二氢杨梅素在制备治疗糖尿病神经病理痛合并抑郁症药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及二氢杨梅素在制备治疗糖尿病神经病理痛合并抑郁症药物中的应用。


背景技术：

2.糖尿病神经病理痛(diabetic neuropathic pain,dnp)是糖尿病神经病变中危害较大的一个常见并发症，通常表现为下肢远端皮肤烧灼样的疼痛，糖尿病患者的疼痛或神经损伤症状的发生率随年龄和病程增长而升高。严重的dnp还可伴有焦虑或者抑郁(depression,dp)。与其它糖尿病并发症相比，dnp是dp的一个更重要的决定因素，并且可以加重dp的症状，dp和dnp之间存在相互促进病情进展的作用，dnp并发dp严重影响患者生活质量。
3.目前临床尚缺乏针对dnp合并dp有效的治疗药物。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于提供二氢杨梅素在制备治疗糖尿病神经病理痛合并抑郁症药物中的应用。
5.二氢杨梅素(dihydromyricetin，dhm)为葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中的主要活性成分黄酮类化合物，在解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌的发病率、抗高血压等方面具有特殊功效。
6.发明人发现，二氢杨梅素可降低糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠海马、脊髓和背根神经节的p2x7受体表达，降低炎性因子tnf-α和il-1β表达，进而实现治疗和/或缓解糖尿病神经病理痛合并抑郁症。
7.p2x7受体是嘌呤能受体家族的成员之一，属于atp敏感的阳离子通道受体，通过atp激活p2x7受体并产生疼痛，在神经炎症通路中发挥重要作用，并参与抑郁症状的产生，神经系统的胶质细胞中的p2x7受体是dnp及dp共病的重要靶点。
8.进一步地，所述药物的有效活性成分为二氢杨梅素。二氢杨梅素可通过普通商业途径购买获得。
9.进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
10.进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂中的一种。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
12.本发明揭示了二氢杨梅素可降低糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠海马、脊髓和背根神经节的p2x7受体表达，降低炎性因子tnf-α和il-1β表达，进而实现治疗和/或缓解糖尿病神经病理痛合并抑郁症。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
14.图1为二氢杨梅素对糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠机械痛敏阈值和热缩足反射潜伏期的影响图，其中图1a为足底机械缩足反射阈值结果、图1b为热缩足反射潜伏期检测结果；
15.图2为二氢杨梅素对糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠旷场实验、糖水偏嗜度和强迫游泳不动时间的影响图，其中图2a为旷场实验监测结果、图2b为糖水偏嗜度监测结果，图2c为强迫游泳不动时间监测结果；
16.图3为各组大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7受体的real-time pcr和蛋白印迹检测结果图，其中图3a、3b、3c分别为大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7 mrna相对内参β-actin mrna表达量柱状图，图3d、3e、3f分别为大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的蛋白印迹凝胶图，图3g、3h、3i分别为大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的相对内参β-actin的蛋白表达量柱状图；
17.图4为各组大鼠血清中炎性细胞因子tnf-α和il-1β的水平变化图。
具体实施方式
18.下面将结合实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、详细地描述，显然，所描述的实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，而不是全部的实施例。本发明的保护范围不限于下述的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的实施例，仍属于本发明的保护范畴。
