一种抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FlgE的驼源纳米抗体及其制备方法和应用

一种抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flge的驼源纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flge的驼源纳米抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.单域抗体是指一类在骆驼科动物体内发现的天然缺失轻链和重链恒定区的重链抗体(heavy chain antibodies,hcab)，其重链部分由两个恒定结构域(ch2和ch3)和一个被称为纳米抗体或vhh(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)或单域抗体(single domain antibody,sdab)的可变结构域组成，由比利时科学家hamers-casterman等在1993年首次报道，随后在鳐鱼、护士鲨等深海鱼类中也发现了相似的单域抗体。随着抗体工程技术的研究策略、规模和速度日益增长，抗体已成为基础研究、疾病诊断和疾病治疗等领域的首选工具，为现代生物医学治疗癌症、免疫疾病、传染病、血液系统疾病、呼吸系统疾病、神经系统疾病、遗传病等疾病提供新的方案。
3.随着对蛋白质结构、功能和应用等领域的探索，较小的抗体片段越来越成为科研人员的焦点，纳米抗体对抗原有极强靶向和结合能力，其尺寸小，但特异性和亲和力高，自发现以来，针对无数靶点的特异性纳米抗体被人们研究，抗体平台技术的构建更为临床应用的多元化铺平道路，可以快速、高效的获取纳米抗体序列，这些来自驼科或软骨鱼独特的抗体片段容易经过基因工程改造，设计创新多域构建体进行新的研究探索，应用前景广阔。
4.鼠伤寒沙门氏菌是一种感染人类和动物的常见肠道病原体，可引起多种胃肠道甚至全身性疾病。鼠伤寒沙门氏菌致病机制研究热点主要聚焦在感染和侵入两部分，许多毒力因子在附着、入侵、躲避宿主防御机制从而定植宿主等过程中起着极其重要的作用，包括iii型分泌系统(typeⅲsecretion system,t3ss)、毒力质粒(pslt)、黏附素、致病岛(spi)、鞭毛、菌毛等，包括沙门氏菌在内许多细菌细胞表面的鞭毛除了赋予其运动性外，还参与了菌膜形成和上皮细胞的粘附等重要的生物学过程，增强细菌致病性。鞭毛结构上主要分三部分：鞭毛丝(filament)、鞭毛钩(hook)、基体(basal body)，鞭毛钩由flge蛋白(flge基因编码)组成，是鞭毛基部的弯曲结构，存在于革兰氏阴性菌细胞表面，连接鞭毛丝和基体，对鞭毛合成和运动、增强细菌致病性至关重要。经过研究，目前已开发出多种鞭毛蛋白的单克隆抗体并建立快速检测沙门菌阻断elisa检测方法。
5.目前仍亟需制备为胃肠道感染替代抗生素疗法的纳米抗体，并为口服化活性抗体制剂的开发提供重要的理论依据。
6.背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

7.为解决现有技术中的技术问题，本发明人通过深入研究，制备了一种抗flge鞭毛
蛋白的驼源纳米抗体，从而为胃肠道感染替代抗生素疗法的开发提供思路和手段，同时为口服化活性抗体制剂的开发提供重要的理论依据。具体地，本发明包括以下内容。
8.本发明的第一方面，提供一种单域抗体或其抗原结合片段，其能够靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白，所述单域抗体含有选自seq id no.:1-3任一项所示的氨基酸序列的重链可变区。
9.在某些实施方案中，根据本发明所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体具有(i)或(ii)所示的氨基酸序列：
10.(i)与seq id no.:1-3所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，还优选至少98％，最优选至少99％同源性的氨基酸序列；
11.(ii)与seq id no.:1-3所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列；
12.其中，由(i)或(ii)所示的氨基酸序列得到的变体抗体或其抗原结合片段依然保持能够靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白的结合活性。
13.在某些实施方案中，根据本发明所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为嵌合抗体、骆驼源或其人源化抗体中的至少一种。
14.在某些实施方案中，根据本发明所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，其具有针对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白结构域小于2.089nm的kd。
15.本发明的第二方面，提供一种用于病原菌感染预防、改善或治疗的药物组合物，其包含第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段。
16.本发明的第三方面，提供一种分离的核酸分子，其中，其编码根据第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段。
17.本发明的第四方面，提供一种载体，其中，其包含第三方面所述的分离的核酸分子。
