一种碱基编辑自然杀伤细胞及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术技术，具体涉及一种碱基编辑自然杀伤细胞及其制备方法和在杀伤肿瘤细胞中的应用。


背景技术：

2.2020年诺贝尔化学奖授予埃马纽埃尔
·
卡彭蒂耶(emmanuelle charpentier)、詹妮弗
·
杜德纳(jennifer a.doudna)，因她们开发了一种基因组编辑的方法。基因编辑技术已在癌症和基因缺陷疾病的治疗中得到了广泛的应用，该技术在癌症免疫治疗中的应用是目前最具前景的应用方向之一。通过crispr/cas9基因编辑技术对t细胞、nk细胞等效应细胞进行基因编辑，敲除t细胞和nk细胞中pd-1、tigit等免疫检查点基因，从而制备能够抵抗免疫抑制微环境的“超级”免疫细胞。然而，由于多项临床试验中披露了t细胞免疫治疗的不良反应，包括细胞因子风暴和移植物抗宿主病等，t细胞癌症免疫治疗在安全性方面不被业界看好。因此，越来越多的研究者把目光投向了一种更为安全的疗法，即nk细胞癌症免疫疗法。nk细胞免疫疗法在多项临床试验中均展现了良好的有效性和安全性，是一种极具潜力的抗癌新手段。
3.由于人类机体nk细胞含量少，仅占外周血单个核细胞(pbmc)的5％-15％，数目难以满足临床治疗的需求，nk细胞需要经过大规模体外扩增才能达到输注癌症患者所需要的细胞数目。目前，nk细胞来源主要有4种：1)健康捐献者来源的pbmc；2)脐带血(cb)；3)胚胎干细胞(esc)或诱导多能干细胞(ipsc)；4)nk-92细胞系。其中，nk-92细胞系是一种来源于人类恶性非霍奇金淋巴瘤(malignant non hodgkins lymphoma)的癌细胞，用于临床治疗存在巨大的风险。esc或ipsc来源的nk细胞由体外细胞因子刺激分化而来，由于未经过机体正常微环境的驯化，表型与人类机体成熟nk细胞存在差异，例如ipsc来源的nk细胞低表达cd16分子，并且不表达kir分子。因此，pbmc和cb成为了nk细胞癌症免疫治疗的主要细胞来源。
4.在过去的很多年中，pbmc来源的nk细胞难以进行遗传操作，很大程度上限制了nk细胞癌症免疫治疗的发展。随着分子生物学技术的发展，crispr/cas9和电穿孔转染技术开始被应用到nk细胞的遗传操作中。从此，困扰癌症免疫学家多年的世界性难题得以解决。
5.然而，尽管crispr/cas9基因编辑技术实现了对nk细胞的高效遗传操作，但crispr/cas9技术仍然存在一些安全性的顾虑。crispr/cas9基因编辑技术基于cas9蛋白对dna双链进行切割，断裂的dna双链在修复时可引入插入或缺失突变，从而对靶基因进行敲除。然而研究表明，这种以dna双链断裂(dsb)为基础的遗传操作存在重大缺陷，可能导致百万碱基级别的染色体缺失，对人类细胞基因组造成全局性破坏。另外，双链断裂可引起p53诱导的细胞凋亡，阳性编辑的细胞更倾向于富集p53突变的细胞，这种编辑的细胞注射到体内无疑增加了癌变风险。因此，利用更安全的基因编辑工具应用于nk细胞癌症免疫治疗是当下亟需解决的问题。
6.碱基编辑技术是在crispr/cas技术上融入了脱氨酶，通过对碱基脱氨在原位实现
碱基编辑的目的。此种编辑方式不需要引入dna双链断裂，理论上更加安全。目前使用最广的是胞嘧啶碱基编辑与腺嘌呤碱基编辑，分别可以实现c到t的转换或者a到g的转换。碱基编辑技术的提出迅速成为基因编辑领域炙手可热的工具。胞嘧啶碱基编辑可以作用于表达基因的cds区，通过靶向caa、cag、cga或tgg，产生终止密码子达到敲除基因的目的。除此之外，胞嘧啶碱基编辑与腺嘌呤碱基编辑均可以通过靶向起始密码子atg，通过将atg突变为ata、gtg或者acg达到敲除基因的目的。但是，目前采用碱基编辑技术编辑nk细胞仍存在效率不高或易脱靶等问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种利用碱基编辑系统对nk细胞中tigit基因进行编辑的方法，达到沉默tigit表达的效果。本发明所使用的碱基编辑系统是将脱氨酶嵌合到cas9蛋白中间。研究表明，所述碱基编辑系统在dna与rna水平的脱靶与野生型细胞相比无明显差异，表明了该方法对于细胞治疗产品的安全性。通过该方法获得的经过基因编辑的nk细胞可以作为药物及时有效地应用于临床免疫治疗，可以为建立碱基编辑技术联合过继免疫在肿瘤及病毒感染性疾病(例如hiv/aids)的治疗提供新的选择，还可以为新的有效基因靶点的研究提供支持，同时为相关疾病治疗的研究奠定坚实的技术基础。
8.本发明的目的之一是提供一种编辑编码tigit蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括使编码tigit的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述多核苷酸的靶c碱基或靶a碱基脱氨基；所述碱基编辑系统包括：
9.(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自n端至c端依次包括第一ncas9片段、脱氨酶片段、第二ncas9片段；所述第一ncas9片段的氨基酸序列如seq id no.43所示；所述第二ncas9片段的氨基酸序列如seq id no.44所示；
10.(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述多核苷酸中的靶c碱基和/或靶a碱基。
11.本发明的另一目的是提供一种碱基编辑系统，其为如上所述方法中所述的碱基编辑系统。
12.本发明的另一目的是提供一种nk细胞，其包含碱基突变的tigit基因；优选地，所述碱基突变是指c至t的转化、或a至g的转化；所述c至t的转化生成提前终止密码子或使得起始密码子突变，所述a至g的转化使得起始密码子突变。
13.本发明的另一目的是提供一种组合物，其包含如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上任一项所述的nk细胞；优选地，其进一步包含药学上可接受的载体。
14.本发明的另一目的是试剂盒，其包含如上所述的组合物。
15.本发明的另一目的是提供根据如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上任一项所述的nk细胞或如上所述的组合物的用途，所述用途选自以下至少任一项：
16.1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
17.2)制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
18.3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
19.4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
20.本发明的另一目的是提供一种预防和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的碱基编辑系统、nk细胞或组合物；所述病症选自以下至少任一项：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病。
21.本发明中，所述组合物可以与其他药物联用。
22.与现有技术相比，本发明具有如下显著有益效果：
23.本发明的研究结果显示：利用修饰的sgrna和碱基编辑蛋白，以电穿孔转染的方式将sgrna/be蛋白复合物(rnp)导入经体外扩增的原代nk细胞，可以高效敲除tigit基因。同时利用碱基编辑敲除tigit的nk细胞(tigit-nk细胞)，其在dna与rna水平均没有检测到明显脱靶。利用本发明所述方法制备的基因编辑nk细胞，可解除cd155+肿瘤细胞对nk细胞的免疫抑制作用。本发明制备的tigit-nk细胞相对于野生型nk细胞在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，具有明显的应用前景和临床应用价值。
附图说明
24.图1显示了体外转录与合成sgrna相对应的编辑效率。
25.图2流式细胞术检测不同rnp质量比对编辑效率的影响。
26.图3不同类型nk细胞抗肿瘤活性的比较。
27.图4不同类型nk细胞治疗后肿瘤体积变化。
28.图5不同类型nk细胞治疗后肿瘤质量变化。
29.图6全基因组测序分析碱基编辑nk的dna脱靶。
30.图7全转录组测序分析碱基编辑nk的rna脱靶。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
32.本发明提供了一种编辑编码tigit蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括使编码tigit的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述多核苷酸的靶c碱基或靶a碱基脱氨基；所述碱基编辑系统包括：
33.(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自n端至c端依次包括第一ncas9片段、脱氨酶片段、第二ncas9片段；所述第一ncas9片段的氨基酸序列如seq id no.43所示；所述第二ncas9片段的氨基酸序列如seq id no.44所示；
34.(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述多核苷酸中的靶c碱基和/或靶a碱基。
35.本发明所述方法中，所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna，可以是单链的或是双链的；dna可以是编码链或非编码链。
36.本发明所述方法中，可以直接讲所述融合蛋白或其变体可以直接递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中；或以信使rna(mrna)分子的形式递送，其在递送进入宿主细胞之后被翻译成所述融合蛋白或其变体；或以表达载体的形式递送，所述表达载体包含编码
一个或多个基因以表达融合蛋白或其变体的脱氧核糖核酸(dna)序列。