19.下述实施例中的实验方法，除非另有指明均为常规方法，本发明所涉及试剂或仪器未注明生产厂商者，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
20.下面结合附图(图1-4)和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细的描述。
21.一、材料和方法
22.1.1动物和分组：
23.sd雄性大鼠，体重180-220g，由江西中医药大学提供，动物合格证号为：scxk(赣)2018-0003。大鼠经正常饮食喂养一周，待其适应环境后，进行为期4周的高糖高脂喂养，之后给予大鼠空腹(禁食不禁水)12小时处理，再给予大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，stz)(30mg/kg)，监测大鼠随机血糖，将血糖≥16.7mmol/l定为2型糖尿病大鼠成模标准，腹腔注射stz后，开始给予大鼠慢性不可预知性应激刺激(4℃冰水强迫游泳5min，束缚2h，昼夜颠倒24h，45℃热水强迫游泳5min，夹尾1min，禁食禁饮24h)，为期4周。
24.与此同时连续检测大鼠的痛行为变化：热缩足反射潜伏期(thermal withdrawl latency，twl)与机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，mwt)，以筛选出具有神经病理痛的dnp大鼠。同时观察大鼠的抑郁行为变化：糖水偏好实验(sucrose preference test，spt)，旷场实验(open-field test，oft)和强迫游泳不动时间实验(immobility time of forced swimming test，imfst)筛选出同时并发dnp和dp的大鼠。
25.将sd大鼠随机分为6组：正常对照组(control组)、正常和二氢杨梅素组(control+dhm组)、模型组(dnp+dp组)、模型和二氢杨梅素组(dnp+dp+dhm)组、模型和p2x7 shrna组(dnp+dp+p2x7 shrna)组、模型和scramble shrna组(dnp+dp+scramble shrna)组。成功建立模型之后，dnp+dp+dhm组大鼠给予腹腔注射dhm 30mg/kg，每24h一次，连续注射14天；使用entranstertm-in vivo(动物体内dna转染试剂)给予dnp+dp+p2x7 shrna组和dnp+dp+scramble shrna组大鼠侧脑室注射转染shrna。
26.1.2机械缩足反射阈值的测定
27.使用电子式机械测痛仪(bme-404no.e5489,inst.of bme,cams&pumc)分别于注射stz后第7，14，21，28，35，42天的上午8：00-12：00检测各组大鼠的机械缩足反射阈值，室温维持在(22
±
0.5)℃。将大鼠放入透明亚克力盒(25
×
15
×
25cm3)中，以小孔铁丝网为底，静置30min使其适应，用机械测痛仪刺激大鼠左后足底中心，刺激力度逐渐加强，当大鼠出现明显的缩足反射(快速缩足、舔足)时，读取此时bme-tactile软件记录的痛阈值，以克(g)为单位，每只大鼠重复刺激6次，每次间隔1min。记录数据，计算mwt。
28.1.3热缩足反射潜伏期的测定
29.使用bme-410c型热痛刺激仪分别于注射stz后第7，14，21，28，35，42天的下午14：00-18：00检测各组大鼠的热缩足反射潜伏期，室温维持在(22
±
0.5)℃。将大鼠放入透明亚克力盒(25
×
15
×
25cm3)中，以3mm厚的玻璃板为底，静置大鼠30min使其适应，使用热痛刺激仪照射大鼠紧贴玻璃板的左后足底中心，钨灯照射距离保持在0.5cm，保证足够的热辐射刺激，当被刺激后足迅速抬起或移动时，停止照射，观察从照射开始至大鼠出现抬腿回避的时间，此时间为热缩足反射潜伏期，以秒(s)为单位。钨灯照射30s后自动切断，以防止组织损伤。每只大鼠重复刺激6次，每次间隔1min。记录数据，计算twl。
30.1.4糖水偏好实验
31.监测大鼠的糖水偏嗜度用以观察大鼠的快感缺失情况。大鼠禁食禁饮24小时后，将每只大鼠放入单独的小号鼠笼中。每个笼子上同时放置两个相同的动物喂养水瓶(一瓶100ml 1％蔗糖水和一瓶100ml纯水)，并将水瓶做好标记。1个小时后测量每只大鼠的糖水消耗量和纯水消耗量(以百分比表示)来评估大鼠的糖水偏嗜度。计算方法：糖水偏嗜度＝糖水消耗量/液体总消耗量*100％。
32.1.5强迫游泳不动时间实验
