核苷酸包含与src-1mrna的靶向部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的序列。
[0258]
在某些实施方式中，靶向src-1mrna的寡核苷酸长度为至少8至80、10至80、12至50、15至30、18至24、19至22或20个核苷酸。
[0259]
在某些实施方式中，寡核苷酸可以被化学修饰。修饰涵盖了核苷间键合、核苷酸的糖部分或核苷酸的核碱基的取代或改变。修饰的寡核苷酸可具有所需的性质，例如增强的细胞摄取、增强对核酸靶标的亲和力、在核酸酶存在下增加稳定性或增加抑制活性。化学修饰的核苷酸也可用于增加缩短或截短的寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。给定寡核苷酸中的所有位置不必被一致修饰，并且事实上，可以将多于一个的上述修饰掺入单个寡核苷
酸中或者甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷内。
[0260]
寡核苷酸可以共价连接至一个或多个部分或缀合物，所述缀合物能增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。寡核苷酸还可以被修饰以具有一个或多个稳定基团，所述稳定基团通常附接到寡核苷酸的一个或两个末端以增强特性，例如核酸酶稳定性。
[0261]
在某些实施方式中，寡核苷酸包括sirna、shrna、mirna或反义寡核苷酸。
[0262]
反义寡核苷酸是单链寡核苷酸(例如，单链dna寡核苷酸)，其以序列特异性方式结合靶rna以抑制基因表达、调节前体信使rna的剪接或灭活microrna。反义寡核苷酸的最佳长度有很多种(例如，长度为12-18个核苷酸)，同时确保其靶序列在转录组中是唯一的(seth(2009)j med chem 52:10-13)。在某些实施方式中，反义寡核苷酸包括本文所述的一种或多种修饰。
[0263]
小干扰rna(“sirna”)或小发夹rna(“shrna”)均包含双链rna(dsrna)结构，其以序列特异性方式抑制或降解单链靶rna(即rna干扰)。
[0264]
sirna可由两条独立的寡核苷酸组装而成，其中一条链为正义链，另一条链为反义链，其中反义链和正义链自我互补并形成双链体或双链结构；反义链包含与靶核酸分子的至少一部分互补的核苷酸序列。在某些实施方式中，双链结构为约15至约30，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。在某些实施方式中，sirna每条链上都有一个3'突出端。在shrna(单一寡核苷酸)的形式中，自我互补的正义区和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接。在某些实施方式中，shrna具有正义区、反义区和环区。环区的长度通常在约2至约10个核苷酸之间。转录后加工后，shrna可通过dicer酶介导的切割转化为sirna。在某些实施方式中，sirna和shrna包括本文所述的一种或多种修饰。
[0265]
在某些实施方式中，src-1抑制剂是src-1类似物。术语“类似物”是指模拟所选天然肽(例如，src-1)或蛋白质功能结构域(例如，src-1的结构域或idd)的三级结合结构或活性的肽、部分肽或非肽分子。这些肽类似物包括重组或化学修饰的肽，以及非肽试剂，例如小分子药物类似物。在某些实施方式中，src-1类似物与src-1或与src-1转录凝聚体相关的组分(例如，本文所述的第一组分)相互作用，以干扰、减少或抑制凝聚体的形成、组成、稳定性和/或活性。在某些实施方式中，src-1类似物能够将src-1从src-1转录凝聚体中隔离，例如隔离入第二src-1凝聚体。
[0266]
治疗疾病或病症的方法
[0267]
另一方面，本发明提供一种治疗对象yap相关疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用药学上有效量的src-1抑制剂。
[0268]
另一方面，本发明提供一种治疗src-1凝聚体相关疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用药学上有效量的src-1凝聚体抑制剂。
[0269]
yap作为转录共激活因子，响应hippo通路在细胞质和细胞核之间穿梭。在细胞核中，yap与tead家族配对，调节参与促进细胞增殖、器官过度生长、应激生存等过程的基因表达。在许多癌症中观察到yap水平和活性增强，该现象维持肿瘤生长、具有耐药性和恶性肿瘤的发生。在某些实施方式中，yap相关疾病或病症是癌症。
[0270]
src-1最初被鉴定为类固醇受体共激活剂。自此，src-1被发现与许多转录因子家族结合，协调和调节正常组织发育和维护以及细胞增殖和肿瘤生长过程中的复杂生理反应。本发明公开了src-1能够经历相分离以形成src-1凝聚体。在某些实施方式中，src-1凝
聚体相关疾病或病症的特征在于er、ar、vdr或ap-1的激活。在某些实施方式中，src-1凝聚体相关疾病或病症包括神经障碍、心脏发育疾病、炎性疾病、代谢障碍、昼夜节律障碍或癌症。
[0271]
本发明公开了src-1促进yap转录活性，并且细胞中的src-1凝聚体可以包含yap。在某些实施方式中，src-1凝聚体相关疾病或病症的特征在于yap水平和/或活性增强。
[0272]
在某些实施方式中，该疾病或病症表现为src-1的表达水平高于参考水平。src-1先前已被证实与乳腺癌和前列腺癌有关。本文公开了非小细胞肺癌中src-1表达升高与恶性特征和不良预后相关。
[0273]
在某些实施方式中，该疾病或病症与癌基因的异常表达相关。“异常表达”是指检测的基因表达与正常细胞(例如，相同细胞类型的正常细胞，或者对于培养细胞，在可比较条件下培养的细胞)中的典型参考水平不同。
[0274]
在某些实施方式中，该疾病或病症与yap靶基因的异常表达相关。在某些实施方式中，该疾病或病症与yap的转录活性异常相关。
[0275]
在某些实施方式中，所述疾病或病症是癌症。癌细胞可以变得高度依赖某些基因的转录，如转录依赖性(transcriptional addiction)，并且这种转录可以依赖于特定的凝聚体。例如，src-1转录凝聚体可能在肿瘤所依赖的癌基因处形成，并且该凝聚体可能是src-1凝聚体抑制剂的特异性靶向。
[0276]
在某些实施方式中，癌是实体瘤或血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，所述癌症是转移性的。
[0277]
在某些实施方式中，癌症可以是乳腺癌、肺癌、肾上腺癌、淋巴上皮肿瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听觉神经瘤、急性淋巴细胞白血病、表浅黑素瘤、急性髓系白血病、腺样汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸性白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞性白血病、malt淋巴瘤、急性单核细胞性白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性周围神经鞘瘤、曼托细胞淋巴瘤、腺癌、边缘区b细胞淋巴瘤、恶性海马瘤、腺样囊性癌、腺瘤、类腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、髓样甲状腺癌、成人t细胞白血病/淋巴瘤、髓母细胞瘤，浸润性nk细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺横纹肌肉瘤、默克细胞癌、齿槽软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、转移性膀胱上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合黏液性肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、真菌性蕈样肉芽肿、星形胶质细胞瘤、黏液样脂肪肉瘤、非典型畸形的横纹肌肉瘤、黏液瘤、b细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、b细胞淋巴母细胞性白血病、鼻咽癌、b细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤病、膀胱癌、神经瘤、肉瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、brenner瘤、少突胶质瘤、棕色瘤、少突胶质细胞瘤、伯基特淋巴瘤、嗜酸性乳腺癌、脑癌、视神经肿瘤癌、口腔癌原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺沟肿瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果体细胞肿瘤、绒毛膜癌、垂体腺瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体腺瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、多发性胚胎细胞瘤、宫颈癌、前体t淋巴母细胞淋巴瘤、结肠直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、degos病、原发性浆液性淋巴瘤、增殖性小圆细胞瘤、原发