37.本发明所述方法中，在一些实施方式中，可以直接将所述融合蛋白或其变体递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中。
38.本发明所述方法中，在一些实施方式中，也可以将所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中，然后翻译成所述融合蛋白或其变体。其中所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以是dna形式或rna形式；dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna，dna可以是单链的或是双链的，dna可以是编码链或非编码链；rna形式例如是信使rna(mrna)。在一些优选实施方式中，所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以以表达载体的形式递送，所述表达载体上包含编码一个或多个拷贝的编码融合蛋白或其变体的多核苷酸。
39.本发明所述方法中，在一些实施方式中，可以直接将所述引导核苷酸序列递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中。
40.本发明所述方法中，在一些实施方式中，也可以将所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸递送至待编辑对象如体外体系或宿主细胞中，然后翻译成所述引导核苷酸序列。其中所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸可以是dna形式；dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna，dna可以是单链的或是双链的，dna可以是编码链或非编码链。在一些优选实施方式中，所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸可以以表达载体的形式递送，所述表达载体上包含编码一个或多个拷贝的编码引导核苷酸序列的多核苷酸。
41.本发明所述方法中，编码所述融合蛋白或其变体的多核苷酸包括：只编码融合蛋白或其变体的编码序列；融合蛋白或其变体的编码序列和各种附加编码序列；融合蛋白或其变体的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。编码所述引导核苷酸序列的多核苷酸包括：只编码引导核苷酸序列的编码序列；引导核苷酸序列的编码序列和各种附加编码序列；引导核苷酸序列的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。在一些实施方式中，本发明所述方法中，所述碱基编辑系统可以是包含一个或多个载体；所述一个或多个载体包含(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至所述融合蛋白或其变体的编码序列；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至所述引导核苷酸序列的编码序列；所述(i)和(ii)位于相同或不同载体上。在一些实施方式中，所述碱基编辑系统包含(i)融合蛋白或其变体，以及(ii)包含所述引导核苷酸序列的编码序列的载体。
42.所述第一调控元件可以调控所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸的转录。所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸可以是一个或多个，所述第一调控元件可以是一个或多个。所述第二调控元件可以调控所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸的转录。所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸可以是一个或多个，所述第二调控元件可以是一个或多个。
43.本发明所述方法中，所述融合蛋白的变体为所述融合蛋白的片段、衍生物和类似物，其可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。根据本发明的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在一些实施
方式中，所述融合蛋白的变体是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性，且具有所述融合蛋白相同或相似功能的蛋白。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性；具体地可为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。上述90％或90％以上同一性，可为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。所述相似功能是指保留原蛋白的75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高的功能。
44.本发明所述方法中，所述脱氨酶选自胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
45.其中，所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：apobec1、apobec2、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3d、apobec3f、apobec3g、apobec3h、apobec4、激活诱导的脱氨酶(aid)和pmcda1。优选地，所述胞嘧啶脱氨酶为apobec3a，其氨基酸序列如seq id no.49所示。
46.其中，所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型tada、突变型tada，或者两者组成的复合物wttada
–
tada*；优选为两者组成的复合物wttada
–
tada*，其氨基酸序列如seq id no.50所示。
47.本发明所述方法中，所述引导核苷酸序列的靶向序列如seq id no.1-seq id no.9至少任一所示。当所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑系统，优选地，当所述胞嘧啶脱氨酶为apobec3a时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如seq id no.1-8至少任一所示(其中seq id no.8用于对起始密码子编辑)；在一些实施方式中，当所述胞嘧啶脱氨酶为apobec3a时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如seq id no.12-19至少任一所示，优选地，在所述seq id no.12-19的3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在seq id no.12-19的3
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在seq id no.12-19的5
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰(其中seq id no.19或其修饰型用于对起始密码子编辑)。当所述脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶时，所述碱基编辑系统为腺嘌呤碱基编辑系统，优选地，当所述腺嘌呤脱氨酶为ectada时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如seq id no.9所示；在一些实施方式中，当所述腺嘌呤脱氨酶为ectada时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如seq id no.20所示，优选地，在所述seq id no.20的3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在seq id no.20的3
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在seq id no.20的5
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。其中，seq id no.1和seq id no.12或修饰的seq id no.12靶向相同序列，seq id no.2和seq id no.13或修饰的seq id no.13靶向相同序列，seq id no.3和seq id no.14或修饰的seq id no.14靶向相同序列，
……
依次类推，seq id no.9和seq id no.20或修饰的seq id no.20靶向相同序列。编辑器蛋白与靶点和不同序列sgrna的对应关系如下表所示：
[0048][0049][0050]
本发明所述方法中，所述引导核苷酸序列与融合蛋白的质量比为1:(2～20)；可以是1:(2～4)、1:(2～6)、1:(2～8)、1:(2～10)、1:(2～12)、1:(2～14)、1:(2～16)、1:(2～18)、1:(2～20)、(4～6)、1:(4～8)、1:(4～10)、1:(4～12)、1:(4～14)、1:(4～16)、1:(4～18)、1:(4～20)、1:(8～10)、1:(8～12)、1:(8～14)、1:(8～16)、1:(8～18)、1:(8～20)、1:(10～12)、1:(10～14)、1:(10～16)、1:(10～18)、1:(10～20)、1:(12～14)、1:(14～16)、1:(16～18)、1:(18～20)；优选地，为1:(2～8)；进一步优选地，为1:6。
[0051]
本发明所述方法中，所述编码tigit蛋白的多核苷酸与(a)、(b)分别接触，或与(a)和(b)形成的rnp复合物接触。
[0052]