33.准备一个内径40cm，高80cm的玻璃圆桶，玻璃桶内加入20℃的温水，水深30cm，将大鼠放入圆桶中，每只大鼠强迫游泳时间为5min，观察大鼠的活动情况，记录大鼠在水中的静止不动时间(停止挣扎，表现为漂浮状态视为静止不动)，以秒(s)为单位。
34.1.6旷场实验
35.将测试环境室温保持在26℃，测试前，将大鼠置于黑暗中30min以适应测试环境。将大鼠轻放于40*60*50cm的暗箱中央，用摄像头(powershot a610，canon co.)记录在5min的时间里记录下大鼠的运动轨迹。通过matlab软件(mathworks co,massachusetts,usa)对录制的视频进行分析和处理，以确定总距离，单位为厘米(cm)。每次实验后，用10％乙醇溶液擦拭暗箱，以消除大鼠之间相互影响。
36.比较各组大鼠术前和术后对不同刺激强度的刺激反应，并进行统计分析。
37.1.7rt-pcr
38.提取小鼠总rna，进行rna逆转录，β-actin、p2x7的引物序列如下：
39.β-actin 5
’‑
taaagacctctatgccaacacagt-3’[0040]3’‑
cacgatggaggggccggactcatc-5’[0041]
p2x7 5
’‑
gatggatggacccacaaagt-3’[0042]3’‑
gcttctttcccttcctcagc-5’[0043]
以cdna为模板，按照takara的qpcr的试剂盒premix ex taqtm ii，根据steponeplus real-time pcr system的说明，配制20μl的反应体系，每个样品设置3个复孔。采用2-δδct
法，计算各组各基因表达量。其中δct等于目的基因的ct值减去内参的ct值；δδct值等于待测组的δct值减去对照组的δct值；最后结果以相对表达量表示，相对表达量＝2-δδct
。
[0044]
1.8蛋白印迹(western blot)
[0045]
1)蛋白质的提取：大鼠断头后，迅速取出海马，脊髓和背根神经节分别置于2ml匀浆器内，每个样本加0.3ml去污剂裂解液，冰上充分研磨，尽量碾碎。反复裂解30min后，移至1.5ml离心管中，4℃离心12000rpm 10min，取上清，各组取2μl含蛋白的上清进行蛋白定量，其余加5
×
凝胶上样缓冲液，再加10％dtt，混匀后分装，-80℃保存。
[0046]
2)实验步骤：
[0047]
a)测漏检查：检查玻璃板间的密封性是否良好，如无外漏则把水吸干备用。
[0048]
b)10％分离胶制备(10ml)：双蒸水4ml，30％丙烯酰胺混合液3.3ml 1.5mol/l tris-hcl(ph 8.8)2.5ml，10％ sds 0.1ml，10％过硫酸胺(ap)0.1ml，temed 4μl。充分混匀后，灌胶，加入6ml即可，注意不要产生气泡，再加异丙醇压胶。20-30min分离胶凝固后倒出异丙醇，并用滤纸把玻璃板内残留的异丙醇吸干净。
[0049]
c)5％压缩胶制备(5ml)：双蒸水3.4ml，30％丙烯酰胺混合液0.83ml，1.0mol/l tris-hcl(ph 6.8)0.63ml，10％ sds 0.05ml，10％过硫酸胺(ap)0.05ml，temed 5μl。混匀后迅速灌胶，约4ml，迅速插入梳子，待20-30min胶完全凝固后使用。
[0050]
d)上样：将提取好的蛋白放入沸水中煮5min，使其变性，各孔上样量根据各组蛋白定量结果进行计算，浓度不同上样量也不同，一般不超过30μl。
[0051]
e)电泳：压缩胶为90v，50min。分离胶为120v，约40min。
[0052]
f)转膜：切胶，去除非目的蛋白所在部分，保留含有目的蛋白的分离胶，用事前准备好的相同大小的滤纸和膜贴于其上，摆放顺序是黑板-垫子-4层滤纸-胶-pvdf膜-4层滤纸-白板。4℃，恒流300ma，1.5小时。
[0053]
g)封闭：将膜放在tbst中洗涤10min后，放入tbst配制的5％脱脂奶粉中封闭，室温下平摇1-3小时，如果背景高可考虑封闭过夜或更长时间。封闭时注意正面朝下。
[0054]
h)一抗孵育：将膜在滤纸上稍吸干后，不洗，直接放入脱脂奶粉配制的一抗中，4℃过夜，或室温下孵育2-4小时。
[0055]
i)加二抗：tbst洗10min
×
3遍后放入脱脂奶粉配制的二抗中，室温下平摇。1小时后用tbst洗10min
×
4遍。
[0056]
j)免疫复合物检测：显色，曝光，显影，定影
[0057]
3)光密度分析：应用image-pro plus图像分析系统分析，并比较各组p2x7蛋白表达的变化。
[0058]
1.9elisa
[0059]
(1)血清样品制备：大鼠断头处死取血，血液静置30min后，进行离心(3000rpm，30min)，取上层血清。
[0060]
(2)实验准备：从冰箱中取出elisa试剂盒，室温放置30min，按照说明书，配制所需标准品、生物素标记抗体、abc工作液，洗涤液。
[0061]
