GLP1多肽药物冻干闪释片及其制备方法与流程

glp1多肽药物冻干闪释片及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及药物制剂领域，特别涉及glp1多肽药物冻干闪释片及其制备方法。


背景技术：

2.胰高血糖素样肽(glp1)广泛应用于二型糖尿病与重度肥胖治疗，患者长期通过注射给药。尽管创新的glp1药物不断迭代，目前仍然很难扭转一个痛苦的现实：患者需要终生持续通过注射给药。诺和诺德公司的口服索马鲁肽/司美格鲁肽(semaglutide)产品上市后，虽然首次实现了glp1类药物的口服给药，但其口服生物利用度仍然较低（仅1%）。且该药物成本高，患者需要每日服用，经济负担较重。因此，在二型糖尿病与重度肥胖治疗领域，缺少一种可以低成本、高效率口服递送glp1药物的技术。
3.牛奶细胞外囊泡(mev)是一种可从牛奶中大量提取的由磷脂双分子膜形成的生物纳米颗粒。它的天然功能包括从母体（母牛）向后代（牛犊）的胃肠道递送生物活性分子（蛋白质、小核酸等）。已有研究证实mev可耐受消化道内消化酶、低ph等环境因素的破坏，通过消化道吸收进入血液循环。由于牛奶的广泛食用基础，大多数人群对mev的长期暴露（通过饮用牛奶）决定了mev的人体口服应用是安全、可耐受的。因此，mev近年来作为一种潜在的口服药物递送载体受到较多关注。
4.此前的技术中，不乏以mev装载小分子药物的先例。前期研究中，虽然装载glp1（利拉鲁肽liraglutide）的mev经口腔给药后可由舌下静脉丛吸收进入血液循环。但到目前为止，针对装载glp1的mev口腔给药与舌下吸收没有成熟的口服固体剂型。一些现有技术中，制备获得的是装载利拉鲁肽的mev的溶液制剂，然而尽管mev的溶液稳定性相较于其它类型的细胞外囊泡(ev)有显著提升，但mev在高浓度溶液中如何保持稳定仍然是一个待解决的技术问题。mev纳米颗粒的溶液浓度在超过1
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p/ml后，其聚集、融合、容器壁吸附等问题就凸显出来。另外一些方案中，虽然制备获得了冻干舌下片，但为了维持mev在冻干过程中的活性，需要添加较大量甘露醇或微晶纤维素，若实现压片则过于紧实从而导致口腔崩解释放困难。并且，冻干粉体积增加过度，在临床拟用剂量下含服困难较大。
5.适宜的冻干固体制剂的单片溶液体积通常不大，在1毫升以下，而mev口腔吸收的临床拟用剂量在10
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颗粒甚至更高。因此需要一种可达到1
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p/ml甚至更高浓度的mev原液浓缩工艺及与之配套的稳定剂配方。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供药物浓度高、溶出效率高、利于口腔舌下吸收的glp1多肽药物冻干闪释片及其制备方法。
7.本发明提供了glp1多肽药物冻干口崩片，其包含如下质量百分数的原料：30%~50%glp1多肽-mev原液、0.1%~1.0%表面活性剂、3%~5%骨架剂、1%~3%粘合剂、0.01%~1%助悬剂，余量为水；所述表面活性剂选自泊洛沙姆188。
8.进一步的，所述骨架剂选自甘露醇、海藻糖中的一种；优选的，所述骨架剂为海藻糖。
9.进一步的，所述粘合剂选自普鲁兰多糖、明胶中的一种；优选的，所述粘合剂为普鲁兰多糖。
10.进一步的，所述助悬剂选自普鲁兰多糖、黄原胶中的一种；优选的，所述助悬剂为黄原胶。
11.进一步的，所述glp1多肽-mev原液的制备原料中：每毫克glp1多肽，加入0~1.2mg辅料和1
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13 mev颗粒。
12.所述辅料选自多聚赖氨酸，鱼精蛋白，多聚精氨酸，岩藻糖或甘露醇中的一种，优选的，所述辅料为多聚精氨酸。
13.一些实施例中，本发明提供的glp1多肽药物冻干口崩片中包含如下质量百分数的原料： 50%glp1多肽-mev原液、0.2%表面活性剂、3%骨架剂、2%粘合剂、0.1%助悬剂，余量为水。在本发明实施例中，所述原料的质量分数以冻干前质量计算。
14.本发明提供的舌下片中，包括表面活性剂在内的辅料例如骨架剂、粘合剂或助悬剂的选择都合理，从而使制得的舌下片具有更优秀的崩解效果和舌下吸收效率。前期实验表明，相对于其他辅料的选择，泊洛沙姆188、海藻糖、普鲁兰多糖、黄原胶的组合更有利于辅助glp1-mev更好的维持稳定性、提高口腔中的释放性能和舌下吸收效率。所述glp1多肽为利拉鲁肽、司美格鲁肽中的一种或多种。