本发明所述方法中，对于所述融合蛋白，在一些实施方式中，所述第一ncas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如seq id no.45所示。在一些实施方式中，所述第二ncas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如seq id no.45所示。在一些实施方式中，所述融合蛋白的两端还包含核定位信号；优选地，所述核定位信号的氨基酸序列如seq idno.46所示。在一些实施方式中，当所述核酸酶为胞嘧啶核酸酶时，所述融合蛋白还包含两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)片段；优选地，所述两个ugi片段的氨基酸序列如seq idno.47所示；进一步优选地，所述两个ugi片段通过gs肽段与所述第二ncas9片段的c端融合，所述gs肽段的氨基酸序列如seq idno.48所示。
[0053]
在一些优选实施方式中，所述融合蛋白结构为nh2-[核定位信号]-[第一ncas9片段]-[链接肽]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二ncas9片段]-[gs肽段]-[ugi肽段]-[ugi肽段]-[核定位信号]-cooh；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示，编码核苷酸序列如seq id no.23所示。
[0054]
在另一些优选实施方式中，所述融合蛋白结构为nh2-[核定位信号]-[第一ncas9片段]-[链接肽]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二ncas9片段]-[gs肽段]-[核定位信号]-cooh；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示，编码核苷酸序列如seq id no.24所示。
[0055]
本发明所述方法中，在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如seq id no.1-8至少任一所示；在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如seq id no.12-19至少任一所示，优选地，在所述seq id no.12-19的3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在seq id no.12-19的3
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在seq id no.12-19的5
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示时，所述引导核苷酸序列的靶向序列如seq id no.9所示。在一些优选实施方式中，当所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示时，所述引导核苷酸序列为合成序列，如seq id no.20所示，优选地，在所述seq id no.20的3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，即在seq id no.20的3
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰，在seq id no.20的5
′
端含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。
[0056]
本发明所述方法中，所述编码tigit蛋白的多核苷酸包含编码链和互补链；所述编码tigit蛋白的多核苷酸包含编码区和非编码区。所述脱氨基导致所述编码tigit蛋白的多核苷酸中c至t转化或a至g转化。在一些实施方式中，所述c至t转化和/或a至g转化发生在所述编码tigit的多核苷酸的编码序列中。在一些实施方式中，所述c至t转化和/或a至g转化导致所述tigit蛋白中的突变；所述tigit蛋白中的所述突变是功能丧失突变或非编码突变；优选地，所述功能丧失突变在所述tigit编码序列中引入提前终止密码子，其导致截短的或非功能性的tigit蛋白，或所述非编码突变是通过使所述tigit编码序列的起始密码子atg突变，其导致消除tigit表达。在一些实施方式中，将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变引入到所述编码tigit的多核苷酸中。
[0057]
在一些实施方式中，所述提前终止密码子是taa，tag，tga或者tga。例如，所述提前
终止密码子经由所述编码链上的第一个c的脱氨基从caa至taa转化生成；所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个c的脱氨基从cag至tag转化生成；所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个c的脱氨基从cga至tga转化生成；所述提前终止密码子经由所述互补链上的第三个c的脱氨基从tgg至tga转化生成；所述起始密码子突变经由所述互补链上的第三个c的脱氨基从atg至ata转化生成；所述起始密码子突变经由所述互补链上的第二个a的脱氨基从atg至acg转化生成；所述起始密码子突变经由所述编码链上的第一个a的脱氨基从atg至gtg转化生成。
[0058]
本发明所述方法适用的基因编辑的对象没有特别的限制，可以在体外或体内实施。
[0059]
在一些实施方式中，所述方法在培养的细胞中实施，可以在体细胞或生殖细胞，可以是动物细胞或人细胞；进一步优选地，所述细胞为自然杀伤细胞即nk细胞；进一步优选地，所述nk细胞选自来自外周血细胞的原代nk细胞(优选来自pbmc的原代nk细胞)、脐带血来源nk细胞、胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ips)或诱导多能干细胞(ips)诱导的nk细胞。
[0060]
可以使用基因递送载剂递送本文所述的多核苷酸至细胞或组织。本文所用“基因递送”、“基因转移”、“转导”等，其指代将外源性多核苷酸导入宿主细胞，如载体介导的基因转移(通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及协助“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔，“基因枪”递送以及用于导入多核苷酸的各种其他技术)。导入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的复制子，诸如染色体外复制子(例如，质粒)或核或线粒体染色体。许多“载体”已知能够介导基因向哺乳动物细胞的转移，如本领域已知和本文所述。在一些优选实施方式中，本发明所述方法通过电穿孔、病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化中的一种或多种方法将所述碱基编辑系统转入所述细胞中；更优选地，所述转染方法选自电穿孔方法；更进一步优选地，所述电穿孔方法选择的程序为lonza电转仪的cm158或者maxcyte的nk5程序。
[0061]
本发明所述方法在体内实施，可以作用于体细胞或生殖细胞，优选地，所述方法在哺乳动物中实施；进一步优选地，所述哺乳动物是啮齿动物；更进一步优选地，所述哺乳动物是人。进一步优选地，所述方法靶向哺乳动物的nk细胞，所述nk细胞选自来自外周血细胞优选pbmc的原代nk细胞、脐带血来源nk细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或诱导多能干细胞诱导的nk细胞。
[0062]
本发明还提供了一种碱基编辑系统，其为如上任一项所述方法中所述的碱基编辑系统。
[0063]
本发明还提供了一种nk细胞，其包含碱基突变的tigit基因。优选地，所述碱基突变是指c至t的转化、或a至g的转化；所述c至t的转化生成提前终止密码子或使得起始密码子突变，所述a至g的转化使得起始密码子突变。所述c至t的转化发生cds区中的caa、cag、cga、tgg；优选地，所述提前终止密码子为taa，tag，tga或者tga；所述c至t的转化发生起始密码子atg，所述起始密码子突变为ata；所述a至g的转化发生起始密码子atg，所述起始密码子突变为acg或gtg。在另一优选时候方式中，所述nk细胞，其根据所述的方法制备得到。
[0064]
本发明还提供了一种组合物，其包含如上任一项所述方法中所述的碱基编辑系统
或nk细胞。在一些优选实施方式，其进一步包含药学上可接受的载体。所述可接受的载体例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(peg、tween等)、螯合剂(edta等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如d-山梨糖醇、d-甘露糖、d-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，peg等)、非离子表面活性剂(吐温80，hco-50)等。
[0065]
本发明还提供了一种试剂盒，其包含如上所述的组合物。
[0066]
本发明还提供了一种根据如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上所述的nk细胞或如上所述的组合物的用途，所述用途选自以下至少任一项：
[0067]
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
[0068]
2)制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
[0069]
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
[0070]
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
[0071]