18.本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，其中，其包含根据第四方面所述的载体。
19.本发明的第六方面，提供一种单域抗体或其抗原结合片段的制备方法，其中，包括在适于培养的条件下培养第五方面所述的宿主细胞，并分离所述单域抗体或其抗原结合片段的步骤。
20.本发明的第七方面，提供试剂在用于制备预防、改善或治疗病原菌感染相关疾病的药物中的用途，其中，所述试剂包括根据第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段。
21.本发明的第八方面，提供根据本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段在与其它药物联合用药中的用途。其它药物包括但不限于：诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
22.本发明提供的抗flge鞭毛蛋白的驼源纳米抗体具有针对flge蛋白较高的亲和力，能够与鼠伤寒沙门氏菌有效结合并触发细菌凝集反应，这为胃肠道感染替代抗生素疗法的开发提供思路和手段，同样为口服化活性抗体制剂的开发提供重要的理论依据。
附图说明
23.图1是本发明示例性实施例的纯化后的纳米抗体：vhh-c4、vhh-c5的sds-page考马斯亮蓝染色图。
24.图2是本发明示例性实施例的vhh-c5的elisa结合特性检测图。
25.图3是本发明示例性实施例的vhh-c5的bli(bio-layer interferometry,bli)亲和力检测图。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其它陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.本说明书中提供了相应氨基酸的具体序列，同时根据相关规定，本技术还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是，计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考，在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下，以本说明书中的序列内容为准。
30.除非另有说明，“抗体”一词应被理解为包含其功能抗体片断。这一术语还包括完整的或全长抗体，包括任何子类的抗体，包括igg和它的子类，igm，ige，iga和igd。
31.抗体的重链可变区和轻链可变区通常包括3个互补决定区cdr和4个骨架区fr。互补决定区之间通过骨架区连接，在识别抗体时，fr分子卷曲使cdr分子相互靠近。互补决定区为抗体或抗原结合片段与抗原的结合部位，因此，互补决定区的序列决定了抗体的特异性。如本领域所理解，抗体是包含通过二硫键互连的至少两个重(h)链和两个轻(l)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)。轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)。重链和轻链的可变区包含框架区(fr)和互补决定区(cdr)。四个fr是相对保守的，而cdr区域(cdr1、cdr2和cdr3)包含高变区。
32.本文的抗体也称为“单域抗体”、“纳米抗体”或“vhh”。单域抗体是包括抗体的全部或部分重链可变域或全部或部分的轻链可变域的抗体片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单域抗体仅含有重链可变区(vh)，而不含有轻链可变区。
33.本文中的“抗原结合片段”是指多肽片段，其包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区，并且具有能够特异性靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flge的特性。优选地，其含有抗体重链可变区的至少一个cdr。还优选地，其可以含有重链可变区的cdr1-3。抗原结合片段可以通过多种技术制备，包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化，
或由包含抗原结合片段的宿主细胞表达产生。
34.在没有限定或理论约束的情况下，包含重链可变区cdr1、cdr2、cdr3单域抗体或其抗原结合片段可在下述范围内随机选择：具有seq id no.:1-3所示氨基酸序列的抗原互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区。
35.本发明中，单域抗体或其抗原结合片段具有(i)或(ii)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：(i)与seq id no.:1-3所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，还优选至少98％，最优选至少99％同源性的氨基酸序列；(ii)与seq id no.:1-3所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列，需要说明的是上述同源性(本文有时也称为“同一性”)序列不会改变抗原与本发明的抗体结合特性，即选自由(i)或(ii)所示的氨基酸序列得到的变体抗体或其抗原结合片段依然保持能够靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白的结合活性。