性腹腔浆液瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、前列腺癌、神经上皮肿瘤的胚胎性畸形、胰腺癌、未分化细胞性肿瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假黏液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、肠病相关t细胞淋巴瘤、内胚层窦肿瘤、肾髓质癌、视网膜母细胞瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、体内联胎畸胎、横纹肌肉瘤、子宫肌瘤、里希变性、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、塞尔托里细胞瘤、生殖细胞瘤、性索-生殖间质肿瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞纤维母细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、脑胶质瘤、生长抑素瘤、脑胶质瘤、煤尘疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘淋巴瘤、颗粒性细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、塞萨病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈部癌、t细胞性淋巴瘤、血管上皮瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、肉瘤、肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾型t细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、尿囊癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌症、肠癌、膀胱上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性类似雀斑的痰、疣状癌、致命性中线肉芽肿、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特龙巴赫浓度异常症、腺样淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤、淋巴管肉瘤。
[0278]
在某些实施方式中，癌症是乳腺癌，肺癌(可以是非小细胞肺癌)，葡萄膜黑色素瘤，肝癌，头颈癌和鳞状细胞癌，间皮瘤或恶性胸膜间皮瘤。
[0279]
在某些实施方式中，药学有效量足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长接受治疗的对象的存活时间。药学有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。药学有效量根据对象所涉及的具体治疗而变化，并取决于本领域已知的各种因素，例如对象的体重、体型和健康状况；病情的性质和程度；给药率；选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合；以及处方医生的判断。给定情况下的药学有效量可以通过临床医生的技能和判断范围内的常规试验来确定。例如，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。又例如，施用剂量可以在治疗过程中根据对象的反应而变化。
[0280]
筛选方法
[0281]
另一方面，本发明公开提供了一种筛选能调节src-1凝聚体的试剂的方法，包括：
[0282]
a).提供src-1凝聚体，并评估凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应，
[0283]
b).使用测试试剂接触src-1凝聚体，和
[0284]
c).评估测试试剂是否会对src-1凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应造成变化。
[0285]
在某些实施方式中，如果测试试剂导致src-1凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应发生变化，则所述测试试剂鉴定为能调节凝聚体。
[0286]
在某些实施方式中，src-1凝聚体是src-1转录凝聚体。在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与src-1相互作用的第一组分。在某些实施方式中，第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与第一组分相互作用的第二组分。在某些实施方式中，第二组分包括tea结构域转录因子。在某些实施方式中，tea结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。在某些实施方式中，所述转录凝聚体还包括
rna聚合酶。在某些实施方式中，所述转录凝聚体还包括一种组蛋白。
[0287]
在某些实施方式中，src-1凝聚体位于细胞内或细胞核内。所述凝聚体可能是天然存在的凝聚体。在其他实施方案中，凝聚体可以存在于转基因细胞或以其他方式操作的细胞中。在某些实施方式中，筛选方法在基于细胞的系统中进行，包括提供具有src-1凝聚体的细胞，使细胞与测试试剂接触，并确定与测试试剂的接触是否引起src-1凝聚体的一种或多种物理性质的变化或一种或多种生物学效应的变化。
[0288]
在某些实施方式中，筛选方法在无细胞系统中进行，包括提供具有src-1凝聚体的分离的细胞组合物，使组合物与测试试剂接触，并确定与测试试剂的接触是否引起src-1凝聚体的一种或多种物理性质的变化或一种或多种生物学效应的变化。在某些实施方式中，分离的细胞组合物包含含有src-1凝聚体的细胞核。
[0289]
具有凝聚体的细胞类型或从中分离出具有src-1凝聚体的组合物的细胞类型不受限制并且可以是本发明公开的任何细胞类型。在某些实施方式中，细胞受到疾病(例如癌细胞)的影响。在某些实施方式中，具有凝聚体的细胞是原代细胞、细胞系成员、分离自患有疾病的对象的细胞、或衍生自分离自患有疾病的对象的细胞的细胞(例如，分离自患有疾病的对象的诱导多能细胞的祖细胞)。
[0290]
在某些实施方式中，src-1凝聚体是合成凝聚体(另见下面的描述)。合成凝聚体在体外可以表现为由src-1组成的液滴。在某些实施方式中，合成凝聚体还包含一种或多种组分(例如，本文所述的第一组分和第二组分)。所述液滴还可包含rna、dna和/或组蛋白。所述液滴是体外凝聚体并且可以对应于体内存在的凝聚体的模型和/或用作体内存在的凝聚体的模型。
[0291]
在某些实施方式中，测量src-1凝聚体的物理性质。物理性质可包括但不限于组成、稳定性、尺寸、浓度、渗透性、形态和粘度。可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量一种或多种物理性质。所述物理性质可以与凝聚体激活报告基因的能力相关。
[0292]
在某些实施方式中，该方法包括提供细胞、包含src-1凝聚体的分离的细胞组合物，或合成src-1凝聚体，并评估该凝聚体的一种或多种物理性质，使该凝聚体与测试试剂接触，并评估测试试剂是否引起凝聚体的一种或多种物理性质的变化。在某些实施方式中，进一步测试被鉴定为引起凝聚体的一种或多种物理性质的试剂，以评估其对凝聚体的一种或多种功能性质(即生物效应)的影响，例如调节一种或多种与凝聚体相关基因的转录的能力。
[0293]
在某些实施方式中，凝聚体具有可检测标签并且该可检测标签用于确定与测试试剂的接触是否引起src-1凝聚体的一种或多种物理性质或一种或多种生物学效应的任何变化。在某些实施方式中，细胞经基因工程改造以表达可检测标签。本文使用的术语“可检测的标签”包括但不限于可检测标签，例如荧光团、放射性同位素、比色底物或酶；异源表位(其特定抗体可商购)，例如flag标签；异源氨基酸序列(作为市售结合蛋白的配体)，例如strep标记、生物素；荧光猝灭剂(通常与其他多肽上的荧光标签结合使用)；以及互补的生物发光或荧光多肽片段。可以直接测量作为可检测标记物或互补生物发光或荧光多肽片段的标签(例如，通过测量适当底物或酶的荧光或放射性，或与未结合的多肽相比，与适当底物或酶一起孵育以产生相关多肽的分光光度计可检测的颜色变化)。作为异源表位或配体的标签通常用与其结合的附加试剂(例如抗体或结合蛋白)来检测，其中所述试剂与可检测
标签关联。在某些实施方式中，src-1或凝聚体组分(例如，如本文所述的第一或第二组分)包含可检测标签。
[0294]
在某些实施方式中，评估测试试剂以确定src-1凝聚体的以下一种或多种物理性质在接触时是否改变：(i)src-1凝聚体的数量；(ii)src-1凝聚体的尺寸；(iii)src-1凝聚体的位置；(iv)src-1凝聚体的分布。(v)src-1凝聚体的表面积；(vi)src-1凝聚体的成分；(vii)src-1凝聚体的流动性；(viii)src-1凝聚体的凝固；(ix)src-1凝聚体的分解。
[0295]
可以使用任何合适的方法检测在接触测试试剂时凝聚体的变化，包括本领域已知的和本发明教导的方法。在某些实施方式中，使用显微镜确定与测试试剂的接触是否导致凝聚体的性质改变。在某些实施方式中，显微镜是反卷积显微镜、结构化照明显微镜或干涉显微镜。在某些实施方式中，使用dna-fish、rna-fish或其组合确定与测试试剂的接触是否导致凝聚体的性质改变。
[0296]
在某些实施中，通过以凝聚体依赖的方式基于靶基因的表达来评估src-1转录凝聚体的一个或多个生物学效应。在某些实施方式中，所述靶基因是报告基因。所述报告基因可以可操作地连接至yap/tead、ar、ep vdp或ap-1的结合位点。在某些实施方式中，报告基因编码可检测的荧光或发光蛋白。在某些实施方式中，所述靶基因是yap靶基因。在某些实施方式中，所述靶基因是ankrd1,ctgf或cyp61。