本发明还提供了一种预防和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述方法中所述的碱基编辑系统或如上所述的nk细胞或如上所述的组合物；所述病症选自以下至少任一项：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病等。
[0072]
其中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种。
[0073]
其中，所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选地，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种。
[0074]
其中，所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或几种。
[0075]
其中，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或几种。
[0076]
本发明中，所述的碱基编辑系统或如上所述的nk细胞或如上所述的组合物还可以与其他药物联用。在一些实施方式中，未编辑的nk细胞来自于有需要的受试者。在一些实施方式中，所述方法进一步包括，向有需要的受试者施用一种或多种细胞因子，例如包括但不限于是il-2和/或il-15等。与天然nk细胞相比，经碱基编辑的nk细胞对细胞因子刺激更加
敏感并表现出改善的扩增、抗肿瘤功能和抗病毒功能等。
[0077]
本发明所提供的组合物或用途中，所述碱基编辑系统或nk细胞可以是单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述碱基编辑系统或nk细胞的施用量通常可以为1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。
[0078]
如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等。
[0079]
本发明所述方法和应用中，当所述活性成分与其他治疗剂联用时，所述活性成分与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
[0080]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0081]
如本文所用，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0082]
如本文所用，“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
[0083]
如本文所用，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
[0084]
如本文所用，“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
[0085]
如本文所用，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。
[0086]
如本文所用，术语“核酸”和“核酸组分”可互换使用，其指具有核碱基和酸性部分的化合物，例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。在一些实施方式中，“核酸”是指单个核酸
残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式中，“核酸”是指包含三个或更多个单个核苷酸残基的寡核苷酸链。本文中所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如，一串至少三个核苷酸)。在一些实施方式中，“核酸”包括rna以及单链和/或双链dna。核酸可以是天然产生的或是非天然产生的分子。
[0087]
如本文所用，术语“表达”指多核苷酸转录成mrna的过程和/或转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组dna，则表达可包括真核细胞中mrna的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mrna或蛋白质的量予以确定。
[0088]
术语“调节元件”包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(ires)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚u序列)。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可指导在感兴趣的组织表达，例如肌肉、神经元、骨、皮肤等。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个pol iii启动子、pol ii启动子、pol i启动子、或其组合。pol iii启动子包括但不限于u6和h1启动子。pol ii启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子等。
[0089]
如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有c-末端和n-末端，所述c-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述n-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及d和l光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽(或其结构域)末端之间形成融合蛋白的连接。
[0090]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0091]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0092]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
[0093]
实施例1：碱基编辑nk细胞的制备
[0094]
1.原代nk细胞的扩增和培养
[0095]
1)从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞(pbmc)，于37℃水浴迅速融化。
[0096]
2)在一个新的15ml离心管中加入4ml含有10％fbs的rpmi-1640完全培养液，将1mlpbmc悬液转移至15ml离心管中。
[0097]
3)室温250
×
g离心5min。
[0098]
4)弃去上清液，使用1ml rpmi-1640培养液重悬细胞。
[0099]
5)在一个新的75ml细胞培养瓶中加入19ml rpmi-1640培养液，将上述细胞悬液转移至培养瓶中。
[0100]
6)向培养瓶中加入人重组il-2蛋白，终浓度200u/ml。
[0101]
7)将培养瓶置于37℃5％co2培养箱中，培养过夜后，将培养瓶中的pbmc进行细胞计数。
[0102]
8)从液氮取出冻存的辐照ek562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化。
[0103]
9)在一个新的15ml离心管中加入4ml rpmi-1640完全培养液，将ek562细胞悬液转移至15ml离心管中。
[0104]
10)室温250
×
g离心5min。
[0105]
11)弃去上清液，使用1ml rpmi-1640培养液重悬细胞并进行细胞计数。
[0106]
12)按pbmc：ek562＝1：1的效靶比向培养瓶中加入ek562细胞。
[0107]
13)将细胞置于37℃5％co2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1
×
106个/ml范围内，根据培养液体积加入il-2，终浓度100u/ml。
[0108]
14)培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数，并按照pbmc：ek562＝1：1的效靶比向培养瓶中再次加入ek562细胞。
[0109]
15)将细胞置于37℃5％co2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1
×
106个/ml范围内，根据培养液体积加入il-2，终浓度100u/ml。
[0110]
16)培养至第14天后，培养瓶中nk细胞的纯度可达到95％以上。
[0111]
2.sgrna的制备
[0112]
通过对tigit基因的cds区分析，本发明选取了可能突变成终止密码子的靶序列(seq id no.51-seq id no.59)。相应的sgrna可以通过体外转录或者公司合成方式获得。两者均能实现编辑，相比于体外转录，合成的sgrna可以对sgrna末端进行修饰，有助于提高编辑效率。体外转录的sgrna序列如seq id no.1-seq id no.9所示，合成sgrna序列如seq id no.12-seq id no.20所示，其中，每条序列在3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。
[0113]
其中，seq id no.1和修饰的seq id no.12编号为tigit-1，seq id no.2和修饰的seq id no.13编号为tigit-2，seq id no.3和修饰的seq id no.14编号为tigit-3，seq id no.4和修饰的seq id no.15编号为tigit-4，seq id no.5和修饰的seq id no.16编号为tigit-5，seq id no.6和修饰的seq id no.17编号为tigit-6，seq id no.7和修饰的seq id no.18编号为tigit-7，seq id no.8和修饰的seq id no.19编号为tigit-8，seq id no.9和修饰的seq id no.20编号为tigit-9。seq id no.1～9为体外转录获得，seq id no.12～20为合成方式获得。