36.优选地，本发明中的上述氨基酸序列可以经宿主密码子偏好性改造序列后通过表达得到的序列。本发明中，经宿主密码子偏好性改造是指为了适应于不同宿主表达的需要，根据简并密码子来对碱基序列进行碱基替换，密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。
37.在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。在另一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是骆驼源。
38.在一个方面，本文公开了一种分离的骆驼源单域抗体，其特异性结合鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flge中的抗原表位。在一个方面，所述分离的骆驼源单域抗体源自骆驼、美洲驼、羊驼(vicugnapacos)、小羊驼(vicugnavicugna)或者原驼(lama guanicoe)。在一个实施方案中，所述骆驼是指单峰骆驼(camelusdromedarius)、双峰骆驼(camelusbactrianus)或者野生双峰骆驼(camelusferus)。在本发明中公开的任一实施方案中，可以使用结合多种抗原的多种抗体，例如可以使用来自同种骆驼的结合相同或不同抗原上的多个不同抗原表位的多个抗体。在其他实施方案中，可以使用来自于多个品种(比如来自于多个骆驼品种)的多个抗体，其中所述抗体可以是对相同表位具有特异性，或对相同或不同抗原上的不同表位具有特异性。
39.变体抗体也都被包括在本发明的范围内。在本发明对变体的序列不特别限定，只要其具有靶向flge鞭毛蛋白的结合特性，或具有提高的亲和力的抗体即可，具有这样序列的其它变体可以使用本领域已知的方法得到，并都包括在本发明的范围内。本领域技术人员利用用于生产变体多肽的重组方法和/或合成化学技术可以修改多肽的氨基酸序列。例如，可以使用氨基酸置换得到具有进一步提高的亲和力的抗体。可选地，可以使用核苷酸序列的密码子优化来提高在用于生产抗体的表达系统中的翻译效率。这样的变体抗体序列与在本发明中列举的序列具有80％或更高的(即，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。相对于在本发明中列举的序列，计算所述序列同一性。或进行最佳比对时，如通过程序gap或使用默认值间隙权重的bestfit。
40.本发明的单域抗体还可以具有氨基酸的修饰，本文所用术语“修饰”是指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。本发明的单域抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割
或非天然发生的氨基酸修饰等。
41.保守氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸及苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天门冬酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体cdr区中的一个或多个氨基酸残基。
42.另一类可能存在的可变区修饰是突变vh的cdr1、cdr2和/或cdr3区中的氨基酸残基以改进目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以通过定点诱变或pcr介导的诱变来导入突变。优选导入(如上所述的)保守修饰。突变可以是氨基酸的取代、添加或缺失，但优选为取代。此外，cdr区中残基变化通常不超过一个、两个、三个、四个或五个。
43.本发明中，“亲和性”是指分子的单个结合位点(例如，抗原)和其结合配体(例如，抗体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，本发明中所使用的“结合亲和性”指的是内在的结合亲和性，它反映了结合对(例如抗体和抗原)成员之间1:1的相互作用。分子x对其配体y的亲和性通常由离解常数(kd)表示。亲和性可以用本领域常见的方法来衡量，对此不特别限定。
44.本发明提供了一种分离的核酸，其编码如前所述的单域抗体或其抗原结合片段。
45.本发明提供了一种载体，其包括本发明所述的分离的核酸。载体可以为表达载体或克隆载体。在一些实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。
46.本发明提供了一种宿主细胞，其包括上述的载体。用于克隆或表达dna的合适宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
47.本发明提供了一种抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flge的驼源纳米抗体的制备方法，其包括培养上述的宿主细胞。优选地，所述制备方法的培养条件足以使宿主细胞能够表达抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flge的驼源纳米抗体。