(3)确定本次检测所需的酶标板孔数，并增加1孔作为tmb空白显色孔。
[0062]
(4)将按说明稀释浓度梯度的标准品各100μl依次加入孔中，其中1孔只加样品稀释液，作为零孔。将已用样品稀释液稀释的各组大鼠血清100μl依次加入孔中，各浓度标准品和各组样品均设置3个复孔。
[0063]
(5)用封板膜将酶标板各孔密封，于37℃水浴孵育，反应90min。
[0064]
(6)取出酶标板，小心揭开封板膜，甩去板内液体，再对着吸水纸拍干，洗3次后，再甩干。
[0065]
(7)在酶标板各孔中依次加入100μl生物素抗大鼠tnf-α，il-1β抗体工作液(tmb空白显色孔不加)，用封板膜密封酶标板，于37℃水浴孵育，反应60min。
[0066]
(8)取出酶标板，揭开封板膜，甩去板内液体，用1x洗涤缓冲液洗涤3次，每孔300μl，每次洗涤需浸泡1min。
[0067]
(9)在酶标板各孔中依次加入100μl abc工作液(tmb空白显色孔不加)，用封板膜密封酶标板，于37℃水浴孵育，反应30min。
[0068]
(10)弃去板内工作液，1x洗涤缓冲液洗涤5次，每孔300μl，每次洗涤需浸泡2min。
[0069]
(11)在酶标板各孔中依次加入90μl tmb显色液(提前37℃水浴30min)，于37℃水浴锅中，避光孵育反应25-30min。
[0070]
(12)在酶标板各孔中依次加入100μl tmb终止液，蓝色即刻转变为黄色。
[0071]
(13)用多功能酶标仪在450nm检测od值。将零孔设为对照。标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到样品的吸光值。
[0072]
(14)根据标准品浓度和吸光值绘制标准曲线，根据所测各组样本的od值，计算血清样品中炎性因子tnf-α、il-1β的浓度。
[0073]
1.10统计学分析
[0074]
采用spss 21.0统计软件对实验数据进行统计分析，实验结果数据以均数
±
标准误(mean
±
sem)表示，多组间采用单因素方差分析进行比较，两组间选用最小显著差法(lsd)进行比较，p《0.05为有统计学意义。
[0075]
二、实验结果
[0076]
2.1足底机械缩足反射阈值、热缩足反射潜伏期检测结果
[0077]
雄性sd大鼠在stz腹腔注射以及慢性不可预测应激刺激4周后，dnp合并dp模型建立成功。足底机械缩足反射阈值结果见图1a、热缩足反射潜伏期检测结果见图1b，其中**p《0.01表示和正常组比较，##p《0.01表示与模型组比较。
[0078]
从图1可以看出，dnp+dp组大鼠的mwt和twl显著低于control组(p《0.01)，持续注射二氢杨梅素(dhm)2周或鞘内注射p2x7 shrna 1周后，dnp+dp+p2x7 shrna组和dnp+dp+dhm组大鼠的mwt和twl显著低于dnp+dp组(p《0.01)。说明神经病理痛合并抑郁症大鼠造模成功，模型大鼠足底缩足反射表现出机械痛敏和热痛敏增强，应用二氢杨梅素或p2x7shrna
处理敲低后可以缓解模型大鼠的神经病理痛。
[0079]
2.2旷场实验、糖水偏嗜度和强迫游泳不动时间监测结果
[0080]
旷场实验监测结果见图2a、糖水偏嗜度监测结果见图2b，强迫游泳不动时间监测结果见图2c，其中**p《0.01表示和正常组比较，##p《0.01表示与模型组比较。
[0081]
从图2可以看出，动物模型建立成功后，dnp+dp组大鼠的spt和oft明显低于control组(p《0.01)，dnp+dp组的imfst明显高于control组(p《0.01)，持续注射dhm 2周或鞘内注射p2x7 shrna 1周后，dnp+dp+p2x7 shrna组和dnp+dp+dhm组大鼠的spt和oft值均显著低于dnp+dp组(p《0.01)，且dnp+dp+p2x7 shrna组和dnp+dp+dhm组大鼠的imfst值均较dnp+dp组显著缩短(p《0.01)。说明神经病理痛合并抑郁症大鼠造模成功，模型大鼠表现出抑郁样行为，应用二氢杨梅素或p2x7shrna处理敲低后可以缓解模型大鼠的抑郁样行为。
[0082]
2.3海马、脊髓和背根神经节中p2x7的表达结果
[0083]
2.3.1rt-pcr检测大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的mrna表达结果
[0084]
采用rt-pcr方法检测海马、脊髓和背根神经节中p2x7的mrna的表达。试验结果见图3a-3c，图3a、3b、3c分别为大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7 mrna相对内参β-actin mrna表达量柱状图。其中**p《0.01表示和正常组比较，##p《0.01表示与模型组比较。
[0085]
