一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法与流程

1.本发明涉及一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.酒精性肝病(alcoholic liver disease，ald)是常见的肝脏疾病之一，长期大量饮酒导致的中毒性肝损伤甚至肝功能衰竭严重危害人民健康。研究表明，全球有5.1％的疾病是由于酒精消耗引起的，有害饮酒每年导致330万人死亡；和不饮酒的人群比较，慢性酒精中毒者上消化道手术后血液循环白介素(il)-10明显增加，il-6/il-10比值显著降低，同时伴随免疫功能发生一系列改变，导致慢性酒精中毒者在上消化道手术后恢复的时间明显长于不饮酒的人群，伤口感染和肺炎的发生率也明显增加。2001年美国食品和药品管理局(food and drug administration，fda)批准糖缺失性转铁蛋白(carbohydrate deficient transferrin,cdt)作为一项用于评估饮酒状况的标志物应用于临床。相对于其他肝脏酶类标志物，cdt在肝脏疾病存在时对于酒精摄入表现出更好的特异性和抗干扰能力，更优于其他传统饮酒标志物且特异性更佳。对于由酒精引发的肝脏疾病检测有较好的特异性和敏感性。因此，进一步研究cdt的检测方法，寻找更为廉价、简单的操作方法尤为重要。
3.由于缺乏cdt特异的反应或cdt的抗体，实验室测定血清cdt一般利用层析法(如离子交换层析)或电泳法(如等电聚焦电泳)将cdt分离(根据cdt和非cdt之间的pi的不同)；然而具有与cdt相同、相似pi的非cdt亚型大量存在，为减少共存的具有相同等电点的cdt与非cdt，cdt的分析通常先用fe
3+
将转铁蛋白饱和，使转铁蛋白亚型所带fe均一化，都变为fe
2+
转铁蛋白，然后用层析或电泳来分离cdt与非cdt组分，最后用免疫法来检测cdt亚型。电泳法与层析法分离过程中会使某些遗传变异蛋白等电点偏移，无法将cdt与非cdt有效分离，导致后续检测结果不准确。
4.凝集素是自然界广泛存在的一大类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白，它能够特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共价结构。凝集素按照来源、在细胞中存在部位以及糖结合专一性等方面分类，按照糖特异性结合分类：
5.(1)d-甘露糖，d-葡萄糖结合，例如蚕豆凝集素和豌豆凝集素；
6.(2)2-乙酰氨基2-脱氧-d-葡萄糖结合，例如马铃薯凝集素和麦胚凝集素；
7.(3)2-乙酰氨基2-脱氧-d-半乳糖结合，例如剌槐凝集素和蜗牛凝集素；
8.(4)d-半乳糖结合，例如蓖麻凝集素和花生凝集素；
9.(5)l-岩藻糖结合，例如荆豆凝集素和欧洲百脉根凝集素；
10.(6)唾液酸结合，例如龙虾凝集素。
11.转铁蛋白的两条复杂的寡糖链是由四种不同的糖基(n-乙酰葡糖胺、甘露醇、半乳糖、唾液酸)构成，其中唾液酸是唯一带电荷的糖基(带负电荷)，且总是位于末端。因此转铁蛋白可以被特定的凝集素特异性识别与分离。
12.糖缺失性转铁蛋白检测主要流程：糖缺失性转铁蛋白的分离与富集、检测分析等。
糖缺失性转铁蛋白的分离与富集原理是基于糖缺失性转铁蛋白的识别及肽链理化性质的不同。
13.cn202110519041.1公开了一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法及试剂盒，由离心管和收集管构成的离心柱，离心管内装有偶联独角仙凝集素allo-a的琼脂糖凝胶，分离管底部装有滤膜使得分离介质无法穿过滤膜；收集管中收集离心分离的液体。试剂中使用的独角仙凝集素将转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白分离，但独角仙凝集素价格昂贵检测成本偏高；离心分离蛋白耗时且离心机笨重不便携，影响效率。
14.cn 202111212203.3公开了一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒，只需一步测试获得结果，免去样本层析分离的步骤，并能实现样本大批量和高通量测试，满足临床需求。但使用的单克隆抗体市面上较难获得且糖缺失性转铁蛋白和转铁蛋白区别于是否含有糖基化基团，二者的单克隆抗体同源性高度一致，在实际检测和应用中很难区分转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白，易出现假阳性，使检测结果不准确。
15.cn 202110925344.3公开了一种糖缺失性转铁蛋白分离方法及检测方法与试剂盒的发明中，利用偶联凝集素的琼脂糖凝胶离心先纯化获得cdt，利用免疫比浊法检测cdt获取tf反应始点与终点的幅度差值，计算样本中的cdt含量。
16.cn 201810691539.4公开了用于糖链异常蛋白分离检测的组合物、试剂盒以及方法和用途，使用两种磁珠，一种磁珠-凝集素偶联复合物用以分离糖链异常蛋白，另一种磁珠-抗体结合形成复合物对糖链异常蛋白进行定量定性检测。试剂盒采用样本的分离富集与检测两步，操作步骤长且操作耗时。