48.需要说明的是，将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入宿主细胞。用于将载体引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于将核酸或载体引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的体系(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外递送媒介物的示例性胶体体系是脂质体(例如人工膜囊泡)。用于将核酸或载体引入宿主细胞的生物方法包括使用dna和rna载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞的最广泛使用的方法。在一些实施方案中，转导的或转染的宿主细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。
49.在一些实施方案中，所述制备还包括进一步评估或筛选转导的或转染的宿主细胞以选择经改造的宿主细胞。
50.本发明进一步提供了一种药物或药物组合物，其包括本发明所述的单域抗体或其
抗原结合片段、所述的分离的核酸、所述的载体中的至少一种。
51.在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
52.药物组合物可以通过使具有所需纯度的活性药剂与任选的药学上可接受的载剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，可包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂和表面活性剂中的至少一种。此外，为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。
53.在一些实施方案中，药物组合物可以含有：细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。添加剂的具体添加量可根据实际需要进行调整。
54.本发明还提供了试剂在用于制备预防、改善或治疗病原菌感染相关疾病的药物中的用途，其中，所述试剂包括根据本发明所述的单域抗体或其抗原结合片段。
55.本发明还提供一种治疗/与预防病原菌感染相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物的步骤，其中所述药物包括本发明所述的单域抗体或其抗原结合片段。
56.本文所用术语“受试者”和“患者”在本文中互换地用于指可能需要本文描述的抗体相关制剂或药物、治疗的任何动物。受试者和患者因此包括但不限于：灵长类动物(包括人类)、犬科动物、猫科动物、鼠和其它哺乳动物受试者。优选地，所述受试者是人类。
57.在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如病原菌感染相关疾病的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
58.本文所用术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。通常，本文中的有效量根据各种因素而变化，所述因素例如给定的药物或化合物、药学制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。本发明的化合物的有效量可以由本领域技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。
59.本发明中，病原菌感染相关疾病是指伤寒沙门氏菌相关疾病，例如伤寒、副伤寒、沙门氏菌感染、肠道出血性大肠杆菌感染、肺炎、肠结核等。
60.本发明还提供根据本发明所述的单域抗体或其抗原结合片段在与其它药物联合用药中的用途。优选地，所述其它药物包括诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
61.本领域技术人员可以理解的是，本发明的单域抗体可以结合到可检测标记上。在一个方面，所述可检测标记选自比色标记、放射性标记、酶标记、发光标记或荧光标记。在某
些实施方案中，所述可检测标记可以是可溶的标记或粒子(例如纳米粒子或微粒)或微粒状的标记。在某些实施方案中，所述分离的骆驼源单域抗体可以附着到固体表面，例如印迹、薄膜、薄片、磁珠、粒子(比如纳米颗粒或微粒)、分析板、芯片、载玻片、微量滴定板或elisa板。
62.在一个方面，本文公开了一种检测样品中鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的方法，所述方法包含使样品中鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白和本发明的所述的分离的骆驼源单域抗体接触的步骤，以及通过检测分离的骆驼源单域抗体和样品中所述鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白之间形成的多肽-抗体复合物来评估样品中鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的有无和/或定量。在一个方面，所述样品来自于受试者，例如哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人类。在上述任一实施方案中，所述样品可以是生物样品，例如血浆样品、血清样品、尿样、组织样品和口腔擦拭物等。
63.实施例1
64.本实施例为天然纳米抗体噬菌体文库的构建与纳米抗体的淘筛。
65.1.骆驼取血与淋巴细胞分离
66.以20只健康未经免疫的骆驼外周血和2只骆驼脾脏为样本，取50ml无菌离心管，加入20ml分离液，后缓慢加入20ml稀释过的血液样本，20℃环境下，650g离心30min。离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。小心吸取血浆层转移到新离心管a中。小心吸取离心管中的环状乳白色淋巴细胞层转移到新离心管b中，向含有淋巴细胞的离心管b中，加入10ml清洗液，混匀细胞，250g，离心10min，弃上清。用吸管吸取5ml清洗液重悬所得细胞。250g，离心10min，弃上清。混匀细胞。250g，离心10min，弃去上清。用吸管吸取5ml清洗液重悬所得细胞。250g，离心10min，弃去上清。用0.5ml清洗液重悬所得细胞。