[0297]
在某些实施方式中，src-1凝聚体在与测试试剂接触之前驱动报告基因的表达，并且在与抑制、降解或防止凝聚体形成、稳定性、功能或形态的试剂接触之后会消除或降低报告基因的表达。
[0298]
在某些实施方式中，基于含有src-1凝聚体的细胞的增殖来评估src-1转录凝聚体的多种生物学效应之一。可以通过本文描述的或本领域已知的任何合适的方法(例如细胞活力测定)来评估细胞的增殖。在某些实施方式中，含有src-1凝聚体的细胞是肿瘤细胞。在某些实施方式中，在测试试剂与细胞接触后，含有src-1凝聚体的细胞的增殖减少。
[0299]
在某些实施方式中，根据组蛋白的乙酰化评估转录src-1凝聚体的多种生物学效应之一。可以通过本文描述的或本领域已知的任何合适的方法来评估组蛋白乙酰化，例如chip-qpcr或免疫荧光成像。在某些实施方式中，在测试试剂与src-1凝聚体接触后，组蛋白乙酰化增加。
[0300]
另一方面，本发明提供了一种鉴定试剂的方法，所述试剂能调节src-1凝聚体的形成，所述方法包括：
[0301]
a.提供能形成src-1凝聚体的组分；
[0302]
b.在适于形成src-1凝聚体的条件下，使测试试剂与所述组分接触，和
[0303]
c.评估测试试剂的存在是否影响src-1凝聚体的形成或src-1凝聚体的一个或多个生物学效应。
[0304]
在某些实施方式中，如果测试试剂影响了凝聚体的形成或者影响了src-1凝聚体的一个或多个生物学效应，那么测试试剂被鉴定为调节凝聚体的形成。
[0305]
例如，可以提供组分(例如，本文所述的src-1和第一或第二组分)，将它们在容器中合并，并观察凝聚体形成方面发生的情况和/或测量所得凝聚体的性质(例如，组成、活性、形态、稳定性的增加或减少)。在某些实施方式中，所提供的组合物将形成凝聚体，并且就调节凝聚体形成(例如，增加或减少凝聚体的形成或凝聚体形成的速率)筛选测试试剂。
[0306]
在某些实施方式中，筛选调节src-1凝聚体形成的试剂的方法包括在src-1凝聚体的控制下提供表达报告基因的细胞、分离的细胞组合物和/或体外转录实验，使细胞或实验与测试试剂接触，并评估报告基因的表达。
[0307]
在某些实施方式中，可以实施该方法以鉴定试剂，该试剂与src-1相互作用并将src-1驱动成转录凝聚体。在某些实施方式中，可以实施该方法以鉴定与src-1相互作用并防止src-1与凝聚体结合的试剂。在某些实施方式中，该方法可以用来鉴别试剂，所述试剂可以迫使组分整合到src-1凝聚体中，或防止组分进入src-1凝聚体。在某些实施方式中，对于通过本发明公开的方法鉴定的调节src-1凝聚体或src-1凝聚体形成的试剂，还可以测试其调节疾病的一种或多种特征的能力。所述疾病不受限制并且可以是本文所述的任何疾病。例如，如果该试剂抑制报道基因的表达或src-1凝聚体的形成，则可以测试该试剂抑制癌细胞增殖的能力，所述癌细胞的src-1表达相对于参考升高。
[0308]
在某些实施方式中，通过本发明公开的方法所鉴定的试剂，能调节凝聚体的一种或多种物理性质或形成(例如形成、稳定性或形态)或凝聚体的功能性质(例如转录的调节)，将该试剂施用于对象，例如充当疾病模型的非人类动物，或需要疾病治疗的对象。
[0309]
在某些实施方式中，进行高通量筛选(hts)。高通量筛选可以利用无细胞或基于细胞的测定(例如，含有细胞的凝聚体、合成凝聚体、分离的细胞组合物)。高通量筛选通常涉及高效地测试大量测试剂，例如并行测试。例如，可以在短时间内(例如几小时到几天)常规筛选数万或数十万种化合物。通常，所述筛选在含有至少96个孔的多孔板或其他容器中进行，其中基底中存在多个物理分离的空腔或凹陷。高通量筛选通常涉及自动化的使用，例如用于液体处理、成像、数据采集和处理等。可以应用于本发明的hts的实施例中的某些一般原理和技术记载于macarron r&hertzberg rp.“高通量筛选试验的设计和实施(design and implementation of high-throughput screening assays)”.methods mol biol.,565:1-32,2009和/或an wf&tolliday nj.,“简介：基于细胞的高通量筛选分析(introduction:cell-based assays for high-throughput screening)”.methods mol biol.486:1-12,2009,和/或其中任何一个的参考文献中。
[0310]
在某些实施方式中，可生成通过本发明公开方法鉴定的试剂的类似物，所述类似物调节凝聚体的一种或多种物理性质或形成(例如形成、稳定性、功能或形态)或凝聚体的功能性质(例如转录的调节)。第一试剂的“类似物”是指结构上和/或功能上与第一试剂相似的第二试剂。试剂的类似物可以具有与该试剂基本相似的物理、化学、生物和/或药理学性质，或者可以在至少一种物理、化学、生物或药理学性质上不同。在某些实施方式中，至少一种所述的性质不同，这样的不同使得类似物更适合特定领域的用途(例如，用于调节凝聚体)。产生类似物的方法是本领域已知的并且包括本文所述的方法。在某些实施方式中，可以测试所产生的类似物的感兴趣的性质，例如稳定性增加(例如，在水性介质中、在人血液中、在胃肠道中等)、生物利用度增加、给予对象后半衰期延长，细胞摄取增加、调节凝聚体性质的活性增加，所述性质包括凝聚体的物理性质或形成(例如，形成、稳定性、功能或形态)或凝聚体的功能性质(例如转录的调节)、凝聚体的特异性增加。
[0311]
合成的凝聚体
[0312]
另一方面，本发明提供了一种合成的src-1凝聚体，其至少包含src-1或其包含src-1的内在无序结构域的片段。如本文所述“合成的”凝聚体是指包含凝聚体组分的非天
然存在的凝聚体。在某些实施方式中，合成的src-1凝聚体是一种合成的src-1转录凝聚体。.在某些实施方式中，合成的src-1凝聚体模拟细胞中发现的src-1转录凝聚体。
[0313]
合成src-1凝聚体可包含本文所述的任何组分。在某些实施方式中，凝聚体包含能够与src-1相互作用的第一组分(例如，yap、er、ar、vdr或ap-1)。在某些实施方式中，凝聚体包含能够与第一组分相互作用的第二组分(例如，tead1、tead2、tead3、tead4)。在某些实施方式中，凝聚体包含rna聚合酶(例如聚合酶ii)。在某些实施方式中，凝聚体包含分离的多核苷酸(例如报告基因)。
[0314]
在某些实施方式中，合成的src-1凝聚体包含src-1或其包含idd的片段。在某些实施方式中，src-1的片段可以在相关生理条件(例如，与细胞中的条件相同或近似的条件)或相关实验条件(例如，体外用于形成凝聚体的合适条件)下形成凝聚体或掺入凝聚体中。在某些实施方式中，src-1的片段可以与yap相互作用或与yap结合。
[0315]
在某些实施方式中，所述片段与诱导性寡聚结构域融合。在某些实施方式中，赋予诱导性寡聚化的结构域可由小分子、蛋白质或核酸诱导。在某些实施方式中，src-1或其片段还包含本文所述的可检测标签。在某些方面，可检测标签是荧光标签。
[0316]
本发明公开的一些方面提供了制备合成的转录凝聚体的方法。在某些实施方式中，在适合形成转录凝聚体的条件下，所述方法包括在体外结合两种或多种凝聚体组分。所述条件可包括适当的组分浓度、盐浓度、ph值等。在某些实施方式中，所述条件包括约25mm、40mm、50mm、125mm、200mm、350mm或425mm的盐浓度(例如，nacl)；或者大约在10-250mm、25-150mm、或40-100mm的范围内。在某些实施方式中，所述条件包括ph约为7-8、7.2-7.8、7.3-7.7、7.4-7.6或约7.5。
[0317]
体外筛选系统
[0318]
另一方面，本发明还提供了一种体外筛选系统，该系统包括src-1或其含有src-1内在无序结构域的片段，和可检测标签其中，src-1或其片段能够形成src-1凝聚体。在某些实施方式中，src-1凝聚体是转录凝聚体。
[0319]
在某些实施方式中，体外筛选系统基于细胞中的src-1凝聚体。细胞可以是转基因细胞或以其他方式操纵的细胞。在某些实施方式中，体外筛选系统基于体外的src-1凝聚体。在某些实施方式中，体外src-1凝聚体包含模拟细胞中发现的凝聚体的组分。
[0320]
在某些实施方式中，体外src-1凝聚体是在溶液中具有一种或多种凝聚体组分的合成凝聚体。在某些实施方式中，从细胞中分离出体外src-1凝聚体。从细胞或组合物中分离凝聚体的任何合适的方法均涵盖在本发明中(例如化学或免疫沉淀)。在某些实施方式中，通过离心(例如，在约5,000xg、10,000xg、15,000xg下约5-15分钟；在约10,000xg下约10分钟)分离凝聚体。可以通过在合适的缓冲条件下用匀浆器(即，杜恩斯匀浆器)裂解细胞核，然后通过离心和/或过滤来分离凝聚体，从而从细胞中分离凝聚体。
[0321]
在某些实施方式中，可检测标签附接于src-1或其片段。在某些实施方式中，可检测标签包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。在某些实施方式中，体外凝聚体包含多个如本发明所述的可检测标签。在某些实施方式中，不同的可检测标签附接于src-1和src-1的不同组分(例如，用一种荧光标签标记的src-1或其片段，以及用不同荧光标签标记的yap或pol ii)。在某些实施方式中，凝聚体的一种或多种组分具有猝灭剂。
[0322]
在某些实施方式中，体外筛选系统还包括能够与src-1相互作用的第一组分。在某
些实施方式中，第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。在某些实施方式中，src-1转录凝聚体进一步包括能够与第一组分相互作用的第二组分。在某些实施方式中，第二组分包括tea结构域转录因子。在某些实施方式中，tea结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。在某些实施方式中，体外筛选系统还包括rna聚合酶。在某些实施方式中，体外筛选系统还包括细胞裂解物或细胞核裂解物。