技术实现要素：

17.本发明提供了一种凝集素包被磁珠的制备方法，包括以下步骤：
18.1)将一定浓度的活化剂加入到带有氨基、羧基或醛基的磁微球中，旋转混匀活化微球30-60min，磁力架分离，收集磁珠；本发明中磁珠用jsr公司的羧基磁珠ms300/carboxyl，其粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg或ms160/carboxyl，其粒径为1.5um，羧基含量为25nmol/mg；优选ms300/carboxyl；
19.2)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，然后用反应缓冲液重悬磁珠；
20.3)将一定量的凝集素加入到活化磁珠溶液内，室温下旋转震荡4-6h或4℃过夜使凝集素与磁珠充分结合，磁力架固液分离，收集偶联磁珠；
21.4)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，加入封闭缓冲液，旋转混合1-3h封闭磁珠多余的活性位点，，磁分离，收集磁珠；
22.5)用保存缓冲液清洗磁珠，最后用保存缓冲液重悬凝集素包被的磁珠。
23.进一步地，所述的反应缓冲液为ph4-9、50-100mm的mes或者ph4-9、100mm的pbs，优选mes。
24.进一步地，所述的凝集素为特异性结合siaa2—6galβ1—4glcnac糖链的凝集素如tja-1、sna、allo-a，优选sna。
25.进一步地，所述的封闭缓冲液为50-100mm的乙醇胺或1％的bsa或tris溶液，优选bsa。
26.进一步地，所述的保存缓冲液：0.5％ bsa、0.1％ tween20 ph7.4的pbs。
27.进一步地，所述的活化剂为戊二醛、nhs、edc，优选nhs和edc。
28.此外，在进行上述操作时，所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
29.本发明提供了一种糖缺失性转铁蛋白分离的方法，利用亲和层析法将cdt从血清中分离出来。该方法操作简单且易得到高纯度cdt，为后续检测提供优质原料。
30.一种糖缺失性转铁蛋白分离的方法，包括以下步骤：
31.步骤一、将凝集素包被的磁珠与含有cdt以及转铁蛋白的样本混合，搅拌均匀，室温下孵育10-30min，使磁珠在溶液中均匀分布，保证磁珠与转铁蛋白充分结合；
32.步骤二、利用磁力架加磁场固定磁珠，固液分离，将cdt与转铁蛋白分离，收集液体样本即糖缺失性转铁蛋白cdt，用于后续实验检测。
33.利用收集到的糖缺失性转铁蛋白cdt，可以直接检测含量以及计算其占比。
34.(1)发明中使用特异性结合siaa2—6galβ1—4glcnac(唾液酸链)的凝集素结合转铁蛋白两条复杂寡糖链末端的唾液酸链，特异性吸附转铁蛋白分离cdt。
35.(2)发明中选用磁性微球与凝集素偶联，球的表面积大交联更多的凝集素，结合更多的蛋白；
36.(3)发明中使用的微球是一种磁性微球，两分钟内完成吸磁实现样本分离，跳过离心步骤且移液过程中减少样本损失，操作简单，提高效率。
37.(4)发明中使用磁性微球偶联凝集素特异性的吸附转铁蛋白，纯化分离cdt。
38.本发明提供了基于免疫磁珠快速检测cdt的方法，包括以下步骤：
39.步骤一、将稀释样本加入到转铁蛋白单克隆捕获抗体a包被磁珠复合物体系中，涡旋抗体a包被磁珠，抗体a包被磁珠在样本溶液中均匀分布，室温下孵育30-60min，确保磁珠与转铁蛋白充分结合；
40.步骤二、体系平衡后，加磁场固定磁珠，固液分离，加入清洗缓冲液清洗免疫磁珠，将清洗磁珠用反应缓冲液重悬，涡旋混匀。
41.步骤三、将步骤二的重悬磁珠中加入生物素化凝集素或生物素化检测抗体b；经过充分混匀孵育，经固液分离，重悬免疫磁珠；
42.步骤四、加入亲和素标记的碱性磷酸酶alp或辣根过氧化酶hrp，然后与底物液进行显色反应或发光反应，准确测定总转铁蛋白以及含有唾液酸糖链的转铁蛋白，经过数据计算，准确获得糖缺失转铁蛋白cdt含量及cdt占比。
43.上述检测方法中，将转铁蛋白单克隆抗体a包被免疫磁珠的方法，包括以下步骤：
44.1)将一定浓度的活化剂加入到的羧基磁微球中，旋转混匀活化微球30-60min，磁力架分离，收集磁珠；
45.2)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，然后用反应缓冲液重悬磁珠；
46.3)将一定量的转铁蛋白单克隆捕获抗体a加入到已经活化磁珠溶液内，室温下旋转使转铁蛋白单克隆捕获抗体a与活化磁珠充分偶联2-4h或4-8℃过夜，磁力架分离固液，收集偶联磁珠；
47.4)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，加入封闭缓缓冲液，旋转混合1-3h封闭磁珠多余的活性位点，磁分离，收集偶联磁珠；
48.5)用保存缓冲液清洗磁珠，最后用保存缓冲液重悬转铁蛋白单克隆捕获抗体a包
被的磁珠，其粒径为1-5um。