67.2.骆驼总rna的提取
68.(1)将提前获得的淋巴细胞从-80℃冰箱内取出；
69.(2)将样品在冰上(15-30℃)放置完全解冻后，使核酸蛋白复合物完全分离；
70.(3)每使用1ml trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；
71.(4)2-8℃，10,000rpm离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在上层水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60％，一般吸取550μl，最多600μl；
72.(5)把上层水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的rna，每使用1ml trizol加入0.5ml异丙醇，常温温放置10min；
73.(6)在4℃，10,000rpm离心10min，离心前看不出rna沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清；
74.(7)用75％乙醇洗涤rna沉淀。每使用1ml trizol至少加1ml 75％乙醇，2-8℃不超过7,500rpm离心5min，弃上清；
75.(8)室温放置干燥或真空抽干rna沉淀，5-10min即可，加入25-200μl无rnase的水，用枪头吹打多次；
76.(9)立刻取1-2μl进行琼脂糖凝胶电泳，其余于-80℃保存。
77.3.rna逆转录
78.使用thermoscript rt mastermix cdna反转录试剂盒进行实验，反应体系如下表1：
79.表1
[0080][0081]
pcr反应条件如下表2：
[0082]
表2
[0083][0084]
将模板rna和5
×
thermo rt mastermix在冰上解冻，无核酸酶h2o在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，可简短离心收集残留在管壁的液体到管底，按照表配置反应液吹打混匀于pcr仪中进行逆转录，得到的cdna产物可立即用于下一步反应，或在-20℃保存。从rna提取到逆转录整个过程避免rnase污染。
[0085]
4.dna的磁珠纯化
[0086]
(1)200μl上述cdna，加入400μl磁珠，室温旋转10min(cdna体积不应少于100μl，否则影响实验效果)；
[0087]
(2)放置磁力架5min，小心除去上清；
[0088]
(3)加入500μl 80％乙醇小心吹打均匀进行洗涤，磁力架放置5min；
[0089]
(4)保持管子在磁力架上，加入500μl 80％乙醇孵育30s进行2次洗涤，小心除去上清；
[0090]
(5)开盖晾干5min，使磁珠处于龟裂状态；
[0091]
(6)加入60μl ddh2o，移液枪反复吹打室温放置10min；
[0092]
(7)磁力架上放置5min，上清即为纯化dna。
[0093]
5.vhh基因的扩增
[0094]
以经过反转录以及磁珠纯化后cdna为模板，利用引物进行第一轮pcr扩增，反应体系如表3所示：
[0095]
表3
[0096][0097]
反应程序如表4所示：
[0098]
表4
[0099][0100]
第一轮pcr扩增结束后，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，且以第一轮pcr的扩增产物作为第二轮pcr反应模板，利用引物进行扩增，反应体系如表5所示：
[0101]
表5
[0102][0103]
反应程序如表6所示：
[0104]
表6
[0105][0106]
用1％的琼脂糖凝胶电泳对第二轮pcr产物进行检测，在凝胶成像仪下用将目的条
带切下，用dna纯化回收试剂盒进行回收。用nanodrop-1000测定酶切回收载体的浓度，标记后放置于-20℃长期保存备用。
[0107]
6.载体与目的片段酶切
[0108]
将padl-23c载体质粒与目的片段分别用限制性内切酶bgl i酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认酶切成功，切胶回收后测定浓度用于连接反应，酶切体系如下：
[0109]
表7
[0110][0111]
孵育37℃，酶切2h，再加4μl quick cip，继续酶切1h后切胶回收并测定浓度。
[0112]
表8
[0113][0114]
孵育37℃，酶切3h，二轮pcr回收产物酶切后回收并测定浓度。
[0115]
7.padl-23c载体与vhh目的片段连接
[0116]
使用t4连接酶4℃连接过夜，连接体系如下：
[0117]
表9
[0118][0119]
使用t4连接酶4℃连接过夜，65℃加热10min或者70℃加热5min灭活，随后使用quick gel extraction kit对连接产物进行纯化，超纯水溶解后用nanodrop-1000测定连接产物的浓度以及od260/od280的比值。
[0120]
8.tg1电转化感受态细胞制备
[0121]
取tg1感受态细胞划线，大量培养制备感受态细胞。
[0122]
9.电转化
[0123]
使用bio-rad电击杯，本实验室保存的tg1电转感受态细胞，将上述步骤得到的连接产物进行电击转化。