[0114]
以下将简要说明体外转录的步骤。
[0115]
1)退火，将每条sgrna加上tagg内切酶粘性末端上游序列(seq id no.21-seq id no.29)和加上aaac内切酶粘性末端的下游序列(seq id no.30-seq id no.38)后，一起通过程序(95℃，5min；95℃-85℃(以2℃/s速度降温)；85℃-25℃(以-0.1℃/s速度降温)；维持在4℃)退火，得到退火产物即oligo片段。
[0116]
2)线性化，将载体puc57-sgrna expression vector(addgene#51132)经过bsai(neb：r0539l)线性化。线性化体系：puc57-sgrna expression vector 2μg；buffer(neb：r0539l)5μl；bsai 1μl；ddh2o补齐到50μl。
[0117]
3)连接，将退火产物连接到经过bsai线性化的puc57-sgrna expression vector载体上。连接体系：t4连接buffer(neb：m0202l)1μl，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μm)5μl，t4连接酶(neb：m0202l)0.5μl，ddh2o补齐到10μl，16℃连接1小时。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定。对阳性克隆摇菌提取质粒(axygene：ap-mn-p-250g)并测定浓度。
[0118]
4)pcr扩增，用引物sgrna-f(seq id no.39：tctcgcgcgtttcggtgatgacgg)和sgrna-r(seq id no.40：aaaaaaagcaccgactcggtgccactttttc)将含有t7启动子的sgrna序列利用pcr扩增，凝胶电泳鉴定条带后用rna-secure(thermo，#am7005)65℃处理15分钟，然后将扩增产物回收(axygene：ap-pcr-250g)并测定浓度。
[0119]
5)体外转录，利用t7转录试剂盒(thermo，#am1354)将sgrna的dna体外转录为rna，凝胶电泳鉴定后用rna回收试剂盒(thermo，#am1908)将sgrna回收，测浓度。
[0120]
3.碱基编辑蛋白(be蛋白)的制备和纯化
[0121]
1)密码子优化。将所使用的胞嘧啶碱基编辑蛋白与腺嘌呤碱基编辑蛋白进行大肠杆菌密码子优化，由金斯瑞公司合成序列，并构建入pet28a表达质粒骨架中。优化后序列如下：胞嘧啶碱基编辑蛋白dna序列：seq id no.41；腺嘌呤碱基编辑蛋白dna序列：seq id no.42。
[0122]
2)质粒转化。将质粒分别转化bl21感受态，涂板，挑单克隆进行摇菌表达，准备2l培基在37℃，220rpm的摇床摇菌，待菌液od值在0.6-0.8之间加iptg 2ml(2m浓度)，诱导培养24小时后收菌。
[0123]
3)收菌。将菌液高速离心：4000rpm 30min，弃上清。
[0124]
4)破菌。用buffer a将离心后的菌体吹散后，加入蛋白酶抑制剂，用高压破碎机将大肠杆菌破碎。高速离心后取上清。buffer a配方：25mm tris ph＝8.0，500mm nacl，10％(v/v)glycerol，0.22μm滤器过滤。
[0125]
5)过柱。将破碎后的上清用0.45μm滤膜过滤，然后加入buffera润洗后的钴离子亲和层析柱(clontech，635504)对带his标签的cas9蛋白吸附。
[0126]
6)去杂质。用40ml添加有5mm咪唑的buffer a 过柱子，以去除亲和力较低的杂质。
[0127]
7)洗脱。用30ml添加有500mm咪唑的buffera过柱子，置换出目的蛋白。
[0128]
8)浓缩。western blot鉴定后将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，3900rpm，20min。
[0129]
9)浓缩后的蛋白进行离子交换层析(ion exchange chromatography(iec))，以除去与蛋白结合的核酸。然后再次浓缩，分别得到氨基酸序列如seq id no.10所示的胞嘧啶碱基编辑蛋白(cbe蛋白)，以及氨基酸序列如seq id no.11所示的腺嘌呤碱基编辑蛋白(abe蛋白)，测定浓度，分装，冻存备用。
[0130]
4.电穿孔转染nk细胞
[0131]
1)rnp混合，根据比例将步骤2制备的sgrna分别与步骤3制备的be蛋白以1：4的质量比混合，用枪头轻轻吹打混匀。
[0132]
2)准备nk细胞。用pbs将步骤1制备的nk细胞洗一遍并离心。
[0133]
3)电穿孔转染。
[0134]
a)一个可选的实施方案是，采用lonza 4d电转仪进行电穿孔转染，用电转液将nk细胞和rnp重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的135个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养9天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
[0135]
b)一个可选实施方案是，采用maxcyte电转仪进行电穿孔转染，用电转液将细胞和rnp重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的5个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养9天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
[0136]
实施例2：电转程序的优化
[0137]
目前对于cas9蛋白已经有比较成熟的电转方案，但是碱基编辑蛋白相比于cas9要大约50kda，因此所适用的电转程序也不同。本实施例中选取编号为tigit-1的sgrna进行电转条件优化，以进一步提高碱基编辑效率。具体序列为tigit-1：seq id no.1。
[0138]
1)从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞(pbmc)，于37℃水浴迅速融化。
[0139]
2)在一个新的15ml离心管中加入4ml含有10％fbs的rpmi-1640完全培养液，将1mlpbmc悬液转移至15ml离心管中。
[0140]
3)室温250
×
g离心5min。
[0141]
4)弃去上清液，使用1ml rpmi-1640培养液重悬细胞。
[0142]
5)在一个新的75ml细胞培养瓶中加入19ml rpmi-1640培养液，将上述细胞悬液转移至培养瓶中。
[0143]
6)向培养瓶中加入人重组il-2蛋白，终浓度200u/ml。
[0144]
7)将培养瓶置于37℃5％co2培养箱中，培养过夜后，将培养瓶中的pbmc进行细胞计数。
[0145]
8)从液氮取出冻存的辐照ek562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化。
[0146]
9)在一个新的15ml离心管中加入4ml rpmi-1640完全培养液，将ek562细胞悬液转移至15ml离心管中。
[0147]
10)室温250
×
g离心5min。
[0148]
11)弃去上清液，使用1ml rpmi-1640培养液重悬细胞并进行细胞计数。
[0149]
12)按pbmc：ek562＝1：1的效靶比向培养瓶中加入ek562细胞。
[0150]
13)将细胞置于37℃5％co2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1
×
106个/ml范围内，根据培养液体积加入il-2，终浓度100u/ml。
[0151]
14)培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数，并按照pbmc：ek562＝1：1的效靶比向培养瓶中再次加入ek562细胞。
[0152]
15)将细胞置于37℃5％co2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1
×
106个/ml范围内，根据培养液体积加入il-2，终浓度100u/ml。
[0153]
16)培养至14天，培养瓶中nk细胞的纯度可达到95％以上。
[0154]
17)收集上述体外扩增的原代nk细胞，室温250
×
g离心5min。
[0155]
18)弃上清，采用1
×
pbs缓冲液重悬细胞，室温250
×
g离心5min。
[0156]
19)弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬nk细胞。
[0157]
20)rnp混合，根据比例将实施例1步骤3制备的cbe蛋白和实施例1步骤2制备的sgrna以4:1的质量比混匀。
[0158]
21)将rnp混合液加入上述准备好的nk细胞悬液中，于电转仪进行电转。
[0159]
22)采用lonza电转仪进行电穿孔转染，lonza能够查到的电转程序有135个(表1)。本实施例的目的是确定细胞活率与电转效率的最优组合。本发明将利用这135个电转程序分别对相同的rnp电转。
[0160]
23)电转后培养9天检测编辑效率和细胞增殖情况。表2显示对lonza135种电转程序所对应的编辑效率，表3对应的培养9天以后，细胞的增殖比例。结合表2和表3，发现cm158和cm189两种电转程序其编辑效率和细胞增殖倍数均能维持较高水平，且cm158电转程序的综合效果相对更好。
[0161]
同样方法，本发明针对maxcyte电转仪的电转程序的编辑效率进行了测定，其中nk1、nk2、nk3、nk4、nk5五种电转程序分别对应的编辑效率分别是12.4％、29.4％、32.1％、10.2％和43.5％；对应的细胞增殖倍数分别是189、234、390、255和310。综合比较nk5电转程序在编辑效率和细胞增殖两个维度获得较为理想结果。
[0162]
表1 lonza仪器所用电转程序
[0163][0164]