49.进一步地，反应缓冲液为ph5-7、50-100mm的mes或者ph5-7、100mm的pbs、硼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，优选mes、硼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
50.进一步地，封闭缓冲液为50-100mm的乙醇胺、1％的bsa、tris溶液、酪蛋白或明胶。
51.进一步地，保存缓冲液为0.5％ bsa、0.1％ tween20 ph7.4的pbs。
52.进一步地，羧基磁珠为ms300/carboxyl或ms160/carboxyl，ms160/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg；ms300/carboxyl的粒径为1.5um，羧基含量为25nmol/mg；优选ms300/carboxyl。
53.进一步地，活化剂为nhs、碳化二亚胺或者戊二醛，优选nhs和edc。
54.凝集素或单克隆抗体b的生物素化方法，包括以下步骤：
55.1)用ph 8.0、0.1m碳酸氢钠缓冲液对凝集素或单克隆抗体b充分透析，接着离心将凝集素或单克隆抗体b浓缩；
56.2)用dmso将生物素溶解，加入一定量的浓缩凝集素或单克隆抗体b，在室温下孵育2-4小时；
57.3)加入nh4cl在室温下搅拌10分钟，用以终止反应；
58.4)在4℃温度下，透析除去游离的生物素，并将样品上分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，收集洗脱液；
59.5)洗脱液即为生物素化的凝集素或单克隆抗体b；
60.6)加入叠氮钠及bsa或加入甘油保存。
61.上述方法中：凝集素为特异性结合siaa2—6galβ1—4glcnac糖链的凝集素，优选tja-1、sna或allo-a；更优选sna；抗体为转铁蛋白单克隆检测抗体b；生物素为nhsb(n-羟基琥珀酰亚胺生物素)、bhz(酰肼)或bchz(肼化生物胞素)，优选nhsb。透析缓冲液为ph 8.0的0.1m碳酸氢钠缓冲液。
62.有益效果
63.(1)发明中使用转铁蛋白单克隆捕获抗体a可以特异性识别总转铁蛋白(糖链转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白)，亲和捕获血液中的总转铁蛋白，快速从血清中分离转铁蛋白。
64.(2)发明中使用的微球是一种磁性微球，微球比表面积大与转铁蛋白充分接触，增加相互碰撞的机会，结合更多蛋白，提高监测范围；磁珠被磁场固定在离心管壁，通常两分钟内即可完成吸磁，不需要离心且移液过程中不用担心损失样品，操作简单，提高效率。
65.(3)发明中使用可以特异性结合siaa2—6galβ1—4glcnac(唾液酸链)的凝集素(如：瓜蒌凝集素、黑接骨木凝集素等)，转铁蛋白寡糖链末端的唾液酸链被特定凝集素特异性结合，且生物素化凝集素放大信号，提高检测试剂的灵敏度。
66.(4)发明中使用的转铁蛋白单克隆检测抗体b可以特异性识别总转铁蛋白，抗体b用生物素标记放大信号，提高检测试剂的灵敏度。
67.(5)发明中通过特异性的免疫磁珠对样本中总转铁蛋白进行精准分离，然后对总转铁蛋白和含糖链的转铁蛋白进行检测，无需分离，直接进行吸附检测，获得样本中总转铁蛋白的含量以及仅含糖链转铁蛋白的含量，通过计算最终得到糖缺失性转铁蛋白的含量及比率。
附图说明
68.图1为实施例5的线性关系图；
69.图2为实施例9的线性关系图。
具体实施方式
70.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
71.实施例1
72.1)将10mg/ml的磁珠(jsr公司ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg)超声震荡充分混匀后，取100ul到a、b、c、d离心管中，置于磁力架上，待固液分离后去除上清液；
73.2)取(ph4、ph5、ph6、ph7)50mm的mes缓冲液230ul加入到a、b、c、d离心管内，充分混匀悬浮微球，用对应ph mes溶液洗涤a、b、c、d离心管两次；
74.3)四个离心管内加入超纯水新鲜配制浓度为50mg/ml的edc和nhs各10ul，涡旋混匀，使磁珠分散悬浮，室温下30min旋转混匀，充分活化微球；
75.4)将离心管置于磁力架上固液分离，用100ul对应ph的mes缓冲液重悬活化磁珠，加入100ul浓度为2mg/ml的sna溶液(50mm ph4、ph5、ph6、ph7 mes缓冲液溶解凝集素)混匀，室温旋转混匀反应2小时或4度旋转混匀过夜(sna溶液留样检测，用以计算偶联效率)；
76.5)反应结束后，加入ph 7的mes缓冲液充分混匀，用磁力架固液分离，收集上清液，加入mes缓冲液洗涤磁珠两次(mes缓冲液洗去未经过偶联的sna，测定洗涤液中的sna含量)；
77.6)加入200ul浓度1％的bsa旋转混合1小时，封闭磁珠多余的活性位点；
78.7)反应结束后，用含有0.5％ bsa、0.1％ tween20 ph7.4的pbs清洗磁珠，最后用储存缓冲液重悬包被的磁珠。磁珠的粒径为1-5um。