[0323]
修饰的宿主细胞
[0324]
另一方面，本发明提供了一种表达src-1或其包括内在无序结构域的片段的修饰的宿主细胞，其中src-1或片段能够形成src-1凝聚体，该宿主细胞还包括一可检测标签，用于检测src-1凝聚体。本文所述的“宿主细胞”是指引入了编码外源蛋白质或肽的表达载体的真核细胞，以及此类细胞的任何后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在本发明所用的术语的范围内。
[0325]
在某些实施方式中，可检测标签附接于src-1或其片段。在某些实施方式中，可检测标签包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
[0326]
在某些实施方式中，修饰的宿主细胞还包含yap响应性的报告构建物。在某些实施方式中，yap响应的报告构建物包括报告基因，所述报告基因可操作地连接对yap活性产生响应的启动子。
[0327]
在某些实施方式中，宿主细胞是肿瘤细胞。
[0328]
另一方面，本发明提供了一种修饰的宿主细胞，其表达：a)src-1或包括其内在无序结构域的片段；和b)yap或其功能等效物，其中所述宿主细胞包含yap响应性的报告构建物。
[0329]
另一方面，本发明公开提供了一种筛选试剂方法，所述试剂抑制src-1，所述方法包括：
[0330]
c.在适合表达报告基因的条件下，将测试试剂与本文所提供的修饰的宿主细胞接触；
[0331]
d.评估报告基因响应所述测试试剂的表达变化；
[0332]
其中，报告基因表达的改变表明src-1受到抑制。
[0333]
本发明公开的修饰的宿主细胞可用于产生所述体外筛选系统。在一个实施方案中，在合适的培养基中培养宿主细胞(其中已引入编码与可检测标签融合的src-1或片段的重组表达载体)直至产生src-1或其片段，然后从细胞中分离包含src-1凝聚体的组合物。
[0334]
本发明的修饰的宿主细胞还可用于产生非人转基因动物。非人转基因动物可用于筛选试验，该试验旨在鉴定能够调节src-1凝聚体并改善癌症有害症状的试剂。
[0335]
实施例
[0336]
尽管已经参考具体实施方式(其中一些是优选实施方式)具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，可在不背离所附权利要求限定的本发明的构思和范围的情况下在形式和细节上进行各种改变。
[0337]
下面通常描述实施例中使用的方法和材料。
[0338]
方法和材料
[0339]
i.细胞培养
[0340]
h1299、h1838、mcf7、a549、ht29、rko细胞系购自中国科学院细胞库，并经过str分析和支原体检测验证。sf268由张为民实验室友情提供。beas-2b由jnj提供，ocm-1/ocm-8由于法新实验室赠送，293ft由王文元实验室赠送。这些细胞已通过定期形态检查和支原体检测进行验证。
[0341]
根据美国标准培养物保藏中心的指导对细胞进行维护(dmem/rpmi1640补充有10％(v/v)fbs(gibco)、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素(gibco))。所有细胞均在37℃、95％空气和5％co2的潮湿空气中培养。
[0342]
ii.质粒/sirna转染和病毒感染
[0343]
根据制造商的说明，使用lipofectamine3000(life technologies)将质粒转染到sf268/h1299/a549/beas-2b中。根据制造商的说明，使用polyjet(sl100688,signagen)将质粒转染至hek293t/293ft。根据制造商的说明，使用lipofectamine rnai max(life technologies)进行sirna的转染。
[0344]
为了产生稳定的细胞，使用了慢病毒或逆转录病毒感染。简而言之，hek293ft细胞与病毒质粒和包装质粒共转染。转染后48小时，将培养基通过0.45um过滤器过滤，并用于感染感兴趣的细胞。
[0345]
iii.活细胞成像
[0346]
细胞在24孔玻璃底板(cellvis，p24-1.5h-n)上生长，并使用leica tcs sp8共聚焦显微镜系统用100倍油镜(na＝1.4)拍摄图像。细胞在加热台(37℃)上成像，并补充温热的(37℃)湿空气。
[0347]
对于化合物处理测定，yap5sa、tead4-mtagbfp2和mneogreen-src1共转染sf268细胞。yap变异体yap5sa对上游hippo通路不敏感，将yap隔离在细胞核中。为了规避红色荧光蛋白带来的限制，据报道依赖于yap的tead凝聚体被用来表征yap/tead转录凝聚体。转染后六小时，将sf268细胞接种在24孔玻璃底板(cellvis，p24-1.5h-n)上，两小时后添加化合物。添加evg或其他化合物后，每30分钟进行一次细胞成像。
[0348]
使用las x(leica)和fiji处理荧光图像并将其组装成图形。
[0349]
iv.高含量影像分析
[0350]
转染后八小时，将表达mscarlet-src-1的h1299细胞接种于24孔玻璃底板(cellvis p24-1.5h-n)中，两小时后添加evg。使用operetta clstm高含量细胞成像分析系统(perkinelmer inc.，waltham，ma，usa)获得图像。在各种条件下均使用63倍物镜。对从每组100多个代表性领域收集的图像进行数据分析。通过mscarlet通道根据斑点的面积和强度进行斑点定量。graphpad prism用于绘制和分析高含量影像分析结果。
[0351]
v.光漂白后的荧光恢复(frap)
[0352]
使用leica sp8共焦显微镜系统的frap模块进行frap测定。分别使用405/488/561nm激光束漂白tead4-mtagbfp、mclover3-yap和mscarlet-src1。使用100％激光功率将漂白聚焦于圆形感兴趣区域(roi)，并收集延时图像。使用fiji测量荧光强度。减去背景强度并报告相对于漂白前时间点的值。graphpad prism用于绘制和分析frap结果。
[0353]
vi.体外液-液相分离(llps)测定
[0354]
对于llps测定，将纯化的src1(最终50μm)与含有20mm tris ph8.0、10％(w/v)
peg8000(sigma)的llps缓冲液混合，并在室温下孵育10分钟。最后，将每个样品取2μl移液到玻璃皿上，并使用leica显微镜成像。
[0355]
vii.荧光免疫
[0356]
细胞用4％ pfa室温固定15分钟。随后用pbs(3
×
3分钟)洗涤细胞，并在室温下用pbs/bsa(3％)/triton x-100(0.3％)封闭60分钟。将细胞在pbs中漂洗，并与抗h3k27ac(ab4729，abcam，1:100)、抗rna pol ii-s5p抗体(#04-1572，millipore，1:200)在pbs/bsa(1％)中在4℃下孵育过夜。用pbst(1xpbs+tween20 0.2％，3
×
5min)洗涤细胞，并与二抗在室温下孵育1小时。用pbst(3
×
5min)洗涤后，用dapi对细胞进行染色。
[0357]
viii.蛋白质表达与纯化
[0358]
yap、tead4和src1截短物在大肠杆菌bl21(de3)中表达为his融合体。细胞生长至od为0.6-0.8，然后添加异丙基1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷(iptg)以诱导蛋白表达，然后在16℃下孵育过夜。收集细胞沉淀并在裂解缓冲液(20mm tris-hcl ph 8.0、150mm nacl、1mm pmsf)中进行超声处理。然后将上清液离心并与ni sepharose 6fast flow(17-5318-01，ge healthcare)一起孵育。洗涤树脂，并使用补充有50-500mm咪唑的裂解缓冲液洗脱蛋白质。
[0359]
ix.荧光素酶报告基因实验
[0360]
yap结合位点被克隆到含有热激基础启动子的pgl4.76基础载体(promega)的nhei和hindiii位点中。使用renilla-荧光素酶测定系统(promega)测量荧光素酶活性。使用celltiter-one solution assay(promega)测量细胞活力。相对荧光素酶活性＝荧光素酶活性/细胞活力。
[0361]
x.免疫共沉定
[0362]
按照用于免疫沉淀试剂盒(10003d，invitrogen)的dynabeads
tm
protein g实验方案中的描述进行coip。在coip裂解缓冲液(20mm tris-hcl 7.5、150mm nacl、0.5％ np40、10％甘油、1％蛋白酶混合物)中制备sf268的全细胞裂解物。通过离心收集上清液，并与抗src1抗体或抗tead4抗体或与dynabeads
tm
proteing偶联的igg一起孵育。在裂解缓冲液中洗涤珠子(4x5分钟)，并通过免疫印迹检查样品。
[0363]
xi.flag下拉实验
[0364]
进行了三次独立的下拉实验以检测src1和yap/tead4之间的直接结合。将纯化的flag-src1截短蛋白分别与yap、tead4和yap加tead4孵育，并通过anti-m2亲和凝胶(a2220，sigma-aldrich)进一步进行下拉实验。正如所显示的，将埃替拉韦与浓度逐渐增加的混合物(0、50、200、400μm)共同孵育。在pbs缓冲液中洗涤复合物，并使用2
×
sds上样缓冲液洗脱蛋白质。
[0365]
xii.rt-pcr
[0366]
用化合物按指定周期处理细胞，然后用trizol