表2不同lonza电转程序对应的编辑效率
[0165]
2.0％3.5％6.3％3.4％5.3％21.0％20.0％12.0％6.0％0.0％0.0％3.0％5.0％2.1％4.0％8.0％4.6％2.4％2.0％1.8％5.0％12.0％53.4％68.0％74.0％54.0％57.0％1.3％2.4％3.4％5.3％12.0％34.0％43.0％12.0％34.0％4.3％5.7％6.9％3.4％2.1％2.0％1.8％2.6％3.2％5.7％6.8％23.0％16.0％25.0％32.0％44.0％46.0％21.0％4.8％9.0％11.0％15.0％12.0％23.0％32.0％22.0％10.0％
9.0％23.0％0.0％0.0％23.0％32.0％43.0％23.0％34.0％11.0％22.0％0.0％0.0％34.0％43.0％50.0％45.0％37.0％3.5％7.0％9.0％4.6％11.0％17.0％14.0％12.0％22.0％0.0％1.2％3.4％6.0％8.0％11.0％19.0％22.0％11.0％3.5％2.0％3.0％4.0％23.0％11.0％34.0％43.0％22.0％2.5％2.0％22.0％34.0％12.0％43.0％23.0％44.0％23.0％0.0％8.0％3.0％12.0％32.0％43.0％43.0％45.0％50.0％1.3％2.4％2.3％11.0％14.0％11.0％8.0％3.0％2.0％
[0166]
其中，表2中的行和列分别与表1对应。
[0167]
表3不同lonza电转程序对应的细胞增殖倍数
[0168]
18620324418926523018668971542052313223852161935854234203264326385287164998826521523623533819568466624421627627532996109897727623628724625724513514597246243235321236233190122872752752832373212902001869729823324538523523912214862862622643122862911021434625921524526823624516887136239297244365346234196122432342332392312861792301686833026426519623318520312213320236198254258235235231246
[0169]
其中，表3中的行和列分别与表1对应。
[0170]
实施例3：高效sgrna的筛选
[0171]
利用胞嘧啶碱基编辑工具敲除tigit基因，所选用的sgrna需要针对caa、cag、cga或者tgg三联体密码子，突变成终止密码子，又或者作用于起始密码子atg，突变成ata。通过分析发现有7个sgrna(seq id no.1-seq id no.7)可以突变成终止密码子，一个sgrna(seq id no.8)可以突变起始密码子。利用腺嘌呤碱基编辑工具可以将起始密码子atg突变成gtg(seq id no.9)。
[0172]
本实施例对这9组sgrna(tigit-1～9)分析其相对应的编辑效率，即同时分析体外转录获得的sgrna(seq id no.1～9)与公司合成的sgrna(3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.12～20)的编辑效率。
[0173]
利用lonza的cm158电转程序对相应的rnp电转，其中，sgrna与编辑蛋白的质量比为1:4。电转完培养9天进行编辑效率分析。图1显示不同sgrna对应的编辑效率。相比体外转录的seq id no.1～9所示的sgrna，采用合成方法合成的3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.12～20所示的sgrna的编辑效率均显著提高，其中至少一方面
原因是由于采用合成方法合成的sgrna进行了修饰，其能够延长sgrna在细胞内的存在时间。
[0174]
通过对9组sgrna(tigit-1～9)分析，发现不同sgrna的编辑效率也存在较大差异，其中，3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.12所示的tigit-1位点的编辑效率最高，编辑效率达到了78％。3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.19～20所示的tigit-8和tigit-9作用于起始密码子的sgrna，也可以实现较为高效的敲除tigit。
[0175]
实施例4：rnp比例的优化
[0176]
根据实施例2和3对电转程序及sgrna优化的结果，选定lonza电转仪cm158程序为优选电转程序，所用的高效sgrna为3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.12所示的tigit-1。在此基础上进一步对sgrna与碱基编辑蛋白的比例进行优化，以进一步提高碱基编辑效率。
[0177]
1)收集实施例1步骤1经体外扩增的原代nk细胞，室温250
×
g离心5min。
[0178]
2)弃上清，采用1
×
pbs缓冲液重悬细胞，室温250
×
g离心5min。
[0179]
3)弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬nk细胞。
[0180]
4)rnp混合，根据比例将实施例1步骤2制备的sgrna和实施例1步骤3制备的cbe蛋白以1:2、1:4、1:6、1:8的质量比混匀。
[0181]
5)将rnp混合液加入准备好的nk细胞悬液中，于电转仪进行电转。
[0182]
6)采用lonza电转仪进行电穿孔转染，电转程序设置为cm158。
[0183]
7)电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养9天后进行流式检测。由图2所示，当sgrna与蛋白质量比为1:6时，编辑效率达到了最高的92.7％。
[0184]
实施例5：碱基编辑nk细胞抗肿瘤活性评价
[0185]
1.生物发光法检测nk细胞体外杀伤活性
[0186]
1)收集肿瘤细胞和nk细胞进行计数，向96孔板中加入肿瘤细胞，10000个/孔，终体积50μl。
[0187]
2)收集野生型nk细胞(nk-wt)、cas9基因编辑的nk细胞(nk-cas9)(构建步骤详见专利文献cn 202011056575.7，利用cas9+sgrna-2编辑获得的nk细胞，其中sgrna-2的序列对应cn 202011056575.7的seq no id.2)和实施例4中sgrna与蛋白质量比为1:6时获得的经cbe碱基编辑的nk细胞(nk-cbe)，计数后分别按nk细胞：肿瘤细胞＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μlnk细胞。
[0188]
3)每组做三个重复孔，另设立肿瘤细胞单独培养以及nk细胞单独培养的对照孔。
[0189]
4)培养24h后，每孔加入100μl 生物发光检测试剂(购自promega公司)。
[0190]
5)室温震荡1min后，静置10min，随后与酶标仪检测生物发光强度。
[0191]
6)按以下公式计算nk细胞杀伤活力：
[0192][0193]
mean
mix
：nk细胞与肿瘤细胞共培养组的平均发光强度；
[0194]
mean
nk
：nk细胞单独培养组的平均发光强度；
[0195]
mean
tumor
：肿瘤细胞单独培养组的平均发光强度。
[0196]
如图3和表4所示，野生型、cas9基因编辑和cbe碱基编辑的nk细胞与肿瘤细胞共培养24小时后，通过生物发光法检测nk细胞对靶细胞的杀伤百分比，结果显示cas9基因编辑和cbe碱基编辑的nk细胞相对于野生型nk细胞均具有更强的抗肿瘤活性。
[0197]
表4野生型、cas9基因编辑和cbe碱基编辑nk细胞抗肿瘤活性的比较
[0198][0199]
e:t是指效应细胞(effector)与靶细胞(target)的数量比值，此处效应细胞即为nk细胞。
[0200]
2.基因编辑nk细胞抗肿瘤活性的体内检测
[0201]
1)选取t、b和nk细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(scid-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于spf级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
[0202]
2)消化并收集h1975肺癌细胞，使用无血清rpmi-1640培养液重悬细胞。
[0203]
3)将h1975细胞悬液浓度调整至3
×
107个/ml。
[0204]
4)取6周龄雄性scid-bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
[0205]
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μl。
[0206]
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为4组，每组4只，分别接受野生型nk细胞(nk-wt)、cas9基因编辑的nk细胞(nk-cas9)和实施例4中sgrna与蛋白质量比为1:6时经cbe碱基编辑的nk细胞(nk-cbe)过继免疫治疗，空白对照组(control)仅注射rpmi-1640培养液。nk细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射1
×
107个nk细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次nk细胞注射治疗。从接种肿瘤细胞后的第3天开始测量小鼠瘤块大小，每2天测量一次，同时记录小鼠体重。
[0207]
如图4、图5和表5所示，经基因编辑(nk-cas9)或cbe碱基编辑(nk-cbe)治疗后，肺
癌荷瘤小鼠肿瘤生长受到明显抑制，经过3次nk细胞过继免疫治疗，基因编辑(nk-cas9)或cbe碱基编辑(nk-cbe)组肿瘤体积较野生型(nk-wt)治疗组明显缩小，肿瘤重量明显降低，表明碱基编辑的nk细胞和基因编辑的nk细胞在体内均具有更强的抗肿瘤效应。