[0124]
(1)电击杯清洗：超纯水冲洗5次；0.2m hci加入比色皿，静置勿超过10min；用70％的无水乙醇冲洗5次；超净工作台加入无水乙醇清洗一次；紫外风干1h，放入4℃冰箱预冷，备用；
[0125]
(2)电击转化：将电击杯和10％甘油提前放入冰箱预冷，提前设置电转仪转化程序，将回收后的连接产物加入制备好的感受态细胞，轻轻混匀与已预冷的电击杯置于冰上，将细菌与dna混合物加至冷的电击杯内，设置电击参数，立刻电击，迅速加入培养基，最终转移至培养瓶中37℃培养1h，涂板计数，过夜生长。将过夜生长后的培养板上的菌用lb培养基和涂布棒冲洗刮下，加入甘油后保存在-80℃。
[0126]
10.扩增和纯化噬菌体文库
[0127]
取构建的天然文库到200ml 2
×
yt液体培养基中，使初始od值约为0.1，再加入amp抗生素，在37℃，200rpm下培养至od值约为0.5时，加入200μl辅助噬菌体继续侵染1h后加入kana抗生素，摇床设定为25℃，200rpm过夜培养，次日将菌液转移至50ml离心管4℃，10,000rpm离心30min，取全部上清并加入1/5体积即40ml peg6000，转移至离心瓶置于冰盒中，在台式摇床中孵育60min，4℃离心机预冷，以10,000rpm离心30min，去上清，可在管壁看到明显噬菌体沉淀，沉淀一共用3-5ml 1
×
pbs重悬溶解，12,000rpm 4℃离心5min防止菌体残留。取上清于新ep管中，12,000rpm，4℃离心2min。测浓度：每1od268＝5
×
10
13
cfu/ml，经计算最后天然库噬菌体浓度为4.8
×
10
13
cfu/ml。
[0128]
11.纳米抗体的淘选
[0129]
取出由-80℃冰箱保存的甘油菌tg1，划线至无抗lb平板，37℃倒置过夜培养；取两根免疫管，管上标记好对照和实验组，100μg纯化的flge重组抗原蛋白溶于3ml 1
×
pbs溶液，包被在实验组中，对照组免疫管中加入5％脱脂牛奶，4℃孵育过夜；第二天，将两根免疫管中包被液体倒出，离心并吸去管中残留液体，用1
×
pbs清洗一遍，都加入5ml 5％的脱脂牛奶，室温静置2h；在静置1h时取1ml的天然纳米抗体库噬菌体(1
×
10
13
cfu/ml左右，第二轮降低一个数量级)加入1ml 5％的脱脂奶粉在旋转混合仪上旋转1h，对照组静置1h后倒去封闭液，用1
×
pbs清洗一遍，吸干后将旋转1h的天然库噬菌体全部加入对照组，继续加入1ml 5％脱脂奶粉混匀，继续放置1h；2h后将实验组中封闭液倒干，吸去残留液体，将对照组中噬菌体加入静置1h，对照组用1
×
pbs清洗三遍，加入5ml pbs静置；实验组静置1h后用封口膜封口置于旋转混合仪上旋转孵育1h；倒去实验组和对照组中液体，加入1
×
pbst 3ml封口旋转5min，各清洗3遍(后续淘选可增加清洗次数至6遍)，每次清洗注意倒干，稍离心并吸干残留液体，洗去非特异性结合噬菌体，再用1
×
pbs各洗2遍；实验组与对照各加入1ml 0.1m的hcl，封口膜封口后旋转8min洗脱噬菌体，立即加入500μl ph为7.4的1m tris-hcl进行中和；洗脱下来的phage溶液分别加入到含有10ml的tg1溶液中，做好标记，在37℃摇床中培养1h。取适量菌液，以10-4
和10-5
稀释计数，实验组剩余菌液离心稀释涂固体平板。几轮筛选后计数板菌落数出现较明显的差异，说明已成功富集和筛选出阳性噬菌体，可进入下一步噬菌体elisa验证。
[0130]
结果说明：第一轮淘选，使用100μg纯化的flge重组蛋白为抗原，投入1
×
10
13
cfu/ml的天然纳米抗体噬菌体，第二轮开始降低抗原量和噬菌体的投入量，第三论实验组计数
与富集比均大大增长，说明文库中成功富集到抗flge的噬菌体。
[0131]
12.phage elisa验证
[0132]
96深孔培养板中每孔加入800μl 2
×
yt培养基(amp+)，用灭菌后牙签挑取实验组计数板上的单克隆接种到深孔中，封口在37℃，200rpm摇菌培养4h左右，将110μl辅助噬菌体m13ko7加入11ml 2
×
yt液体培养基，向96深孔板中每孔加入100μl，37℃，200rpm继续培养1h，将110μl的50μg/ml卡那霉素加入11ml 2
×
yt液体培养基，向96深孔板中每孔加入100μl，25℃，200rpm过夜培养，第二天在水平离心机中于1500rpm，30min，放入4℃冰箱备用。
[0133]
取两块96孔elisa板包被抗原蛋白，取10μg纯化的flge重组蛋白，用pbs稀释，100ng/孔，对照组每孔加入300μl pbs配制的5％脱脂牛奶，4℃过夜孵育；第二天倒干两块elisa板中液体，各用1
×
pbst洗一遍，每孔加入300μl 5％脱脂牛奶，37℃培养箱封闭2h；倒干两块板中液体，各用1
×
pbst洗一遍，每孔加入100μl离心后的噬菌体上清，摇床室温孵育2h；随后用1
×
pbst将两块板各清洗9遍，倒干板内残留，并向每孔加入100μlmouse anti-m13(hrp)(1％脱脂牛奶，1：20000稀释配制)，室温水平摇床孵育1h；继续用1
×
pbst将两块板各清洗9遍，倒干板内残留，并向每孔加入100μl tmb显色液，待有明显颜色变化(勿超过10min)，立即加入100μl0.12m硫酸终止，酶标仪读取吸光值od450 nm结果。找出实验组和对照组od值相差大于5倍的对应孔，提取对应孔菌液质粒，并进行测序及分析。
[0134]
结果说明：phage elisa结果显示，与对照组相比有26条od450测定比值十倍以上的样品，其中最大的读数值达到了25.98，最小读数值为10.43，读数值均较高，从侧面反应这些序列对flge有较高的亲和力。