tm
试剂(15596018，invitrogen)提取总rna，并使用高效cdna合成主混合物(fsq-301，toyobo)进行反转录。使用440premix ex taq
tm
(rr420，takara)进行定量rt-pcr。使用quantstudio
tm
6flex实时pcr系统(thermofisherscientific)进行定量实时pcr。qpcr引物列于补充表s1中。
[0367]
xiii.chip-qpcr
[0368]
简而言之，细胞在室温下与培养基中的1％甲醛(sigma)交联10分钟，然后使用pico(diagenode sa)将裂解细胞核的染色质剪切成200-1000bp片段。将约50μg
剪切染色质和约2μg抗体混合。使用proteing-dynabeads(invitrogen)在4℃持续孵育抗体/抗原复合物1.5小时。使用quantstudio
tm
6flex实时pcr系统(thermofisher scientific)进行定量实时pcr。每个样品中免疫沉淀dna的量确定为输入的分数，并标准化为igg对照。pcr引物列于补充表s2中。
[0369]
xiv.公共chip-seq数据分析
[0370]
我们使用deeptools模块plotheatmap来分析chip-seq数据上的峰，并遵循之前报告的协议56。人k562细胞系的chip-seq数据从cistrome数据浏览器(http://cistrome.org/db/#/)下载，包括64089_peaks.bed、galaxy14-[46284.bw].bigwig、galaxy6-[64887.bw].bigwig、galaxy7-[57447.bw].bigwig、galaxy8-[68375.bw].bigwig、galaxy9-[57417.bw].bigwig。我们使用washu brower(http://cistrome.org/db/#/)和igv查看基因组中的yap、tead和src-1chip富集情况。
[0371]
xv.rna-seq
[0372]
使用trizol
tm
试剂(15596018，invitrogen)用20μm evg/dmso处理24小时后，从sf268细胞中提取三个生物重复的总rna。rnaseq文库使用illumina truseq rna sample prep kit v2制备，并使用illumina hiseq xten平台进行测序(150bp双端读数)。我们使用hisat259版本2.0.1将rna-seq测序读数映射到人类参考转录组(grch37.71)。使用r软件包deseq鉴定了埃替拉韦治疗组中的差异表达基因。
[0373]
xvi.生物膜干涉测量法(bli)
[0374]
使用blioctet red96(inc.，menlo park，ca)检查evg和src1之间的结合。链霉亲和素生物传感器(inc.)在测定缓冲液(20mm trishcl ph8.0、150mm nacl和1％ dmso)中预浸泡(30分钟)，然后含有100um evg-生物素的测定缓冲液中涂敷7分钟。作为对照，传感器在含有100um biocytin的测定缓冲液中孵育，然后用含有1％ bsa和0.1％tween20的测定缓冲液洗涤6分钟。将指定浓度的截短src1蛋白(500、166.7、55.6、6.2、0μg/ml)稀释在含有1％ bsa/0.1％ tween20的测定缓冲液中，并流过涂有bio-evg或生物胞素的生物传感器5分钟。随后进行5分钟解离。使用octetred分析软件分析数据。
[0375]
xvii.纯化蛋白下拉生物素-evg
[0376]
将1μg纯化的重组蛋白flag-src-1与2μm生物素-evg/dmso在浓度递增的埃替拉韦(20、40、100、200um)存在下孵育30分钟(rt)，并进一步与链霉亲和素-琼脂糖(20359，thermo fisher scientific)一起孵育20分钟(rt)。pbs洗涤珠子(3x 1.5分钟)使用抗flag抗体通过蛋白质印迹分析沉淀物。
[0377]
xviii.统计分析
[0378]
所有数据均以独立测定的平均值
±
标准误差(s.e.m.)或标准差(s.d.)表示，并使用软件graphpad prism 6.0版(graphpad software,inc.；la jolla,ca,usa.)进行统计分析，使用双尾/单尾t检验测试平均值差异的统计显著性。
[0379]
实施例1
[0380]
为了深入了解yap活性的表观遗传调控机制，我们探讨了hat酶是否与yap靶基因的表达有关。使用sirna文库对sf268细胞进行集中遗传筛选，该sirna文库包含3个独立的sirna，针对报道的人类基因组编码的15种蛋白质(hat)，该细胞源自携带yap基因扩增(13个拷贝)并表达高yap蛋白水平的人胶质母细胞瘤(图1a和1b)。所有三种sirna对src-1
(kat13a)的敲低均一致地降低了yap靶向ctgf的表达(图1c)，并且全基因表达谱(图1d)进一步证实了src-1对yap靶基因的调节。这些数据表明src-1促进yap转录活性。
[0381]
实施例2
[0382]
为了研究src-1是否共存于yap/tead相分离转录凝聚体中，在sf268细胞中异位表达mclover3-yap、tead4-mtagbfp2和mscarlet-src-1。显微成像显示，src-1分布到yap/tead凝聚体中(图2a)，并在光漂白后表现出快速恢复(补充信息，图2b-d)。鉴于src-1蛋白含有大量的idd(图2e)，对其发生llps的内在潜力进行了研究，发现src-1可以在体外和细胞内形成llps凝聚体(图2f-h)。frap和融合实验进一步证实了其类液体特性(图2g和2h)。重要的是，ctd磷酸化rna聚合酶ii和h3k27ac都在yap/tead/src-1凝聚体中富集(图2i)，表明src-1共占据的yap/tead llps点是活性转录位点。这些结果支持src-1形成与yap/tead隔开的llps凝聚体以促进基因表达。
[0383]
实施例3
[0384]
在内源条件下进行免疫共沉淀实验(图3a和3b)以验证src-1是yap/tead复合物的组成部分。为了表征与yap和tead相互作用的src-1结构域，用截短形式的src-1转染293t细胞，发现bhlh-pas(src1-n)和ad(src1-c)结构域都参与了与yap和tead的相互作用(图3c和3d)。然后对之前报道的chip-seq数据集(davis,c.a.et al.nucleic acids res.46,d794-d801(2018))进行分析，以进一步探索src-1对yap/tead转录组的全基因组调节。观察到src-1与yap和tead2的显著的基因组共占用(图3e-h)。一致地，sf268细胞中的chip-qpcr数据证实了src-1和yap/tead在yap靶基因位点(包括ankrd1、nbbp和pawr)中的富集(图3i)。
[0385]
实施例4
[0386]
显微成像显示，在不同的细胞环境下，src-1可以在erα信号传导和hippo通路之间相互作用形成转录凝聚体(图4a-c)，突出了src-1对细胞特异性转录激活调节的特异性。
[0387]
实施例5
[0388]
虽然src-1先前已与乳腺癌相关(redmond,a.m.et al.clin cancer res.15,2098-2106(2009))，但在nsclc中检测到src-1表达升高，这与恶性特征和不良预后相关(图5a-c)。使用src-1敲低的h1299细胞进行的一系列功能测定(图5d-i)表明，src-1对于肺癌增殖、迁移和侵袭至关重要。这些结果支持src-1在nsclc中具有非典型但关键的致癌功能。
[0389]
实施例6
[0390]
通过免疫组织化学(ihc)分析120个nsclc样本中的src-1和yap表达，发现src-1和yap共同上调，src-1和yap的蛋白水平之间存在很强的相关性(r2＝0.52)(图6a和6b)。重要的是，src-1和yap表现出相似的分布模式(图6c)。为了探讨src-1和yap是否共同驱动肿瘤发生，用yap和/或src-1转化正常人肺支气管上皮细胞(beas-2b)。显微镜观察显示，与单独使用yap相比，在共转染src-1和yap的beas-2b细胞中，集落形成的数量和程度都更加明显，而单独使用src-1则没有形成集落(图6d-g)。这些结果表明src-1通过促进yap促进肺癌进展。
[0391]
实施例7
[0392]
在fda批准的抑制yap活性的药物库中，通过基于yap报告细胞的筛选，鉴定出一种抗hiv药物埃替拉韦(elvitegravir，evg)(图7b-d)。evg处理选择性地破坏了相分离的src-1凝聚体，但yap/tead4凝聚体没有被破坏(图7a)。全基因表达谱证实evg下调yap靶基因(图
7e)。特别是，如yap中不受影响的核易位和磷酸化模式所揭示的，evg调节yap活性不依赖于经典的hippo激酶级联反应(图7f-i)。在排除evg可能阻断yap接近靶基因的可能性后(图7j)，发现埃替拉韦通过降低yap靶基因处的h3k27ac标记水平来表观遗传调节yap(图7k和7l)。重要的是，显微成像显示evg抑制tead斑点处h3k27ac的富集，但对ser 5(ctd)磷酸化的rna聚合酶ii没有影响(图7m)。接下来使用重组蛋白进行体外下拉实验，发现即使浓度高达400μm，evg也不影响src-1与yap和tead的结合，这表明src-1从yap/tead凝聚体中排除并不是因为yap或tead的结合中断导致的(图7n)。事实上，evg抑制了表达mneogreen或mscarlet标记的src-1的h1299细胞中核src-1斑点的形成(图7o和7p)。高含量影像分析结果证实了evg对src-1相分离的抑制作用(图7q)。这些表明evg直接破坏src-1的llps。生物物理学研究证实evg直接结合src-1(图7r)。进一步的竞争下拉和热位移测定(图7s-u)表明结合是直接的和特异性的。发现evg有效抑制肺癌细胞系的增殖，并且诱导性敲低src-1使a549细胞对埃替拉韦的抗增殖作用具有部分抗性(图7v和7w)，表明这种作用是src-1依赖性的。此外，用evg处理src-1和yap共表达的beas-2b细胞集落显著抑制了集落外边界的迁移活动(图7x)。综上所述，evg通过干扰src-1/yap/tead凝聚体中的src-1llps来拮抗yap致癌转录活性(图7y)。