79.将步骤4与步骤5留样，用超微分光光度计在280时检测od值，按上述方法将sna与活化的磁珠偶联，2次重复偶联实验，按照公式计算偶联率：
80.偶联率＝(偶联前od280nm-偶联后od280nm)/偶联前od280nm
81.结果显示，ph5时结合效率最高，偶联效率为83.5-85.3％。
82.实施例2
83.1)将10mg/ml的磁珠(jsr公司ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg)超声震荡充分混匀后，取500ul到离心管中，置于磁力架上，待固液分离后去除上清液；
84.2)取200ul的50mm、ph 5的mes缓冲液加入到离心管内，充分混匀，洗涤两次；
85.3)加入新鲜配制浓度为25、50、75、100、125mg/ml的edc和nhs(edc：nhs加样量为1：1)各10ul依次加入到a、b、c、d、e离心管中，涡旋混匀，使磁珠分散悬浮，室温下30min旋转混匀，充分活化微球；
86.4)将离心管置于磁力架上固液分离，用100ul mes重悬活化磁珠，取100ul浓度为2mg/ml的sna溶液(50mm ph5 mes缓冲液溶解凝集素)分别加入a、b、c、d、e5个离心管，室温旋转混匀反应2小时或4度旋转混匀过夜(sna溶液留样，用以计算偶联效率)；
87.5)反应结束后，用磁力架固液分离，收集上清液，加入mes缓冲液洗涤磁珠三次(mes缓冲液洗去未经过偶联的sna，测定洗涤液中的sna含量)；
88.6)加入200ul浓度1％的bsa旋转混合1小时，封闭磁珠多余的活性位点；
89.7)反应结束后，用含有0.5％ bsa、0.1％ tween20 ph7.4的pbs清洗磁珠，最后用储存缓冲液重悬包被的磁珠。
90.将步骤4与步骤5留样，用超微分光光度计在280时检测od值，按上述方法将sna与活化的磁珠偶联，2次重复偶联实验，按照公式计算偶联率：
91.偶联率＝(偶联前od280nm-偶联后od280nm)/偶联前od280nm。
92.结果显示，edc与nhs在50mg/ml 10ul时结合效率达到最高，增加过多的edc与nhs偶联效率没有明显的变化，偶联效率为83.3-85.7％，添加量增加不能增加偶联效率，导致球pdi变大，分散性变大容易导致球聚集，另外edc与nhs过量清理不干净会影响后续的偶联反应。
93.实施例3
94.1)将10mg/ml的磁珠(jsr公司ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg)超声震荡充分混匀后，取500ul到离心管中，置于磁力架上，待固液分离后去除上清液；
95.2)取200ul的50mm,ph 5的mes缓冲液加入到离心管内，充分混匀，洗涤两次；
96.3)加入新鲜配制浓度为50mg/ml的edc和nhs各50ul到离心管中，涡旋混匀，使磁珠分散悬浮，室温下30min旋转混匀，充分活化微球；
97.4)将离心管置于磁力架上固液分离，用100ulmes重悬活化磁珠，分别加入100ul浓度为1、1.5、2、2.5、3mg/ml的sna溶液(50mm ph5 mes缓冲液溶解凝集素)混匀，室温旋转混匀反应2小时或4度旋转混匀过夜(sna溶液留样，用以计算偶联效率)；
98.5)反应结束后，用磁力架固液分离，收集上清液，加入mes缓冲液洗涤磁珠三次(mes缓冲液洗去未经过偶联的sna，测定洗涤液中的sna含量)；
99.6)加入200ul浓度1％的bsa旋转混合1小时，封闭磁珠多余的活性位点；
100.7)反应结束后，用含有0.5％ bsa、0.1％ tween20 ph7.4的pbs清洗磁珠，最后用储存缓冲液重悬包被的磁珠。
101.偶联率验证：
102.取溶于mes缓冲液1、1.5、2、2.5、3mg/ml浓度的sna，在280nm测定od值，按上述方法将sna与活化的磁珠偶联，共进行了3次偶联实验，按照公式计算偶联率：
103.偶联率＝(偶联前od280nm-偶联后od280nm)/偶联前od280nm。
104.结果显示，偶联效率为(85.5-92.3)％，且2.5mg/ml时偶联效果达到峰值，3mg/ml偶联率变化不大。
105.实施例4
106.1)将10mg/ml的磁珠(jsr公司ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg)超声震荡充分混匀后，取100ul到离心管中，置于磁力架上，待固液分离后去除上清液；
107.2)取200ul的50mm、ph 5的mes缓冲液加入到离心管内，充分混匀，洗涤两次；
108.3)加入新鲜配制浓度为50mg/ml的edc和nhs各50ul到离心管中，涡旋混匀，使磁珠分散悬浮，室温下30min旋转混匀，充分活化微球；
109.4)将离心管置于磁力架上固液分离，用100ul mes重悬活化磁珠，加入100ul浓度为2.5mg/ml的sna溶液(50mm ph5、mes缓冲液溶解凝集素)混匀，室温旋转混匀反应2小时或4度旋转混匀过夜(sna溶液留样，用以计算偶联效率)；
110.5)反应结束后，用磁力架固液分离，收集上清液，加入mes缓冲液洗涤磁珠三次(mes缓冲液洗去未经过偶联的sna，测定洗涤液中的sna含量，计得偶联率为93％)；