15.一些实施例中，所述glp1多肽为利拉鲁肽，所述利拉鲁肽冻干口崩片中包含如下质量百分数的原料：30%~50% 利拉鲁肽-mev原液、0.1%~1.0% 泊洛沙姆188 、3%~5% 海藻糖、1%~3% 普鲁兰多糖、0.01%~1%黄原胶，余量为水。
16.具体实施例中，所述利拉鲁肽冻干口崩片中包含如下质量百分数的原料：50% 利拉鲁肽-mev原液、0.2% 泊洛沙姆188 、3% 海藻糖、2% 普鲁兰多糖、0.1%黄原胶，余量为水。
17.一些实施例中，所述glp1多肽为司美格鲁肽，所述司美格鲁肽冻干口崩片中包含如下质量百分数的原料：30%~50% 司美格鲁肽-mev原液、0.1%~1.0% 泊洛沙姆188 、3%~5% 海藻糖、1%~3% 普鲁兰多糖、0.01~1%黄原胶、余量为水。
18.具体实施例中，所述司美格鲁肽冻干口崩片中包含如下质量百分数的原料：50% 司美格鲁肽-mev原液、0.2% 泊洛沙姆188 、3% 海藻糖、2% 普鲁兰多糖、0.1%黄原胶，余量为水。
19.本发明还提供了如前所述的glp1多肽药物冻干口崩片的制备方法，包括如下步骤：(1)glp1多肽向mev的装载，获得glp1多肽-mev原液；(2)glp1多肽-mev原液经超滤浓缩后，获得浓缩液，(3)取表面活性剂、骨架剂、粘合剂、助悬剂、甜味剂和矫味剂混合后，加入浓缩液，得到药液；(4)将步骤（3）中的药液进行剪切；(5)将步骤（4）中剪切后的药液进行脱气；(6)将步骤（5）中脱气后的药液灌装至窝槽中；(7)将灌装完的药液预冻；
(8)将预冻完成的药品冻干，设定初始温度为-30 ℃，具体冻干过程如下：冷浸温度：≤-40 ℃；真空控制：≤200 ubar板层温度：由-30 ℃升至-25 ℃，5分钟；维持-25℃，60分钟；由-25 ℃升至-15 ℃，10分钟；维持15 ℃，60分钟。由-15 ℃升至-5 ℃，10分钟；维持-5℃，60分钟；由-5 ℃升至10 ℃，25分钟；维持10 ℃，100分钟，由10 ℃升至25 ℃，15分钟；维持25 ℃，60分钟。
20.进一步的，所述glp1多肽向mev的装载包括：将glp1多肽溶液与牛奶外泌体溶液混合后进行超声处理，所述glp1多肽溶液中，溶剂为含有100 mm nacl 的20 mm tris缓冲液，ph值为8.0；所述牛奶外泌体溶液中，溶剂为含有100 mm nacl 的20 mm tris缓冲液，以含有甘氨酸的na2co3/nahco3缓冲液调节ph值为7.0~10.0；所述超声处理的条件包括：99%功率， 5℃，超声处理12h。
21.进一步的，所述glp1多肽-mev原液的超滤浓缩包括：将glp1多肽-mev原液以含有peg3350的pbs缓冲液溶解后，利用截留分子量为750kda的中空纤维柱，浓缩至体积为原液的1/5（流速为405ml/min）。试验表明，该步骤的超滤浓缩对于提高药物的装载量具有重要的积极意义。本发明对超滤浓缩的参数进行优化，获得最优的效果，从而更进一步的提高装载效果。
22.进一步的，所述步骤（2）中的剪切在乳化机中；进一步的，所述步骤（3）中的脱气在乳化机中或脱气瓶中。
23.进一步的，所述剪切的转速为 100-3000 rpm，所述剪切时间为3-20分钟；优选的，所述乳化机的转速为300 rpm，所述剪切时间为10分钟。
24.进一步的，所述预冻温度为-60到-80℃；优选的，所述预冻温度为-60℃。
25.进一步的，所述预冻时间为10-100分钟；优选的，所述预冻时间为30分钟。
26.本发明提供了一种glp1多肽药物冻干闪释片，该闪释片采用冷冻干燥技术制备，所得产品装载量大、溶出效果好、舌下吸收效率高。并且该闪释片的制备方法简便，易于实施。
附图说明
27.图1示无添加剂mev电镜结果；图2示0.5% peg3350添加剂存在下mev电镜结果；图3示5% peg3350添加剂存在下mev电镜结果；图4示动物药效试验中血糖浓度检测结果；图5示动物血药浓度结果；图6示各组给药后的血糖浓度检测结果；图7示lrt-mev与smt-mev给药后的血糖浓度检测结果。
具体实施方式
28.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。本发明实施例中所采用试剂均为
51.（2）.渗透压刺激装载结果：比较不同强度渗透压刺激对lrt在mev中的单颗粒装载量，20% w/v蔗糖浓度下，单个mev颗粒对lrt的装载量最高，可装载2600个lrt多肽分子；该方法下mev对lrt的装载效果不及化学装载方法。
52.表2 不同强度渗透压刺激对lrt在mev中的单颗粒装载量比较