[0393]
实施例8下拉实验
[0394]
在细胞下拉实验中与src-1结合的测试化合物的表征：
[0395]
方法：收获细胞(用flag-src-1的表达载体转染的sf268细胞和hek293ft细胞)并在裂解缓冲液(20mm trishcl 7.5、150mm nacl、0.5％np40、5％甘油、1％蛋白酶混合物)中裂解，然后与20μm带有生物素标签的化合物或dmso在室温下孵育40分钟。然后与100μl链霉亲和素-琼脂糖(20359，thermo fisher scientific)在室温下孵育30分钟。用裂解缓冲液洗涤珠子4次(4x 583 1.5分钟)。使用抗flag抗体通过蛋白质印迹分析沉淀物。
[0396]
与src-1结合的所测化合物的体外表征
[0397]
将1μg纯化的重组蛋白flag-src-1与2μm生物素标记的化合物或作为对照的dmso在浓度递增(20、40、100、200um)的无生物素标记的各化合物存在下孵育30分钟(rt)，并进一步与链霉亲和素-琼脂糖一起孵育(20359，thermo fisher scientific)20分钟(rt)。用pbs洗涤珠子(3x 1.5分钟)。使用抗flag抗体通过蛋白质印迹分析沉淀物。
[0398]
实施例9:增殖实验
[0399]
所测化合物对细胞增殖影响的表征
[0400]
细胞按照优化密度(每孔200～2000个细胞)在96孔viewplate中培养，并按照atcc建议的在含有dmso或化合物的100μl培养基中培养。培养6天[或指定的其他时间段]后，使用celltiter-发光细胞活力实验(promega，g7572)测量细胞活力，并将dmso组作为标准，使用graphpad prism软件计算半数最大抑制浓度(ic50)。
[0401]
实施例10：rt-qpcr
[0402]
所测化合物对src-1相关基因表达影响的表征：
[0403]
用指定时间点的化合物处理细胞，然后用trizol
tm
试剂(15596018，invitrogen)提取总rna，并使用高效cdna合成主混合物(fsq-301，toyobo)进行反转录。使用440premix ex taq
tm
(rr420，takara)进行定量rt-pcr。使用quantstudio
tm
6flex实时546pcr系统(thermofisher scientific)进行定量实时pcr。qpcr引物见表1。
[0404]
表1：qpcr引物
[0405][0406][0407]
实施例11：chip-qpcr
[0408]
所测化合物对src-1相关染色质修饰影响的表征：
[0409]
染色质免疫沉淀抗体列于补充550补充方法中。简而言之，细胞在室温下与培养基中的1％甲醛(sigma)交联10分钟，然后使用pico(diagenode sa)将裂解细胞核的染色质剪切成200-1000bp片段。将50μg剪切染色质和2μg抗体混合。使用proteing-dynabeads(invitrogen)在4℃，1.5小时回收抗体/抗原复合物。使用quantstudio
tm
6flex实时pcr系统(thermofisher scientific)进行定量实时pcr。每个样品中免疫沉淀dna的量确定为输入的分数，并相对igg对照标准化。
[0410]
表2：qpcr引物
[0411]
region#1正向引物atggcctgccactttgttacseq id no:21 反向引物ttttcagaactggggtctggseq id no:22region#2正向引物cagcattcctgtcattccctseq id no:23 反向引物caggcttcttttcttgcaccseq id no:24
region#3正向引物tctggaatgctgacccttctseq id no:25 反向引物cttgggtgacttcgtcatcaseq id no:26#ctrl正向引物accaacactcttccctcagcseq id no:27 反向引物ttattttggttcaggtggttgaseq id no:28
[0412]
实施例12：src-1凝聚体的活细胞成像
[0413]
细胞在24孔玻璃底板(cellvis，p24-1.5h-n)上生长，并使用leica tcs sp8共聚焦显微镜系统用100倍油物镜(na＝1.4)拍摄图像。细胞在加热台(37℃)上成像，并补充温热的(37℃)湿空气。
[0414]
对于化合物处理实验，yap
5sa
、tead4-mtagbfp2和mneogreen-src1共转染sf268细胞。yap变异体yap
5sa
对上游hippo通路不敏感，将yap隔离在细胞核中。为了规避红色荧光蛋白带来的限制，tead凝聚体(据报道依赖于yap)被用来表征yap/tead转录凝聚体。转染后六小时，将sf268细胞接种在24孔玻璃底板(cellvis，p24-1.5h-n)上，两小时后添加20μm化合物。dmso的最终浓度为0.1％。添加evg或其他化合物后，每30分钟进行一次细胞成像。
[0415]
对从每组100多个代表性领域收集的图像进行数据分析。根据通过绿色(mneogreen-src1)和蓝色(tead4-mtagbfp2)通道的斑点数量和强度进行斑点定量。使用lasx(leica)和fiji处理荧光图像并将其组装成图形。graphpad prism用于绘制和分析化合物处理结果。
[0416]
活细胞成像显示了在未用20μm evg处理条件下，转染yap5sa质粒的h1299细胞中，tead4-mtagbfp和mneogreen-src1在核内的分布情况。右侧合并图像中，沿着所示线指示了tead4-mtagbfp和mneogreen-src1的荧光强度定量。使用依赖于yap的tead凝聚体表征yap/tead转录凝聚体。src-1与yap/tead转录凝聚体共分相。evg处理后，src1相分离被打破，而yap/tead凝聚体保持完整。比例尺，5μm。

技术特征：
1.一种调节细胞或对象中一个或多个基因转录的方法，包括调节至少包含src-1的src-1转录凝聚体，其中所述src-1转录凝聚体调节所述一个或多个基因的转录。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述src-1转录凝聚体还包括能够与src-1相互作用的第一组分。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述src-1转录凝聚体还包括能够与第一组分相互作用的第二组分。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二组分包含tea-结构域转录因子。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述tea-结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。7.如上述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1转录凝聚体还包括rna聚合酶。8.如上述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，通过调节或减少src-1转录凝聚体的形成、组成、稳定性和/或活性来调节所述src-1转录凝聚体。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过与src-1凝聚体抑制剂接触来调节所述src-1转录凝聚体。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂能a)减少src-1凝聚体的形成或稳定性，b)减少或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分之间的相互作用，任选地以src-1选择性的方式，c)降低或消除src-1与所述转录凝聚体中的一个或多个组分的结合，任选以src-1选择性的方式，或d)将src-1隔离在所述转录凝聚体之外。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述一种或多种组分包括yap，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂与src-1的内在无序结构域相互作用。13.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂与src-1的非内在无序结构域(非-idd)结合，并任选地，选择性地在idd中以别构方式诱导构象变化。14.如权利要求10-11任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂将src-1隔离在转录凝聚体之外，任选地，所述隔离不显著影响不含src-1的转录凝聚体。15.如权利要求10-14任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂包含肽、核酸，或小分子。16.如权利要求10-15任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂以不超过20μm的浓度降低src-1转录凝聚体的水平至少30％(例如至少40％，50％，60％或70％)。17.如权利要求10-16任一项所述的方法，其特征在于，src-1凝聚体抑制剂包括埃替拉韦(evg)，或与evg竞争结合src-1，或者诱导src-1的构象变化，所述构象变化至少与evg诱导的构象变化相当。
