一种妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子组合及其应用

一种妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子组合及其应用
发明领域
1.本发明属于代谢组学及临床医学领域，涉及一种妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子组合及其应用。


背景技术：

2.妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,gdm)是妊娠期最常见的并发症之一，是指妊娠期间发生的不同程度的糖代谢异常，但血糖未达到显性糖尿病的水平，约占孕期糖尿病的80％～90％。据估计，全世界约有2000万孩子在宫内暴露于母亲妊娠期糖尿病
1.。妊娠期糖尿病会增加母亲患妊娠高血压、先兆子痫和ⅱ型糖尿病的风险，同时对子代近期和远期的生长发育过程均会带来不良影响，导致新生儿低血糖、巨大儿等，并且会增加子代远期肥胖、ii型糖尿病和高血压等风险，给家庭和社会带来严重的心理和经济学负担
[2,3]
。
[0003]
目前gdm的筛查和诊断方法及标准并不统一，使用较为普遍的诊断方法是妊娠24周-28周的口服葡萄糖耐量试验
[4]
。然而，有研究发现妊娠期糖尿病可能早在孕16-20周就已发病
[5,6]
。因此，妊娠期糖尿病的早期筛查，早期诊断至关重要。目前gdm高危人群的识别主要通过孕早期的空腹血糖(fpg)、糖化血红蛋白(hba1c)以及传统的gdm风险预测模型等手段。然而，fpg的筛查价值在多篇报道中结论不一；hba1c虽然比口服葡萄糖耐量试验(ogtt)的检测更为方便，但对gdm的早筛敏感性较低；传统的gdm风险预测模型中的预测因子，主要包括高血糖病史、糖尿病家族史、血糖血脂、孕前bmi等个人体征信息，忽视了一部分发展为gdm的孕妇在早期并无任何临床指标的异常
[7]
。因此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对gdm做出辅助早期诊断，从而留下充足的时间干预以减少不良母婴结局的发生。
[0004]
代谢组学(metabolomics/metabonomics)是对体液，细胞和组织中代谢产物的分析，通常用作发现生物标志物的工具
[8]
。代谢组学根据研究目的的不同，可进一步分为非靶向和靶向代谢组学。非靶向代谢组学是对有机体内源性代谢物的全面、系统的分析，是一种无偏向的代谢组学分析，可以发现新的生物标记物。靶向代谢组学是针对特定一类代谢物的研究分析。二者各有优缺点，经常结合使用，用于差异代谢产物的发现和定量，对代谢分子标志物进行深入的研究和分析，在食品鉴定、疾病研究、动物模型验证、生物标志物发现、疾病诊断、药物研发、药物筛选、药物评估、临床研究中发挥重要作用。roc曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线)是对于可能或将会存在混淆的两种条件或自然状态，需要试验者、专业诊断学工作者以及预测工作者作出精细判别或者准确决策的一种定量方法。roc曲线已经在医学领域广泛应用于临床诊疗、人群筛检等研究。
[0005]
近年来，代谢组学在心血管疾病，糖尿病，肾病等各种疾病的机制研究和早期诊断中崭露头角，展现了代谢小分子在疾病辅助诊断中巨大的潜力与价值
[9-12]
。然而，目前所用生物样本多为有创采集的血液样本
[13-18]
。若能筛选出稳定的gdm特异或异常表达的尿液代
谢物小分子作为生物标志物，对我国gdm的诊断现状必将是一次有力的推动。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种妊娠期糖尿病辅助诊断尿液代谢物小分子组合。
[0007]
一种妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子组合，该代谢小分子组合为皮质酮和四氢醛酮-3-葡萄糖醛酸的组合。
[0008]
用于检测所述辅助诊断代谢小分子组合的检测方法为基于uplc-q exactive ms非靶标代谢组学检测方法。该方法为常规方法，可以委托第三方检测机构完成。
[0009]
所述的代谢小分子组合在制备辅助诊断妊娠期糖尿病的试剂盒中的应用。
[0010]
用于检测所述代谢小分子组合的检测试剂在制备辅助诊断妊娠期糖尿病的试剂盒中的应用。
[0011]
一种用于辅助诊断妊娠期糖尿病的试剂盒，该试剂盒含有检测女性尿液中所述代谢小分子组合的试剂。
[0012]
所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用uplc-q exactive ms非靶标代谢组学检测方法检测女性尿液中所述代谢小分子组合的试剂。
[0013]
所述试剂盒含有甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水。
[0014]
本发明详细描述如下：
[0015]
本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的孕期尿液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，后经第三方检测公司上海百趣生物医学科技有限公司使用uplc-qe-ms平台进行非靶向代谢组学检测，具体实验方法及过程如下：
[0016]
一、实验仪器：
[0017]
仪器型号品牌超高效液相vanquishthermo fisher scientific高分辨质谱q exactive hfxthermo fisher scientific离心机heraeus fresco17thermo fisher scientific天平bsa124s-cwsartorius纯水仪明澈 d24uvmerck millipore超声仪ps-60al深圳市雷德邦电子有限公司
[0018]
二、实验试剂
[0019]
名称cas纯度品牌甲醇(methanol)67-56-1lc-ms级cnw technologies乙腈(acetonitrile)75-05-8lc-ms级cnw technologies乙酸铵(ammonium acetate)631-61-8lc-ms级sigma氨水(ammonium hydroxide)1336-21-6lc-ms级thermo fisher
[0020]
三、实验方法：
[0021]
1.液相条件：
[0022]
液相色谱柱waters acquity uplc beh amide(2.1mm
×
100mm,1.7μm)液相色谱柱，柱温为25℃；
[0023]
液相色谱a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈，流速500μl/
min；
[0024]