[0208]
表5荷瘤小鼠肿瘤体积
[0209][0210][0211]
实施例6：碱基编辑nk细胞安全性评价
[0212]
1.利用全基因组测序分析dna脱靶
[0213]
利用上述优化的lonza的cm158电转程序，采用3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.12所示的tigit-1sgrna电转nk细胞，其中，sgrna与编辑蛋白的质量比为1:4，电转完培养14天后收集编辑后的nk细胞，同时收集未编辑的野生型nk细胞。利用天根血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)提取nk细胞基因组dna，送北京安诺优达进行全基因组测序，测序深度在25-30x。测序的原始数据通过bwa v0.7.16比对到人的参考基因组上(grch38/hg38)。snp位点通过gatk haplotypecaller软件进行分析，根据潜在的脱靶位点计算脱靶效率。
[0214]
图6显示，通过与参考基因组与野生型nk细胞去除相关的snp，利用碱基编辑处理后的nk细胞没有发现dna脱靶。
[0215]
2.利用转录组分析rna脱靶
[0216]
利用上述优化的lonza的cm158电转程序，利用3
′
端和5
′
端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的seq id no.12所示的tigit-1sgrna电转nk细胞，其中，sgrna与编辑蛋白的质量比为1:4，电转完培养14天后收集编辑后的nk细胞，同时收集未编辑的野生型nk细胞。利用天根rna easy fast动物组织/细胞总rna提取试剂盒(dp451)提取编辑nk与未编辑nk细胞总rna，送北京安诺优化进行rna测序(illumina hiseq x 10)。每个样品的读取深度约为
2000万。通过star软件(版本2.5.1)将读段映射到人参考基因组(hg38)，使用来自gencode v30版的注释。删除重复后，通过gatk haplotypecaller(版本4.1.2)识别变体，并用qd(质量按深度)过滤，所有变体均通过bam-readcount进行验证并量化，参数为-q 20-b 30。具体结果如图7所示，利用碱基编辑系统敲除tigit基因的nk细胞，在全转录组水平没有检测明显的脱靶。
[0217]
综上所述可见，本发明所述的碱基编辑nk细胞在体内、体外相比普通nk细胞均具有更强的抗肿瘤活性，且碱基编辑的nk细胞相对于基因编辑的nk细胞具有更好的安全性，因此本发明所述的碱基编辑nk细胞有望开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值。
[0218]
seq id no.1
[0219][0220]
seq id no.2
[0221][0222]
seq id no.3
[0223][0224]
seq id no.4
[0225][0226]
seq id no.5
[0227][0228]
seq id no.6
[0229][0230]
seq id no.7
[0231][0232]
seq id no.8
[0233][0234]
seq id no.9
[0235][0236]
seq id no.10
[0237][0238][0239]
seq id no.11
[0240][0241][0242]
seq id no.12
[0243][0244]
seq id no.13
[0245][0246]
seq id no.14
[0247][0248]
seq id no.15
[0249][0250]
seq id no.16
[0251][0252]
seq id no.17
[0253][0254]
seq id no.18
[0255][0256]
seq id no.19
[0257][0258]
seq id no.20
[0259][0260]
seq id no.21
[0261][0262]
seq id no.22
[0263][0264]
seq id no.23
[0265][0266]
seq id no.24
[0267][0268]
seq id no.25
[0269][0270]
seq id no.26
[0271][0272]
seq id no.27
[0273][0274]
seq id no.28
[0275][0276]
seq id no.29
[0277][0278]
seq id no.30
[0279][0280]
seq id no.31
[0281][0282]
seq id no.32
[0283][0284]
seq id no.33
[0285][0286]
seq id no.34
[0287][0288]
seq id no.35
[0289][0290]
seq id no.36
[0291][0292]
seq id no.37
[0293][0294]
seq id no.38
[0295][0296]
seq id no.39
[0297][0298]
seq id no.40
[0299][0300]
seq id no.41
[0301]
[0302]
[0303]
[0304][0305]
seq id no.42
[0306]
[0307]
[0308]
[0309][0310]
seq id no.43
[0311][0312]
seq id no.44
[0313][0314][0315]
seq id no.45
[0316][0317]
seq id no.46
[0318][0319]
seq id no.47
[0320][0321]
seq id no.48
[0322][0323]
seq id no.49
[0324][0325]
seq id no.50
[0326][0327]
seq id no.51
[0328][0329]
seq id no.52
[0330][0331]
seq id no.53
[0332][0333]
seq id no.54
[0334][0335]
seq id no.55
[0336][0337]
seq id no.56
[0338][0339]
seq id no.57
[0340][0341]
seq id no.58
[0342]
[0343]
seq id no.59
[0344][0345]
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种编辑编码tigit蛋白的多核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括使编码tigit的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述多核苷酸的靶c碱基和/或靶a碱基脱氨基；所述碱基编辑系统包括：(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自n端至c端依次包括第一ncas9片段、脱氨酶片段、第二ncas9片段；所述第一ncas9片段的氨基酸序列如seq id no.43所示；所述第二ncas9片段的氨基酸序列如seq id no.44所示；(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述多核苷酸中的靶c碱基和/或靶a碱基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述碱基编辑系统包含一个或多个载体；所述一个或多个载体包含(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至所述融合蛋白或其变体的编码多核苷酸；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸；所述(i)和(ii)位于相同或不同载体上。2)所述碱基编辑系统包含(i)融合蛋白或其变体，以及(ii)包含所述引导核苷酸序列的编码多核苷酸的载体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述脱氨基导致所述编码tigit蛋白的多核苷酸中c至t转化或a至g转化；2)所述融合蛋白的变体是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具有90％以上序列同一性，且具有所述融合蛋白相同或相似功能的蛋白；3)所述脱氨酶选自胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶；优选地，所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：apobec1、apobec2、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3d、apobec3f、apobec3g、apobec3h、apobec4、激活诱导的脱氨酶(aid)和pmcda1；和/或，所述腺嘌呤脱氨酶为wttada
–
tada*；4)所述引导核苷酸序列如seq id no.1-9、12-20至少任一所示；优选地，在所述引导核苷酸序列的3'端和5'端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰；5)所述引导核苷酸序列与融合蛋白的质量比为1:(2～20)；优选地，为1:(2～8)；6)所述编码tigit蛋白的多核苷酸与(a)、(b)分别接触，或与(a)和(b)形成的rnp复合物接触。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)当所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑系统，所述引导核苷酸序列如seq id no.1-8、12-19至少任一所示；优选地，所述胞嘧啶脱氨酶为apobec3a；2)当所述脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶时，所述碱基编辑系统为腺嘌呤碱基编辑系统，所述引导核苷酸序列如seq id no.9或20所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述第一ncas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如seq id no.45所示；2)所述第二ncas9片段与所述脱氨酶通过链接肽链接；优选地，所述链接肽的氨基酸序列如seq id no.45所示；