53.（3）.中空纤维柱切向流超滤浓缩结果lrt-mev原液在浓缩前的浓度为6.0e+12p/ml，总颗粒数为2.4e+15p。在0.5%及5% peg3350存在下经中空纤维柱切向流超滤浓缩后总颗粒数比0% peg3350高，5% peg3350条件下颗粒数最高达1.5e+15个，浓度达到7.5e+13p/ml。所得总颗粒数占浓缩前总颗粒数的62.5%，浓度较浓缩前提升12.5倍。电镜结果显示，5% peg3350存在下，mev的分散性较好。
54.表3mev在不同浓度peg3350下的浓缩效果
55.实施例2生产制备装载司美格鲁肽的mev高浓度原液目的：将司美格鲁肽(smt)装载至mev后，以切向流超滤技术浓缩mev溶液并保持mev颗粒数与结构的稳定性。
56.材料：牛奶外泌体（mev）的制备参照专利202110097550.x。
57.方法：1、装载：具体方法详见“实施例1”2、中空纤维柱切向流超滤浓缩(具体方法详见“实施例1”)3、颗粒检测：使用厦门福流nanofcm纳米流式仪对所得mev-smt产品样品进行颗粒数检测4、smt检测：使用lc-ms/ms检测所得mev-smt产品样品中的smt多肽含量，具体检测方法参照文献（doi:10.1016/j.jchromb.2023.123688）。
58.结果：1.装载：利用与lrt装载条件类似的方法（ph10.0,无添加剂），单个mev颗粒可装载20000-40000个smt多肽分子。
59.表4smt在mev中的单颗粒装载量
60.装载时smt与mev的比例增加，单颗粒装载量提高。但当smt加料量饱和后，加料量进一步增加无法进一步提升装载量，同时会降低smt的利用率造成浪费（下表）。实际制剂生产中应同时考虑经济性与装载效率。
61.表5smt与mev起始比例对装载量的影响
62.2. 中空纤维柱切向流超滤浓缩结果：与lrt类似，使用5% peg3350对mev-smt进行浓缩后，浓度较浓缩前提升至少10倍以上，终浓度最高可达8e+13p/ml。
63.表6 smt在mev中的单颗粒装载量
64.实施例3：制备glp1多肽-mev冻干口崩片一、lrt
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mev冻干口崩片的制备以利拉鲁肽(lrt)装载至mev为原料，按照下表的处方进行lrt-mev冻干口崩片的制备表7 lrt
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mev冻干口崩片处方（按冻干前质量计算）
65.（1）称取处方量lrt-mev、普鲁兰糖、海藻糖、泊洛沙姆188于100ml剪切杯中干混后加入约50%处方量纯净水，搅拌溶解。称取处方量的黄原胶，加剩余处方量的纯净水，搅拌溶解。两者混合。
66.（2）剪切：采用乳化机进行剪切，转速：300rpm，时间：10分钟。
67.（3）脱气：将药液转移至125 ml的脱气瓶中，抽真空脱气至无气泡。
68.（4）灌装：采用移液枪灌装至0.4 ml铝窝中，0.4 g/片。
69.（5）预冻：将灌装完的铝窝放置-60 ℃的低温冰箱中预冻，预冻时间20分钟，预冻完成后在此冰箱存放至进冻干机。
70.（6）冻干过程：将预冻完成的样品转至1.7m2冻干机中进行冻干，冻干曲线如下：
进箱温度：-30 ℃；冷阱温度：≤-40 ℃表8 冻干程序
71.表9 评测结果
72.二、smt
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mev冻干口崩片的制备以司美格鲁肽(smt)装载至mev为原料，按（一）中所述方法及处方进行smt-mev冻干口崩片的制备。
73.表10 评测结果
74.实施例4：glp1多肽-mev冻干闪释片的动物药效试验目的： 以db/db小鼠随机血糖试验，评价glp1多肽-mev冻干口崩片的降血糖效果并检测利拉鲁肽的血药浓度一、lrt-mev冻干闪释片药效试验方法：1、 动物药效试验：a. 试验分组表11
75.b. 给药次数：0h与7h各一次c. 检测db/db小鼠0点血糖，异氟烷麻醉后舌下给药：a) a-c组小鼠：将冻干闪释片切成3-6个小片，小心将一小片塞入小鼠舌下，后滴加20ul水溶解药片，分3或6次给药，每次滴加水后间隔10min吸收。
76.b) 阳性对照组：参照文献方法（doi: 10.1002/cmdc.202100758）将lrt-mev溶液从db/db小鼠舌下滴入，分3次给药共计90ul，每次滴加后间隔10min吸收。
77.c) 阴性对照组：未给药。
78.d. 首次给药后于4h、7h、22h、24h、26h、28h与33h检测一次各组小鼠血糖，每次检测血糖2个重复（试验期间小鼠进食、饮水均不受限制——检测随机血糖）