[0135]
3条能够与flge结合的序列：
[0136]
结果说明：将26个阳性克隆测序，共检测到3条有意义的不同序列，如表10所示，所筛选到的能与flge结合的序列均符合vhh的结构。
[0137]
表10
[0138][0139]
实施例2
[0140]
本实施例示出了flge特异性纳米抗体的表达与纯化。
[0141]
1.将淘选到针对flge蛋白的纳米抗体a5、c4、c5序列构建至padl-23c-avi-fkpa载体上。从-80℃冰箱取出提前制备好的dh5α感受态细胞，迅速插入冰中，置于冰上融化，将上述连接产物全部加入感受态细胞中，并用手拨打ep管底轻轻混匀，冰上放置30min，42℃水浴热激90s，立即放入冰上静置5min，加入1ml lb液体培养基在37℃摇床孵育45min，低速离心1min移除1ml上清，混匀后涂布于在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板上，于37℃恒温培养箱将平板倒置过夜培养，挑克隆鉴定后提取测序结果正确的克隆对应质粒，使用
nanodrop测质粒的浓度。
[0142]
2.质粒的转化
[0143]
取出感受态细胞wk6，置于冰上融化，将成功构建的质粒padl-23c-avi-fkpa-c5取1μl转化至wk6感受态细胞，冰浴30min；42℃水浴热激90s进行热休克；迅速放入冰浴5min；加1ml lb液体培养基轻轻混匀，37℃，200rpm震荡活化1h；无菌转移至ep管，4000rpm室温离心2min，移除950μl上清；其余混合物吹打混匀，滴至含氨苄抗性的lb平板上，用酒精灯烧过的玻璃棒或灭菌过的玻璃珠涂布均匀，37℃倒置过夜培养。
[0144]
3.纳米抗体的诱导表达及纯化
[0145]
平板上挑取单克隆于5ml tb(amp+)培养基中，37℃，200rpm过夜培养，次日1：100转接至200mltb培养基(用前加入1/1000的葡萄糖和硫酸镁溶液)中，振摇至od600至0.5左右，加iptg至终浓度为1mm，继续置于28℃摇床过夜培养，4℃，9,000rpm，离心30min收集菌体沉淀。
[0146]
将离心得到的细胞沉淀重悬于6ml冰冷的tes缓冲液中，并放置在水平摇床上4℃轻轻摇动孵育1h，然后添加12ml预冷的tes/4缓冲液，然后继续轻轻摇动45min。通过在4℃下10,000rpm离心30min尽可能去除细胞碎片，取上清过0.45μm滤器，取过滤上清纯化，将12ml亲和层析柱固定在铁架台上，依次去掉下、上两端柱塞，加入1ml protein iso-ni-nta resin，流干预装柱的保护液。向层析柱管中轻轻加入10ml预冷的buffer a(300mm nacl，50mm nah2po4，20mm咪唑)溶解于1l超纯水中，ph调至8.0。用于柱平衡，流尽buffer a。将beads吸出与待纯化的上清放入50ml离心管中在4℃旋转混匀仪上结合1h 30min。将结合后的上清样品小心加入层析柱管，并收集流穿液。向柱管轻轻加入5ml buffer a冲洗柱管5遍，除去非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。加入1ml的250mm咪唑洗脱目的蛋白，将层析柱放入4℃旋转混匀仪上结合30min，收集洗脱液。加入1ml的buffer b(300mm nacl，50mm nah2po4，500mm咪唑)，将层析柱放入4℃旋转混匀仪上旋转结合30min将目的蛋白洗脱完全，收集流出液与洗脱液进行蛋白浓度测定及sds-page鉴定。
[0147]
通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定蛋白的纯度(见图1)，纯化后蛋白的纯度均大于90％，并使用pierce
tm bca蛋白定量试剂盒检测蛋白的浓度，纯化的vhh-c4、vhh-c5的浓度分别为：0.10mg/ml、0.3mg/ml。
[0148]
实施例3
[0149]
本实施例为纳米抗体结合特性测定。
[0150]
(1)包板：取两块96孔elisa板，取5μg纯化的fkpa-c5重组蛋白用5ml pbs溶液配制混合均匀，每孔加100μl混合液包被(每孔包被100ng蛋白)实验组，对照组为每孔300μl 5％脱脂牛奶，做好标记4℃过夜孵育；
[0151]
(2)封闭：两块板各用1
×
pbst洗一遍，每孔300μl 5％脱脂牛奶，37℃培养箱封闭2h；
[0152]
(3)纳米抗体抗体孵育：两板各用1
×
pbst洗一遍，蛋白上清用pbs从1μm开始连续十倍稀释8个梯度到0.1pm，包被的板每孔加入100μl，每个浓度设置三组平行，室温孵育2h；
[0153]
(4)his标签抗体孵育：用1
×
pbst将两块板各洗9遍，每孔均加入100μl his-mouse工作液(anti-antibody hrp，1％脱脂牛奶1：5000稀释配制)，室温水平摇床孵育2h；
[0154]
(5)hrp标记igg抗体孵育：用1
×
pbst洗两块板各9遍，每孔均加入100μl hrp标记
的羊抗鼠igg工作液(anti-antibody hrp，1％脱脂牛奶1：10000稀释配制)，室温水平摇床孵育1h；
[0155]
(6)显色：两板均用1
×
pbst洗9遍，每孔均加入100μl tmb显色液(注意避光)，待有明显颜色变化时(室温5-10min)，立即加入50μl 0.2m硫酸终止液终止显色反应；
[0156]
(7)读板：记录两板酶标仪检测od450读值，绘制曲线。
[0157]