仪器梯度为：0～0.5min,95％ b；0.5～7min,95％～65％ b；7～8min,65％～40％ b；8～9min,40％ b；9～9.1min,40％～95％ b；9.1～12min,95％ b；(b指流动相b，各梯度中流动相a的量与对应的流动相b的量共100％，下同)
[0025]
进样：3μl。
[0026]
2.质谱条件：
[0027]
thermo q exactive hfx质谱仪能够在控制软件(xcalibur，thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：sheath gas flow rate:50arb,aux gas flow rate:10arb,capillary temperature:320℃,full ms resolution:60000,ms/ms resolution:7500,collision energy:10/30/60in nce mode,spray voltage:3.5kv(positive)或-3.2kv(negative)。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
本发明人通过比较妊娠糖尿病孕妇和非妊娠糖尿病孕妇孕早期尿液中的代谢小分子，发现了孕早期尿液中存在可用于辅助诊断妊娠糖尿病的尿液代谢小分子组合。
附图说明
[0030]
图1是利用在南京人群中筛选出的皮质酮和四氢醛酮-3-葡萄糖醛酸代谢物小分子组合去辅助诊断苏州人群妊娠糖尿病的roc曲线图。
具体实施方式
[0031]
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，实验过程中未详细描述的操作步骤为本领域技术人员公知的相关操作步骤，采用的试剂为与检测方法相适应的设备厂商提供的配套试剂及常规试剂，均可从市售获得，不再进行特别说明。
[0032]
实施例1、研究对象选择和分组
[0033]
第一阶段筛选阶段
[0034]
本发明人从2014年5月至2018年5月从南京市妇幼保健院纳入了990名自然妊娠孕妇，并在纳入当天收集她们的尿液样本(所有样本为同期收取，采样、运输、储存条件均一)。
[0035]
1.采尿时为孕8-14周孕妇；
[0036]
2.上述研究对象无孕前糖尿病病史，无妊娠期高血压。
[0037]
第二阶段验证阶段
[0038]
2014年6月至2018年5月从苏州市立医院纳入406名自然妊娠孕妇。
[0039]
1.纳入时处于孕8-14周；
[0040]
2.无孕前糖尿病史，无妊娠期高血压。
[0041]
实施例2：第三方检测公司使用uplc-qe-ms平台进行非靶向代谢组学检测
[0042]
1.代谢物提取
[0043]
1.1.将样品置于干净的冰上解冻，混匀；
[0044]
1.2.移取25μl尿液样品于ep管中，测试渗透压；
[0045]
1.3.根据公式稀释尿液样品：v＝14124.55/(y-8.7545)，y：渗透压，v：所取样品体积/μl，100-v/μl为所加超纯水体积，最终在ep管中配成100μl的液体；
[0046]
1.4.移取内标提取试剂400μl于6.3中的ep管中，涡旋30s，超声10min；
[0047]
1.5.置于-40℃冰箱静置1h；
[0048]
1.6.高速离心，12000rpm，4℃，15min；
[0049]
1.7.取上清液于进样瓶中，冻存于-80℃冰箱直至检测。(冻存时间小于7天)。
[0050]
2.上机检测
[0051]
2.1.分析仪器：vanquish(thermo fisher scientific)超高效液相色谱仪
[0052]
2.2.液相条件：
[0053]
2.2.1.液相色谱柱为waters acquity uplc beh amide(2.1mm
×
100mm,1.7μm)。柱温：25℃。
[0054]
2.2.2.液相色谱a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈。流动相流速：0.5ml/min。
[0055]
2.2.3.仪器梯度为：0～0.5min,95％ b；0.5～7min,95％～65％ b；7～8min,65％～40％ b；8～9min,40％ b；9～9.1min,40％～95％ b；9.1～12min,95％ b。
[0056]
2.2.4.进样：3μl。
[0057]
2.3.质谱条件
[0058]
thermo q exactive hfx质谱仪能够在控制软件(xcalibur，thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：sheath gas flow rate:50arb,aux gas flow rate:10arb,capillary temperature:320℃,full ms resolution:60000,ms/ms resolution:7500,collision energy:10/30/60in nce mode,spray voltage:3.5kv(positive)或-3.2kv(negative)。
[0059]
3.物质定性
[0060]
原始数据经proteowizard软件转成mzxml格式后，使用r程序包(内核为xcms)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与biotreedb(v2.1)二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的cutoff值设为0.3。
[0061]
实施例3：妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子筛选和验证
[0062]
1.采用正交偏最小二乘判别分析(opls－da)观察gdm组与非gdm组代谢谱的差异，得出vip值；使用多元logistic回归，在调整了孕妇妊娠时年龄和bmi后，根据vip值最大且fdr校正后p值《0.05筛选出3个差异代谢物，然后根据fdr校正后p值更显著精简到2个差异代谢物。表一是opls-da和logistic回归得出的尿液代谢小分子相关变量(vip值由opls-da得出，p值由logistic回归得出，qvalue为经fdr校正后的p值)。
[0063]
2.非gdm组和gdm组尿液样本中代谢小分子的差异和诊断意义。
[0064]
经过校正母亲的年龄、bmi，正交偏最小二乘判别分析(opls－da)和多元logistic回归分析发现孕早期尿液中皮质酮和四氢醛酮-3-葡萄糖醛酸组合与gdm发生呈正相关。采用独立人群应用上述代谢小分子组合诊断妊娠期糖尿病，roc曲线下面积为0.6635，具有良好的辅助诊断价值(图1)。
[0065]
表一采用opls-da及logistic回归分析得出已知代谢物相关变量
[0066]
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[0092]