2、 血药浓度检测(1) 采血组a-c与阳性对照组中各9只小鼠于给药后不同时间点(首次给药后4h，22h与33h)进行采血。每组每个时间点处死3只小鼠进行采血。
79.(2) 血样中利拉鲁肽含量以lc-ms/ms方法进行检测血样中利拉鲁肽定量检测方法参照文献中报道的操作流程进行（shiqi dong, yuan gu, guangli wei, duanyun si, changxiao liu , determination of liraglutide in rat plasma by a selective liquid chromatographytandem mass spectrometry method: application to a pharmacokinetics study. chromb(2017), doi:10.1016/j.jchromb.2018.05.020）结果：1. 动物药效随机血糖结果动物药效随机血糖结果显示，阳性对照组小鼠在给药后4h内血糖明显下降，并于7h内显著回升。第二次给药后血糖处于低于基线的水平直至33h恢复至基线水平。闪释片给药组(a-c)在首次给药后7h内血糖无显著下降，但二次给药后血糖出现显著下降，且下降幅度及持续时间与每片所含mev颗粒数呈正相关关系，且a组小鼠血糖下降幅度大于阳性对照组小鼠。
80.2. 血药浓度结果动物血药浓度结果表明，阳性对照组小鼠lrt血药浓度于首次给药后4h达峰并逐渐下降。a-c组小鼠lrt血药浓度于二次给药后达峰(7-22h内）。
81.上述结果显示lrt-mev制成的口服冻干闪释片在小鼠口腔中可快速溶解，且lrt可在小鼠舌下高效吸收进入血液循环，实现降糖效果。
82.二、smt
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mev冻干闪释片药效试验方法目的： 以db/db小鼠随机血糖试验，评价smt-mev冻干口崩片的降血糖效果，并比较lrt-mev与smt-mev的给药频次差异方法：1、动物药效试验1：a.试验1分组表12b.给药次数：口服组0h与7h各一次，皮下注射组0h注射一次c.检测db/db小鼠血糖及给药方法同前。
83.2、动物药效试验2a.试验2分组表13b.给药次数：lrt-mev组day1-day7每日给药两次，smt-mev组在day1给药两次，此后不再给药。
84.c.检测db/db小鼠血糖及给药方法同前。
85.结果：1. 动物药效试验1随机血糖结果动物试验1结果显示口服给予db/db小鼠smt-mev闪释片后，小鼠血糖呈明显下降趋势，提示smt在mev作用下经口腔吸收。且mev含量高的制剂（a组）相较于mev含量低的制剂（b组）起效更快，提示吸收效果更好。
86.2. 动物药效试验2随机血糖结果动物试验2结果显示smt作为第二代长效glp1药物，smt-mev首日口服给药后的药效在db/db小鼠体内可持续5-6天，降血糖效果与每日口服给予lrt-mev组相似。

技术特征：
1.glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，其包含如下质量百分数的原料：30%~50%glp1多肽-mev原液、0.1%~1.0%表面活性剂、3%~5%骨架剂、1%~3%粘合剂、0.01%~1%助悬剂，余量为水；所述表面活性剂选自泊洛沙姆188。2.根据权利要求1所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，所述骨架剂选自甘露醇、海藻糖中的一种；优选的，所述骨架剂为海藻糖。3.根据权利要求1所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，所述粘合剂选自明胶、普鲁兰多糖中的一种；优选的，所述粘合剂为普鲁兰多糖。4.根据权利要求1所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，所述助悬剂选自黄原胶、普鲁兰多糖中的一种；优选的，所述助悬剂为黄原胶。5.根据权利要求1所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，所述glp1多肽-mev原液的制备原料包括：每毫克glp1多肽，加入0~1.2mg辅料和1