结果如图2：elisa检测vhh-c5结合效力图。横坐标表示孵育的抗体浓度的10对数值，纵坐标表示检测的吸光度，曲线为vhh-c5浓度的10对数值与检测吸光度的关系模拟曲线。模拟分析的vhh-c5的半最大效应浓度(ec50)为2.089nm。
[0158]
2、纳米抗体亲和力测定
[0159]
采用生物膜干涉技术(bio-layer interferometry,bli)鉴定纯化纳米抗体与抗原的亲和力，取1mg抗原蛋白加1ml pbs，使其终浓度为1mg/ml，加入10mg/ml的nhs-biotin溶液混合均匀(nhs-biotin溶液用dmso溶解)，室温孵育30min或4℃孵育1h，然后用pbs透析过夜(透析袋选择截留分子小于目标蛋白分子量的3倍)，至少更换三次透析液，测定蛋白浓度并梯度稀释，设置以下程序：
[0160]
表11bli程序
[0161][0162]
结果如图3：bli检测vhh-c5与纯化的flge蛋白亲和力图。kd值反映了相互作用结合能力的大小，kon＝结合常数(ka，单位为m-1s-1)，koff＝解离常数(kd，单位为s-1)，其反映了复合物的稳定性，实验共设置400、200、100、50四个浓度梯度的抗原，其kd(m)值为3.374e-08，r2＝0.978，x2＝0.0016，结合速率常数(ka)为2.943e04(1/ms)，解离速率常数(kdis)为9.930e-04(1/s)，表明纯化的vhh-c5与flge蛋白具有较好的亲和力。一种靶向肿瘤坏死因子(tnfα)的鲨源特异性纳米抗体vnar
3b11
(kd)值到达2.76e-08(m)。
[0163]
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

技术特征：
1.单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其能够靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白，所述单域抗体含有选自seq id no.:1-3任一项所示的氨基酸序列的重链可变区。2.根据权利要求1所述的单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有(i)或(ii)所示的氨基酸序列：(i)与seq id no.:1-3所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，还优选至少98％，最优选至少99％同源性的氨基酸序列；(ii)与seq id no.:1-3所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列；其中，由(i)或(ii)所示的氨基酸序列得到的变体抗体或其抗原结合片段依然保持能够靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白的结合活性。3.根据权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗体为嵌合抗体、骆驼源或其人源化抗体中的至少一种。4.根据权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其具有针对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛flge蛋白结构域小于2.089nm的kd。5.一种用于病原菌感染预防、改善或治疗的药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1-4任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段。6.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码根据权利要求1-4任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段。7.一种载体，其特征在于，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子。8.一种宿主细胞，其特征在于，其包含根据权利要求7所述的载体。9.根据权利要求1-4任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，包括在适于培养的条件下培养宿主细胞，并分离所述单域抗体或其抗原结合片段的步骤。10.试剂在用于制备预防、改善或治疗病原菌感染相关疾病的药物中的用途，其特征在于，所述试剂包括根据权利要求1-4任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段。

技术总结
本发明公开一种抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FlgE的驼源纳米抗体及其制备方法和应用，该纳米抗体能够靶向鼠伤寒沙门氏菌鞭毛FlgE蛋白，其含有抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，其中，该抗体含有选自SEQ ID NO.1-3任一项所示的氨基酸序列的重链可变区。本发明提供的抗FlgE鞭毛蛋白的驼源纳米抗体具有针对FlgE蛋白较高的亲和力，能够与鼠伤寒沙门氏菌有效结合并触发细菌凝集反应，这为胃肠道感染替代抗生素疗法的开发提供思路和手段，同样为口服化活性抗体制剂的开发提供重要的理论依据。的理论依据。的理论依据。


技术研发人员：郝秀静 李敏 孙山
受保护的技术使用者：宁夏大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/10/7