从图3a、3b、3c可以看出，与control组比较，dnp+dp组中p2x7 mrna的表达水平显著升高(p《0.01)；给予dhm或p2x7 shrna处理后，dnp+dp+dhm组和dnp+dp+p2x7 shrna组p2x7 mrna的表达较dnp+dp组显著降低(p《0.01)。说明神经病理痛合并抑郁症大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7 mrna的表达升高促进了模型大鼠的神经病理痛合并抑郁症，应用二氢杨梅素或p2x7 shrna处理敲低后可以通过下调大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7 mrna的表达缓解模型大鼠的神经病理痛合并抑郁症。
[0086]
2.3.2蛋白印迹检测海马、脊髓和背根神经节中p2x7的蛋白表达结果
[0087]
通过蛋白印迹检测分别检测各组大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的蛋白表达水平。试验结果见图3d、3e、3f，分别为大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的蛋白印迹凝胶图，图3g、3h、3i分别为大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的相对内参β-actin的蛋白表达量柱状图，其中**p《0.01表示和正常组比较，##p《0.01表示与模型组比较。
[0088]
从图3d、3e、3f可以看出，dnp+dp组大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7受体的蛋白水平均明显高于control组(p《0.01)；但与dnp+dp相比，经dhm或p2x7 shrna处理后，dnp+dp+dhm组和dnp+dp+p2x7 shrna组p2x7受体的蛋白表达明显降低(p《0.01)。说明神经病理痛合并抑郁症大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7蛋白的表达升高促进了模型大鼠的神经病理痛合并抑郁症，应用二氢杨梅素或p2x7 shrna处理敲低后可以通过下调大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7蛋白的表达缓解模型大鼠的神经病理痛合并抑郁症。
[0089]
2.4elisa检测大鼠血清中tnf-α和il-1β的表达结果
[0090]
使用curveexpert1.4软件，根据标准品浓度以及所测样品od值分别作tnf-α和il-1β的标准曲线(tnf-α：r＝0.999；il-1β:r＝0.999)，根据标准曲线计算出各组血清tnf-α和il-1β的浓度。试验结果见图4，其中**p《0.01表示和正常组比较，##p《0.01表示与模型组比较。
[0091]
从图4可以看出，dnp+dp组大鼠血清中tnf-α、il-1β的表达水平较control组显著升高(p《0.01)，给予dhm或p2x7 shrna处理后，dnp+dp+dhm组和dnp+dp+p2x7 shrna组大鼠
血清tnf-α、il-1β的表达水平较dnp+dp组明显降低(p《0.01)。说明神经病理痛合并抑郁症大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7表达升高促进了模型大鼠的血清中炎症因子的水平升高，应用二氢杨梅素或p2x7 shrna处理敲低后可以通过下调大鼠海马、脊髓和背根神经节中p2x7的表达下调血清中炎症因子的水平缓解模型大鼠的神经病理痛合并抑郁症。
[0092]
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.二氢杨梅素在制备治疗糖尿病神经病理痛合并抑郁症药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的有效活性成分为二氢杨梅素。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂中的一种。

技术总结
本发明属于医药技术领域，尤其涉及二氢杨梅素在制备治疗糖尿病神经病理痛合并抑郁症药物中的应用。二氢杨梅素可降低糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠海马、脊髓和背根神经节的P2X7受体表达，降低炎性因子TNF-α和IL-1β表达，进而实现治疗和/或缓解糖尿病神经病理痛合并抑郁症。合并抑郁症。合并抑郁症。


技术研发人员：高云 熊伟 关书 葛会香 孙梦云 张明明 文雨晴 占婷 杜俊培
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/10/7