3)所述融合蛋白的两端还包含核定位信号；优选地，所述核定位信号的氨基酸序列如seq id no.46所示；4)当所述核酸酶为胞嘧啶核酸酶时，所述融合蛋白还包含两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)片段；优选地，所述两个ugi片段的氨基酸序列如seq id no.47所示；进一步优选地，所述两个ugi片段通过gs肽段与所述第二ncas9片段的c端融合，所述两个gs肽段的氨基酸序列如seq id no.48所示。6.根据权利要求1的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述融合蛋白结构为nh
2-[核定位信号]-[第一ncas9片段]-[链接肽]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二ncas9片段]-[gs肽段]-[ugi肽段]-[ugi肽段]-[核定位信号]-cooh；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示；2)所述融合蛋白结构为nh
2-[核定位信号]-[第一ncas9片段]-[链接肽]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二ncas9片段]-[gs肽段]-[核定位信号]-cooh；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示；3)当所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示时，所述引导核苷酸序列如seq id no.1-8、12-19至少任一所示；4)当所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示时，所述引导核苷酸序列如seq id no.9或20所示。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)如seq id no.10所示的融合蛋白的编码多核苷酸序列如seq id no.23所示；2)如seq id no.11所示的融合蛋白的编码多核苷酸序列如seq id no.24所示。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述编码tigit蛋白的多核苷酸包含编码链和互补链；2)所述编码tigit蛋白的多核苷酸包含编码区和非编码区；3)所述c至t转化和/或a至g转化发生在所述编码tigit的多核苷酸的编码序列中；4)所述c至t转化和/或a至g转化导致所述tigit蛋白中的突变；所述tigit蛋白中的突变是功能丧失突变或非编码突变；优选地，所述功能丧失突变在所述tigit编码序列中引入提前终止密码子，其导致截短的或非功能性的tigit蛋白，或所述非编码突变是通过使所述tigit编码序列的起始密码子突变，其导致消除tigit表达；5)将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变引入到所述编码tigit的多核苷酸中。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述提前终止密码子是taa，tag，tga或者tga；2)所述起始密码子为atg。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个c的脱氨基从caa至taa转化生成；2)所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个c的脱氨基从cag至tag转化生成；3)所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个c的脱氨基从cga至tga转化生成；4)所述提前终止密码子经由所述互补链上的第三个c的脱氨基从tgg至tga转化生成；5)所述起始密码子突变经由所述互补链上的第三个c的脱氨基从atg至ata转化生成；6)所述起始密码子突变经由所述互补链上的第二个a的脱氨基从atg至acg转化生成；
7)所述起始密码子突变经由所述编码链上的第一个a的脱氨基从atg至gtg转化生成。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述方法在体外实施；优选地，所述方法在培养的细胞中实施；进一步优选地，所述细胞为自然杀伤细胞即nk细胞；进一步优选地，所述nk细胞选自来自外周血细胞优选pbmc的原代nk细胞、脐带血来源nk细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或诱导多能干细胞诱导的nk细胞；2)所述方法在体内实施；优选地，所述方法在哺乳动物中实施；进一步优选地，所述哺乳动物是啮齿动物；更进一步优选地，所述哺乳动物是人；更进一步优选地，所述方法靶向哺乳动物的nk细胞。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过电穿孔、病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化中的一种或多种方法将所述碱基编辑系统转入所述细胞中；优选地，所述转染方法选自电穿孔方法；进一步优选地，所述电穿孔方法选择的程序为lonza电转仪的cm158或者maxcyte的nk5程序。13.一种碱基编辑系统，其特征在于，其为权利要求1～12任一项所述方法中所述的任一碱基编辑系统。14.一种nk细胞，其特征在于，其包含碱基突变的tigit基因。15.如权利要求14所述的nk细胞，其特征在于，所述碱基突变是指c至t的转化、或a至g的转化；所述c至t的转化生成提前终止密码子或使得起始密码子突变，所述a至g的转化使得起始密码子突变。16.根据权利要求15所述的nk细胞，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述c至t的转化发生cds区中的caa、cag、cga、tgg；优选地，所述提前终止密码子为taa，tag，tga或者tga；2)所述c至t的转化发生起始密码子atg，所述起始密码子突变为ata；3)所述a至g的转化发生起始密码子atg，所述起始密码子突变为acg或gtg。17.根据权利要求14～16任一项所述的nk细胞，其特征在于，其根据权利要求11或12所述的方法制备得到。18.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求13所述的碱基编辑系统或如权利要求14～17任一项所述的nk细胞；优选地，其进一步包含药学上可接受的载体。19.一种试剂盒，其包含权利要求18所述的组合物。20.根据权利要求13所述的碱基编辑系统或权利要求14～17任一项所述的nk细胞或权利要求18所述的组合物的用途，所述用途选自以下至少任一项：1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；2)制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。21.一种预防和/或病症的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求13所述的碱基编辑系统或权利要求14～17任一项所述的nk细胞或权利要求18所述的组合物；所述病症选自以下至少任一项：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病。
22.根据权利要求20所述的应用或如权利要求21所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种；2)所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选地，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种；3)所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或几种；4)所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或几种。23.根据权利要求20所述的应用或如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的碱基编辑系统或如上所述的nk细胞或如上所述的组合物与其他药物联用。

技术总结
本发明属于生物医药领域，公开了一种编辑编码TIGIT蛋白的多核苷酸的方法、碱基编辑NK细胞、制备方法和应用。使编码TIGIT的多核苷酸与碱基编辑系统接触，以对所述C或A脱氨基；所述系统包括：(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白自N端至C端依次包括第一nCas9片段、脱氨酶片段、第二nCas9片段；(b)引导核苷酸序列或其编码多核苷酸。该碱基编辑NK细胞通过安全高效的碱基编辑技术敲除NK细胞的TIGIT基因。本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外具有高效的杀伤肿瘤细胞的作用，可望开发成为一种安全而有效的抗癌药物，具有广阔的临床应用前景和开发价值。阔的临床应用前景和开发价值。阔的临床应用前景和开发价值。


技术研发人员：徐天宏 司桂凡 郁存双
受保护的技术使用者：上海贝斯昂科生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.25
技术公布日：2023/10/7