111.6)加入乙醇胺封闭磁珠旋转混合1小时，封闭多余的活性位点；
112.7)反应结束后，用含有0.5％ bsa、0.1％ tween20的ph7.4的pbs清洗磁珠，最后用储存缓冲液重悬包被的磁珠。
113.取sna 2.5mg溶于mes缓冲液，在280nm测定od值，按上述方法将sna与活化的磁珠偶联，共进行了3次偶联实验，按照公式技术
114.偶联率：
115.偶联率＝(偶联前od280nm-偶联后od280nm)/偶联前od280nm。
116.结果显示，偶联效率为(89.1-92.3)％。
117.实施例5
118.分离cdt蛋白的具体步骤：
119.步骤一、将sna包被的磁珠(其粒径为1-5um)加入到含有cdt以及转铁蛋白的体系中，搅拌均匀，室温下孵育30min,使磁珠在溶液中均匀分布，此过程中磁珠与转铁蛋白结合；
120.步骤二、体系平衡后，使cdt与转铁蛋白分离，利用磁力架加磁场固定磁珠，固液分离，收集液体,收集液体即分离蛋白cdt，待检测。
121.采用转铁蛋白测定试剂盒检测样本中的总转铁蛋白和分离液中cdt含量，利用公式计算cdt比率：cdt比率＝提取液cdt含量/总转铁蛋白
×
100％；与德国西门子医学诊断产品有限公司siemens healthcare diagnostics products gmbh生产的糖缺失转铁蛋白测定试剂盒试剂盒进行了对比检测实验。实验结果(样本经倍比稀释)，检测结果如下表：
122.123.[0124][0125]
在本实施例中，采用spss17.0软件，对纯化样本检测和直接检测的数据结果进行线性回归分析，本产品与同类产品结果对比基本相同，操作简单，且制备成本大幅降低。散点如上图所示，求得回归方程：y＝0.9967x+0.0317，相关系数r2＝0.9992，r≥0.975满足临床标准要求。
[0126]
实施例6
[0127]
一、转铁蛋白单克隆捕获抗体a包被磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0128]
1)将10mg/ml的磁珠(jsr公司ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg)超声震荡充分混匀后，取100ul到离心管中，置于磁力架上，待固液分离后去除上清液；
[0129]
2)取200ul的100mm、ph 5的mes缓冲液加入到离心管内，充分混匀，洗涤两次；
[0130]
3)加入新鲜配制浓度为50mg/ml的edc和nhs各50ul到离心管中，涡旋混匀，使磁珠分散悬浮，室温下30min旋转混匀，充分活化微球；
[0131]
4)将离心管置于磁力架上固液分离，用100ulmes重悬活化磁珠，加入100ul浓度为2mg/ml的转铁蛋白单克隆捕获抗体a溶液(100mm、ph5、mes缓冲液溶解转铁蛋白单克隆捕获抗体a)混匀，室温旋转混匀反应2小时或4度旋转混匀过夜；
[0132]
5)反应结束后，用磁力架固液分离，收集上清液，加入mes缓冲液洗涤磁珠三次(mes缓冲液洗去未经过偶联的转铁蛋白单克隆捕获抗体a，测定洗涤液中的转铁蛋白单克隆捕获抗体a含量，计得偶联率为92.2％)；
[0133]
6)加入含1％的bsa封闭缓冲液旋转混合封闭磁珠活化位点1小时，利用磁性固液分离；
[0134]
7)反应结束后，用含有0.5％ bsa、0.1％ tween20的ph7.4的pbs清洗磁珠，最后用储存缓冲液重悬包被的磁珠。
[0135]
偶联率：
[0136]
取转铁蛋白单克隆捕获抗体a 2mg溶于mes缓冲液，在280nm测定od值，按上述方法将转铁蛋白单克隆捕获抗体a与活化的磁珠偶联，共进行了5次偶联实验，按照公式计算偶联率：
[0137]
偶联率＝(偶联前od280nm-偶联后od280nm)/偶联前od280nm。
[0138]
结果显示，偶联效率为(81.5-92.3)％，重复性cv＝4.9％。
[0139]
二、生物素标记凝集素或单克隆抗体b的方法包括以下步骤：
[0140]
1)将凝集素或单克隆抗体b用0.1m碳酸氢钠缓冲液ph8.0稀释到1mg/ml，用0.1m碳酸氢钠缓冲液ph8.0对蛋白质充分透析；
[0141]
2)取1ml浓度为1mg/ml的凝集素或单克隆抗体b加入到120ul用dmso溶解浓度为1mg/ml的nhsb在室温下持续搅拌2-4小时；
[0142]
3)加入10ul浓度为1m的nh4cl在室温下搅拌10分钟；
[0143]
4)在4℃，用pbs充分透析，除去游离的生物素，并将样品上分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，蛋白质在1-3ml之间洗下，收集洗脱液，即为生物素标记的凝集素或单克隆抗体b；
[0144]
5)收集样品加入叠氮钠及0.1％的bsa，4℃避光保存或加入50％重蒸甘油-20℃保存。
[0145]
比色法检测生物素/单克隆抗体b摩尔质量比：
[0146]
1.吸取900ulhaba/亲和素溶液于1ml比色杯。
[0147]
2.测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为a500haba/avidin，最好测量三次取平均值。