18.如权利要求10-16任一项所述的方法，其特征在于，src-1凝聚体抑制剂在降低src-1转录凝聚体水平方面具有与evg相当的活性或更高的活性。19.如上述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述一个或多个基因的转录与癌基因信号通路相关。20.如上述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述一个或多个基因包括一个或多个癌基因。21.如上述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述一个或多个基因包括一个或多个yap靶基因。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述一个或多个yap靶基因选自ankrd1、ctgf和cyr61。23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细胞或对象的src-1表达水平高于参考水平。24.一种调节细胞或对象中一个或多个yap靶基因转录的方法，包括通过src-1抑制剂调节src-1。25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述src-1抑制剂能够降低src-1的表达水平或降低其生物活性，或者src-1抑制剂是src-1凝聚体抑制剂。26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述src-1抑制剂包含肽、核酸，或小分子。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述核酸包含能与src-1mrna特异性杂交的寡核苷酸，或编码该寡核苷酸的多核苷酸，和/或所述肽包含src-1类似物。28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含sirna,shrna,mirna，或反义寡核苷酸。29.如权利要求24-28任一项所述的方法，其特征在于，所述一个或多个yap靶基因选自ankrd1、ctgf和cyr61。30.如权利要求24-29任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞或对象的src-1表达水平高于参考水平。31.一种治疗对象的与src-1凝聚体相关的疾病或病症或与yap相关的疾病或病症的方法，包括向对象施用具有药学上有效量的src-1抑制剂。32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症的特征为src-1表达水平高于参考水平。33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症与癌基因的异常表达有关。34.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症与yap靶基因的异常表达有关。35.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症与异常的yap转录活性有关。36.如权利要求31-35任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述癌症是转移性的。38.如权利要求36或37所述的方法，其特征在于，所述癌症是乳腺癌、肺癌、肾上腺癌、
淋巴上皮肿瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听觉神经瘤、急性淋巴细胞白血病、表浅黑素瘤、急性髓系白血病、腺样汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸性白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞性白血病、malt淋巴瘤、急性单核细胞性白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性周围神经鞘瘤、曼托细胞淋巴瘤、腺癌、边缘区b细胞淋巴瘤、恶性海马瘤、腺样囊性癌、腺瘤、类腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、髓样甲状腺癌、成人t细胞白血病/淋巴瘤、髓母细胞瘤，浸润性nk细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺横纹肌肉瘤、默克细胞癌、齿槽软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、转移性膀胱上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合黏液性肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、真菌性蕈样肉芽肿、星形胶质细胞瘤、黏液样脂肪肉瘤、非典型畸形的横纹肌肉瘤、黏液瘤、b细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、b细胞淋巴母细胞性白血病、鼻咽癌、b细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤病、膀胱癌、神经瘤、肉瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、brenner瘤、少突胶质瘤、棕色瘤、少突胶质细胞瘤、伯基特淋巴瘤、嗜酸性乳腺癌、脑癌、视神经肿瘤癌、口腔癌原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺沟肿瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果体细胞肿瘤、绒毛膜癌、垂体腺瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体腺瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、多发性胚胎细胞瘤、宫颈癌、前体t淋巴母细胞淋巴瘤、结肠直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、degos病、原发性浆液性淋巴瘤、增殖性小圆细胞瘤、原发性腹腔浆液瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、前列腺癌、神经上皮肿瘤的胚胎性畸形、胰腺癌、未分化细胞性肿瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假黏液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、肠病相关t细胞淋巴瘤、内胚层窦肿瘤、肾髓质癌、视网膜母细胞瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、体内联胎畸胎、横纹肌肉瘤、子宫肌瘤、里希变性、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、塞尔托里细胞瘤、生殖细胞瘤、性索-生殖间质肿瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞纤维母细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、神经胶质瘤、生长抑素瘤、脑神经胶质瘤、煤尘疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘淋巴瘤、颗粒性细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、塞萨病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈部癌、t细胞性淋巴瘤、血管上皮瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、肉瘤、肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾型t细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、尿囊癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌症、肠癌、膀胱上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性类似雀斑的痰、疣状癌、致命性中线肉芽肿、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特龙巴赫浓度异常症、腺样淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤、淋巴管肉瘤。39.如权利要求36或37所述的方法，其特征在于，所述癌症是乳腺癌，肺癌(任选是非小细胞肺癌)，葡萄膜黑色素瘤，肝癌，头颈癌和鳞状细胞癌，间皮瘤，或恶性胸膜间皮瘤。40.如权利要求31-39任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1抑制剂能减少src-1的表达水平或减少其生物活性。41.如权利要求31-40任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1抑制剂包含肽、核酸，