技术特征：
1.一种妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子组合，其特征在于该代谢小分子组合为皮质酮和四氢醛酮-3-葡萄糖醛酸的组合。2.用于检测权利要求1所述辅助诊断代谢小分子组合的检测方法，其特征在于该代谢小分子组合的检测方法为基于uplc-q exactive ms非靶标代谢组学检测方法。3.权利要求1所述的代谢小分子组合在制备辅助诊断妊娠期糖尿病的试剂盒中的应用。4.用于检测权利要求1所述代谢小分子组合的检测试剂在制备辅助诊断妊娠期糖尿病的试剂盒中的应用。5.一种用于辅助诊断妊娠期糖尿病的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测女性尿液中权利要求1所述代谢小分子组合的试剂。6.根据权利要求5所述的辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有采用uplc-qexactive ms非靶标代谢组学检测方法检测女性尿液中权利要求1所述代谢小分子组合的试剂。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水。

技术总结
本发明属于代谢组学及临床医学领域，公开了一种妊娠期糖尿病辅助诊断代谢小分子组合及其应用。该代谢小分子组合为皮质酮和四氢醛酮-3-葡萄糖醛酸的组合，可用于制备妊娠期糖尿病辅助诊断试剂盒。尿病辅助诊断试剂盒。尿病辅助诊断试剂盒。


技术研发人员：胡志斌 沈洪兵 马红霞 杜江波 林苑 江玥 徐欣
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/10/7