[0148]
3.吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中充分混匀后，在500nm波长测量吸光值(数值必须恒定15s以上)，记为a500haba/avidin/biotin，最好测量三次取平均值；如果a500haba/avidin/biotin的值不超过(≤)0.3，重新稀释待测样品并检测。
[0149]
三、检测cdt蛋白的具体步骤：
[0150]
1)将样本含有cdt以及转铁蛋白加入到转铁蛋白单克隆捕获抗体a包被的磁珠体系中，搅拌均匀，室温下孵育60min，使磁珠在溶液中均匀分布，此过程磁珠与转铁蛋白充分结合；
[0151]
2)体系平衡后，样本中的转铁蛋白全部被免疫磁珠特异性吸附，利用磁力架加磁场固定磁珠，分离磁珠与上清液，用反应缓冲液重悬分离磁珠，待检测。
[0152]
3)将重悬免疫磁珠充分混匀，取微球分配到两个孔中各100ul，a孔内加入100ul生物素化单克隆抗体b，b孔内加入100ul生物素化凝集素，室温下孵育60min，分离磁珠与上清液；
[0153]
4)加入100ul亲和素偶联的alp，室温反应30min，加入50ul底物溶液，上机检测；
[0154]
利用全自动化学发光免疫分析仪检测酶反应产生的发光信号，发光强度与样本中转铁蛋白浓度相关，通过相应计算曲线计算出样本中转铁蛋白的浓度值。
[0155]
利用获得转铁蛋白的蛋白含量计算cdt比率：cdt比率＝{1-非cdt蛋白含量/总转铁蛋白含量}x100％，非cdt蛋白为凝集素检测蛋白即唾液酸糖链转铁蛋白。
[0156]
检测限：
[0157]
利用不同批次的检测试剂盒三批，对校准品稀释液样本或者零背景值的样本同时检测20次，计算检测结果平均值(mean)及标准差(sd)，由方程mean+2
×
sd计算出相对光单位值(rlu)，并计算其浓度值。
[0158][0159][0160]
由上述三批试剂检测结果分析，微球+捕获抗体a+抗原+生物素化检测抗体b+亲和素+alp空白检测限的最低检测结果平均为0.088ng/ml以及微球+捕获抗体a+抗原+生物素化凝集素+亲和素+alp空白检测限的最低检测结果平均为0.088ng/ml，均小于0.1ng/ml,最
低检测限检测结果符合实验预期，因此将检测试剂盒的最低空白检出限定义不大于0.1ng/ml。
[0161]
实施例7
[0162]
线性范围：
[0163]
1)捕获抗体a+转铁蛋白+检测抗体b模式对转铁蛋白浓度线性范围测定
[0164]
校准品、质控品是由转铁蛋白溶解在缓冲液中配制而成，缓冲液的组成如下：20mm pbs缓冲液、1％bsa，ph为7.4。
[0165]
将转铁蛋白用校准品稀释液配制成0.5ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的浓度，按照本发明试剂盒的说明书操作并用全自动化学发光免疫分析仪检测，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，并计算线性相关系数r≥0.9900。
[0166][0167][0168]
由表中计算出的线性关系来看，在0.5-1000ng/ml的范围内的相关系数为0.9996，且cv值都不大于5％，因此在此模式下检测的转铁蛋白线性范围0.5-1000ng/ml。
[0169]
2)捕获抗体a+转铁蛋白+检测凝集素模式对转铁蛋白浓度线性范围测定
[0170]
将转铁蛋白用校准品稀释液配制成0.5ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的浓度，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，并计算线性相关系数r≥0.9900。
[0171]
浓度(ng/ml)0.51101252505001000测定值10.521.0110.81125.32256.21506.631080.13测定值20.481.059.99128.53250.17515.851053.85测定值30.531.0810.63127.85257.86509.931065.91平均值0.511.0510.47127.23254.74510.801066.63sd0.01920.03240.37191.55833.56395.852731.216cv3.77％3.10％3.55％1.22％1.40％1.15％2.93％
[0172]
由表中计算出的线性关系来看，在0.5-1000ng/ml的范围内的相关系数为0.9997，且cv值都不大于5％，因此在此模式下检测的转铁蛋白线性范围0.5-1000ng/ml。
[0173]
3)cdt比率的线性范围测定
[0174]
校准品、质控品是由糖缺失性转铁蛋白抗原溶解在缓冲液中配制而成，缓冲液的
组成如下：20mm pbs缓冲液、1％bsa，ph为7.4。
[0175]
将高浓度糖缺失性转铁蛋白样本a为0.5mg/ml，其中转铁蛋白浓度为0.5mg/ml，与低浓度糖缺失性转铁蛋白样本b为0mg/ml，转铁蛋白浓度为1mg/ml，按比例混合，配制成8个稀释度的样本即样本c，用上述试剂盒分别对样本进行检测，每个浓度测3次，计算平均值及实际检测cdt浓度与理论cdt浓度线性相关系数大于等于0.9900。