或小分子。42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述核酸包括能与src-1mrna特异性杂交的寡核苷酸，或者编码该寡核苷酸的多核苷酸。43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含sirna,shrna,mirna，或反义寡核苷酸。44.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述src-1抑制剂是src-1类似物。如权利要求31-39任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1抑制剂包括src-1凝聚体抑制剂。45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂能：a)减少src-1凝聚体的形成、组成或其稳定性，b)减少或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分之间的相互作用，任选地以src-1选择性的方式，c)降低或消除src-1与转录凝聚体中的一个或多个组分的结合，任选地以src-1选择性的方式，或d)将src-1隔离在转录凝聚体之外。46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，一个或多个组分包括yap。47.如权利要求44-46任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂与src-1的内在无序结构域相互作用。48.如权利要求44-46任一项所述的方法，其特征在于，src-1凝聚体抑制剂与src-1的非内在无序结构域(非-idd)结合，并任选地在idd中以别构方式诱导构象变化。49.如权利要求44-48任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂将src-1隔离在转录凝聚体之外，任选地，所述隔离不显著影响不含src-1的转录凝聚体。50.如权利要求44-49任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂以不超过20μm的浓度降低src-1转录凝聚体的水平至少30％(例如至少40％，50％，60％或70％)。51.如权利要求44-50任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂包括埃替拉韦(evg)，或与evg竞争结合src-1，或者诱导src-1的构象变化，该构象变化至少与evg诱导的构象变化相当。52.如权利要求44-51任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体抑制剂在降低src-1转录凝聚体水平方面具有与evg相当的活性或更高的活性。53.一种筛选试剂的方法，所述试剂调节src-1凝聚体，所述方法包括：a.提供src-1凝聚体，并评估凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应，b.使用测试试剂接触所述src-1凝聚体，和c.评估测试试剂是否引起src-1凝聚体的一个或多个物理性质的变化或一个或多个生物学效应的变化。54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，如果测试试剂导致src-1凝聚体的一个或多个物理性质或一个或多个生物学效应发生变化，则所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚体。55.一种鉴定试剂的方法，所述试剂调节src-1凝聚体的形成，所述方法包括：a.提供能形成所述src-1凝聚体的组分；
b.在适于形成src-1凝聚体的条件下，使测试试剂与所述组分接触，和c.评估测试试剂的存在是否影响所述src-1凝聚体的形成或所述src-1凝聚体的一个或多个生物学效应。56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，如果测试试剂影响凝聚体的形成或者影响所述src-1凝聚体的一个或多个生物学效应，那么测试试剂被鉴定为调节凝聚体的形成。57.如权利要求53-56所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体是分离的合成凝聚体，或者是包含所述src-1凝聚体的分离的细胞组合物的形式。58.如权利要求53-56所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体位于细胞内或细胞核内。59.如权利要求53-58任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1凝聚体是转录凝聚体。60.如权利要求53-59任一项所述的方法，其特征在于，以凝聚体依赖的方式基于靶基因的表达来评估转录凝聚体的一个或多个生物学效应。61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述靶基因为报告基因。62.如权利要求60-61任一项所述的方法，其特征在于，靶基因是yap调节基因。63.如权利要求59-62任一项所述的方法，其特征在于，所述src-1转录凝聚体还包括能够与src-1相互作用的第一组分。64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述第一组分包括yes相关蛋白(yap)，雌激素受体(er)，雄激素受体(ar)，维生素d受体(vdr)和ap-1。65.如权利要求63或64所述的方法，其特征在于，所述src-1转录凝聚体还包括与所述第一组分相互作用的第二组分。66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述第二组分包含tea-结构域转录因子。67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述tea-结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。68.如权利要求59-67任一项所述的方法，其特征在于，所述转录凝聚体还包括rna聚合酶。69.一种合成src-1凝聚体，其至少包含src-1或其包括src-1的内在无序结构域的片段。70.如权利要求69所述的合成src-1凝聚体，其特征在于，所述片段与诱导性寡聚结构域融合。71.一种体外筛选系统，该系统包括src-1或其含有src-1的内在无序结构域的片段，和可检测标签，其特征在于，所述src-1或其片段能够形成src-1凝聚体。72.如权利要求72所述的体外筛选系统，其特征在于，所述可检测标签附接于所述src-1或其片段。73.如权利要求73所述的体外筛选系统，其特征在于，所述可检测标签包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。74.如权利要求73所述的体外筛选系统，其特征在于，所述体外筛选系统还包括能够与src-1相互作用的第一组分。75.如权利要求74所述的体外筛选系统，其特征在于，所述第一组分包括yes相关蛋白
(yap)、雌激素受体(er)、雄激素受体(ar)、维生素d受体(vdr)和ap-1。76.如权利要求74-75任一项所述的体外筛选系统，其特征在于，还包括与所述第一组分相互作用的第二组分。77.如权利要求76所述的体外筛选系统，其特征在于，所述第二组分包含tea-结构域转录因子。78.如权利要求77所述的体外筛选系统，其特征在于，所述tea-结构域转录因子包括tead1、tead2、tead3、tead4或其任意组合。79.如权利要求71-78任一项所述的体外筛选系统，还包括rna聚合酶。80.如权利要求71-79任一项所述的体外筛选系统，还包括细胞裂解物或细胞核裂解物。81.一种表达src-1或其包括内在无序结构域的片段的修饰的宿主细胞，其特征在于，所述src-1或片段能够形成src-1凝聚体，所述宿主细胞还包括用于检测src-1凝聚体的可检测标签。82.如权利要求81所述的修饰的宿主细胞，其特征在于，所述可检测标签附接于src-1或其片段。83.如权利要求82所述的修饰的宿主细胞，其特征在于，所述可检测标签包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。84.如权利要求81-83任一项所述的修饰的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是肿瘤细胞。85.修饰的宿主细胞，所述宿主细胞表达：a)src-1或其包括内在无序结构域的片段；和b)yap或其功能等效物，其中宿主细胞包含yap响应性的报告构建物。86.如权利要求85所述的修饰的宿主细胞，其特征在于，所述yap响应性报告构建物包括报告基因，所述报告基因操作性连接对yap活性产生响应的启动子。87.一种筛选试剂的方法，所述试剂抑制src-1，所述方法包括：a.在适合表达报告基因的条件下，将测试试剂与权利要求86所述的修饰的宿主细胞接触；b.评估所述报告基因响应测试试剂的表达变化；其中，所述报告基因的表达改变表明src-1受到抑制。

技术总结
本发明提供了通过调节SRC-1凝聚体以调控一个或多个基因转录的方法，和使用SRC-1抑制剂治疗疾病和病症的方法，以及筛选能调节SRC-1凝聚体的试剂的方法。1凝聚体的试剂的方法。


技术研发人员：朱光亚 谢菁菁 朱继东 郭鑫 何浩
受保护的技术使用者：上海奕拓医药科技有限责任公司
技术研发日：2022.02.09
技术公布日：2023/10/7