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13 mev颗粒；所述辅料选自多聚赖氨酸、鱼精蛋白、多聚精氨酸、岩藻糖或甘露醇中的一种，优选的，所述辅料为多聚精氨酸。6.根据权利要求1所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，所述glp1多肽为利拉鲁肽。7.根据权利要求1~6中任一项所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，其中包含如下质量百分数的原料：30%~50% 利拉鲁肽-mev原液、0.1%~1.0% 泊洛沙姆188 、3%~5% 海藻糖、1%~3% 普鲁兰多糖、0.01%~1%黄原胶，余量为水。8.根据权利要求1所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，所述glp1多肽为司美格鲁肽。9.根据权利要求1~5或8中任一项所述的glp1多肽药物冻干口崩片，其特征在于，其中包含如下质量百分数的原料：30%~50% 司美格鲁肽-mev原液、0.1%~1.0% 泊洛沙姆188 、3%~5% 海藻糖、1%~3% 普鲁兰多糖、0.01~1%黄原胶、余量为水。10.权利要求1~9任一项所述的glp1多肽药物冻干口崩片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)glp1多肽向mev的装载，获得glp1多肽-mev原液；(2)glp1多肽-mev原液经超滤浓缩后，获得浓缩液，(3)取表面活性剂、骨架剂、粘合剂、助悬剂、甜味剂和矫味剂混合后，加入浓缩液，得到药液；(4)将步骤（3）中的药液进行剪切；(5)将步骤（4）中剪切后的药液进行脱气；(6)将步骤（5）中脱气后的药液灌装至窝槽中；(7)将灌装完的药液预冻；(8)将预冻完成的药品冻干，设定初始温度为-30 ℃，具体冻干过程如下：冷浸温度：≤-40 ℃；真空控制：≤200 ubar板层温度：由-30 ℃升至-25 ℃，5分钟；维持-25℃，60分钟；由-25 ℃升至-15 ℃，10分钟；维持15 ℃，60分钟；由-15 ℃升至-5 ℃，10分钟；维持-5℃，60分钟；由-5 ℃升至10 ℃，25分钟；维持10 ℃，100分钟，由10 ℃升至25 ℃，15分钟；维持25 ℃，60分钟。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述glp1多肽向mev的装载包括：将glp1多肽溶液与牛奶外泌体溶液混合后进行超声处理，所述glp1多肽溶液中，溶剂为含有100 mm nacl 的20 mm tris缓冲液，ph值为8.0；所述牛奶外泌体溶液中，溶剂为含有100 mm nacl 的20 mm tris缓冲液，以含有甘氨酸的na2co3/nahco3缓冲液调节ph值为7.0~10.0；所述超声处理的条件包括：99%功率， 5℃，超声处理12h。12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述glp1多肽-mev原液的超滤浓缩包括：将glp1多肽-mev原液以含有peg3350的pbs缓冲液溶解后，上截留分子量为750kda的中空纤维柱，流速为405ml/min，浓缩至体积为原液的1/20。13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述剪切的转速为 100-3000 rpm，所述剪切时间为 3-20分钟；优选的，所述乳化机的转速为300 rpm，所述剪切时间为 10分钟。14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述预冻温度为
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60到-80℃；优选的，所述预冻温度为-60 ℃。15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述预冻时间为10-100分钟；优选的，所述预冻时间为30分钟。

技术总结
本发明提供了GLP1多肽药物冻干闪释片及其制备方法，本发明提供的GLP1多肽药物冻干口崩片包含如下质量百分数的原料：30%~50%GLP1多肽-mEV原液、0.1%~1.0%表面活性剂、3%~5%骨架剂、1%~3%粘合剂、0.01%~1%助悬剂，余量为水。所述GLP1多肽为载利拉鲁肽和司美格鲁肽其中一种或多种。本发明还提供了GLP1多肽药物冻干闪释片的制备方法，该闪释片采用冷冻干燥技术制备，所得产品装载量大、溶出效果好，利于GLP1多肽的口腔吸收。并且该闪释片的制备方法简便，易于实施。易于实施。


技术研发人员：王伊 董亚南 李艳芳 王洪飞 李鹏飞
受保护的技术使用者：谛邈生物科技（北京）有限公司
技术研发日：2023.08.28
技术公布日：2023/10/7