[0176]
两种样本的配比以及含量
[0177][0178][0179]
cdt测定范围实验结果
[0180]
理论含量比例50％25％12.50％6.25％3.125％1.5625％0.78％0.39％第一次cdt％49.79％25.84％13.08％6.37％3.27％1.77％0.77％0.39％第二次cdt％52.25％25.24％11.86％6.19％3.06％1.60％0.79％0.40％第三次cdt％52.88％25.58％12.95％6.41％3.23％1.53％0.78％0.41％平均值51.60％25.56％12.63％6.32％3.19％1.64％0.78％0.40％
[0181]
由表数据计算出实际cdt％含量与理论cdt％线性来看，在cdt浓度3.9-500ng/ml的范围内相关性r大于等于0.999。
[0182]
实施例8精密度：
[0183]
(1)批内精密度
[0184]
选取cdt含量高浓度和低浓度的样本，平行测定10次检测试剂盒批内精密度，计算平均浓度、标准差及变异系数cv的值，验证cv值不高于10.0％。
[0185][0186]
从上表数据可知，用同一批试剂盒对高低浓度两个样本检测，批内精密度都小于10％，说明试剂盒的均一性良好，结果重复性强。
[0187]
2)批间精密度
[0188]
将样本浓度为25％和10％的cdt用三批试剂盒分别检测，平行测定10次，计算测定结果的平均浓度(mean)与标准差(sd)，批间精密度(cv)＝sd/mean
×
100％，cv应不大于15.0％。
[0189][0190]
利用同一份样本浓度经过三批试剂盒检测，批间样本相关系数都小于10％，这说明不同批次间的测量结果重复性强，试剂盒之间的批间差小。
[0191]
实施例9准确度：
[0192]
方法学对比：用本发明试剂检测方法和德国西门子医学诊断产品有限公司siemens healthcare diagnostics products gmbh生产n latexcdt kit糖缺失转铁蛋白测定试剂盒(乳胶增强散射比浊法)，同时测定40例新鲜血清，用线性回归法计算两组测试值的相关系数。
[0193]
西门子试剂盒是利用试剂盒中有特异性的cdt抗体直接测血清中的cdt。利用免疫比浊法的测试方法分别得到cdt和tf测试值，再计算比值，如下表：
[0194][0195]
参照试剂盒测试值与本发明实施例的试剂组合测试值的线性回归分析结果，其中r2＝0.9997，相关性r＝0.9998。相关系数表明本试剂盒与西门子试剂盒检测相关性高，能够准确检测出样本中的转铁蛋白以及糖缺失性转铁蛋白的含量。

技术特征：
1.一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将稀释样本加入到转铁蛋白单克隆捕获抗体a包被磁珠复合物体系中，涡旋抗体a包被磁珠，抗体a包被磁珠在样本溶液中均匀分布，室温下孵育30-60min，保证磁珠与转铁蛋白充分结合；步骤二、体系平衡后，加磁场固定磁珠，固液分离，加入清洗缓冲液清洗免疫磁珠，将清洗磁珠用反应缓冲液重悬，涡旋混匀。步骤三、将步骤二的重悬磁珠分别加入生物素化凝集素或生物素化检测抗体b；经过充分混匀孵育，经固液分离，重悬免疫磁珠；步骤四、加入亲和素标记的碱性磷酸酶或辣根过氧化酶，然后加入底物液进行显色反应或发光反应，测定总转铁蛋白以及含有唾液酸糖链的转铁蛋白，经过数据计算，准确获得糖缺失转铁蛋白cdt含量以及cdt占比；或者采用以下步骤：步骤(1)将凝集素包被的磁珠与含有cdt以及唾液酸糖链转铁蛋白的样本混合，搅拌均匀，室温下孵育10-30min，使磁珠在溶液中均匀分布，保证磁珠与转铁蛋白充分结合；步骤(2)利用磁力架加磁场固定磁珠，固液分离，将cdt与转铁蛋白分离，收集液体样本即糖缺失性转铁蛋白cdt，利用收集到的糖缺失性转铁蛋白cdt，可以直接检测含量以及计算其占比。2.根据权利要求1所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中凝集素包被磁珠的制备方法，包括以下步骤：1)将一定浓度的活化剂加入到带有羧基磁珠中，旋转混匀活化微球30-60min，磁力架分离，收集磁珠；2)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，然后用反应缓冲液重悬磁珠；3)将一定量的凝集素加入到活化磁珠溶液内，室温下旋转震荡4-6h或4℃过夜使凝集素与磁珠充分结合，磁力架固液分离，收集偶联磁珠；4)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，加入封闭缓冲液，旋转混合1-3h，用以封闭磁珠多余的活性位点，磁分离，收集磁珠；5)用保存缓冲液清洗磁珠，最后用保存缓冲液重悬凝集素包被的磁珠。3.根据权利要求2所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，反应缓冲液为ph4-9、50-100mm的mes或者ph4-9、100mm的pbs，优选mes；所述的凝集素为特异性结合siaa2—6galβ1—4glcnac糖链的凝集素，优选tja-1、sna或allo-a，更优选sna；所述的封闭缓冲液为50-100mm的乙醇胺、1％的bsa或tris溶液，优选bsa；所述的保存缓冲液为含有0.5％bsa、0.1％tween20 ph7.4的pbs；所述的活化剂为nhs、edc或戊二醛，优选nhs和edc。4.根据权利要求2所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，羧基磁珠为ms300/carboxyl或ms160/carboxyl，ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg；ms160/carboxyl的粒径为1.5um，羧基含量为25nmol/mg；优选ms300/carboxyl。5.根据权利要求1所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，步骤一中转铁蛋白单克隆抗体a包被免疫磁珠的方法，包括以下步骤：1)将一定浓度的活化剂加入到的磁微球中，旋转混匀活化微球30-60min，磁力架分离，收集磁珠；
2)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，然后用反应缓冲液重悬磁珠；3)将一定量的转铁蛋白单克隆捕获抗体a加入到已经活化磁珠溶液内，室温下旋转使转铁蛋白单克隆捕获抗体a与磁珠充分偶联2-4h或4-8℃过夜，磁力架分离固液，收集偶联磁珠；4)用2-5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2-3次，加入封闭缓缓冲液，旋转混合1-3h封闭磁珠多余的活性位点，磁力架分离，收集磁珠；5)用保存缓冲液清洗磁珠，最后用保存缓冲液重悬转铁蛋白单克隆捕获抗体a包被的磁珠，粒径为1-5um。6.根据权利要求5所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，反应缓冲液为ph5-7、50-100mm的mes或者ph5-7、100mm的pbs、硼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，优选mes；封闭缓冲液为50-100mm的乙醇胺、1％的bsa、tris溶液、酪蛋白或明胶，优选bsa；保存缓冲液为含有0.5％bsa、0.1％tween20 ph7.4的pbs；羧基磁珠为ms300/carboxyl或ms160/carboxyl，ms300/carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg；ms160/carboxyl的粒径为1.5um，羧基含量为25nmol/mg；优选ms300/carboxyl；活化剂为nhs、碳化二亚胺或者戊二醛，优选nhs和edc。7.根据权利要求5所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，凝集素或单克隆抗体b的生物素化方法，包括以下步骤：1）用ph 8.0、0.1m碳酸氢钠缓冲液对凝集素或单克隆抗体b充分透析，然后离心浓缩凝集素或单克隆抗体b；2）用dmso将生物素溶解，加入一定量的浓度凝集素或单克隆抗体b，在室温下孵育2-4小时；3）加入nh4cl在室温下搅拌10分钟，终止反应；4）在4℃温度下，透析除去游离的生物素，并将样品上分子筛柱，以pbs 缓慢洗脱，收集洗脱液；5）洗脱液即为生物素化的凝集素或生物素化的单克隆抗体b；6）加入叠氮钠及bsa或加入甘油保存。8.根据权利要求7所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，凝集素为特异性结合siaa2—6galβ1—4glcnac糖链的凝集素，优选tja-1、sna、allo-a，更优选sna；抗体为转铁蛋白单克隆检测抗体b；生物素为nhsb、bhz或bchz，优选nhsb；透析缓冲液为ph 8.0的0.1m碳酸氢钠缓冲液。

技术总结
本发明公开了一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，基于一种凝集素包被磁珠，利用亲和层析法从血清中将CDT与转铁蛋白分离。该方法操作简单、投入成本低、易得到高纯度CDT等优点，为后续检测提供优质原料。同时本发明提供了一种无需分离即可检测糖链转铁蛋白，从而得到CDT含量及占比的方法，发明中使用转铁蛋白单克隆捕获抗体A可以特异性识别总转铁蛋白，快速从血清中分离转铁蛋白。发明中使用的微球是一种磁性微球，微球比表面积大与转铁蛋白充分接触，增加相互碰撞的机会，结合更多蛋白，提高监测范围；磁珠被磁力架固定在离心管壁，通常两分钟内即可完成吸磁，不需要离心且换液过程中不用担心损失样品，操作简单，提高效率。提高效率。提高效率。


技术研发人员：徐玉超 隗勇 李金文 李晓云
受保护的技术使用者：中金进出口有限公司 中科梅奥（山东）医学检验有限公司 中拓医学检验有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/10/7