具有高脂质生产率的重组藻类的制作方法

具有高脂质生产率的重组藻类
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2.本技术根据35 u.s.c.
§
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3.序列表的并入
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发明领域
5.本发明涉及重组藻类突变生物体的提供以及生产脂质的方法。
6.发明背景
7.生物燃料的生产为开发能够以合理成本获得的环境无害能源提供了巨大机会。已经致力于使用藻类或其他微生物来生产碳氢化合物，由于该碳氢化合物的高脂质含量，它们可用作生物柴油或其他生物燃料。其他专用化学品也可以从这些生物体中获得并用于消费品。
8.由于藻类利用阳光中的能量将水和二氧化碳结合起来生产生物质，因此实现生产率的提高为碳中性燃料来源提供了可能。因此，开发具有极高脂质生产率的藻株来生产藻类来源生物燃料为显著减少释放到大气中的新二氧化碳从而减少全球变暖问题提供了可能。
9.商业上可行的藻类生物燃料的开发需要具有高脂质和生物质生产率的株系。即使是最高产的野生型株系也不具有足够的生产力来允许对该资源进行经济上可行的开发。提高生物燃料和其他产品的藻类产量的策略已包括改变提供给生物体的营养，诸如在缺乏氮、磷或硅的培养基中培养生物体。其他策略包括已改变培养条件或环境规程，或针对生物体遗传工程的各种努力。虽然对藻株进行工程化使其具有提高的光合效率(导致整体生物质生产率提高)和/或高脂质生产率的组合可以为该问题提供解决方案，但仍然存在缺陷。更高产株系的开发仍然是有效利用这种能源的障碍。


技术实现要素：

10.本发明提供了具有针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列的遗传修饰的重组藻类突变体。编码含有wd40重复序列的蛋白质的一个或多个核酸序列的遗传修饰引起具有提高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率(如通过总有机碳测量)的突变生物体。在一些实施例中，遗传修饰是基因减弱，或缺失、破坏或失活。这些突变体的脂质产品可用作生物燃料或用于其他专用化学产品。还公开了制备和使用重组藻类突变体的方法以及生产脂质的方法。
11.在第一方面，本发明提供了一种重组藻类生物体，其具有在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列中的遗传修饰。与不具有遗传修饰的相应对照藻类细胞相
比，重组藻类表现出更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率。在一个实施例中，重组藻类是绿藻(chlorophyte)藻类，其任选地可以属于共球藻纲(class trebouxiophyceae)。编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列可以具有与以下中的任一个核酸序列具有至少75％序列同一性的核酸序列：seq id no:14-26。在一个实施例中，编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因具有与以下的核酸序列具有至少75％序列同一性的核酸序列：seq id no:15或16。
12.在一个实施例中，对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰是功能性缺失。编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰可导致核酸序列表达的减弱。在一个实施例中，编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰是含有wd40重复序列的蛋白质的多肽序列中的一个或多个氨基酸的缺失。在一个实施例中，编码含有wd重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰是移码突变。遗传修饰也可以是缺失、破坏或失活。
13.在一个实施例中，与不包含遗传修饰的相应对照藻类相比，重组藻类具有高至少30％的脂质生产率。与不包含遗传修饰的对照藻类相比，重组藻类可以具有高至少15％的生物质生产率(如通过总有机碳测量)。培养5天后，重组藻类可表现出至少40克/平方米/天的脂质产量。
14.在各种实施例中，重组藻类可以具有更高的每单位时间的生物质生产率(如通过总有机碳(toc)的产量测量)。重组藻类在氮缺乏条件下可以具有更高的生物质生产率。重组藻类在氮缺乏条件下可以具有更高的总有机碳产量。在一些实施例中，重组藻类属于选自卵囊藻科(oocystaceae)、小球藻科(chlorellaceae)和真眼点藻纲(eustigmatophyceae)的科；并且重组藻类可以属于选自小球藻属(chlorella)、拟小球藻属(parachlorella)、微绿藻属(picochlorum)、四爿藻属(tetraselmis)和卵囊藻属(oocystis)的属。
15.另一方面，本发明提供了一种由本文所述的任何重组藻类生产的含有脂质的产物。
16.另一方面，本发明提供了一种含有本文所述的任何重组藻类的生物质产物。
17.另一方面，本发明提供了一种生产含有脂质的组合物的方法。该方法涉及培养本文所述的重组藻类，从而生产含有脂质的组合物。该方法还可以涉及从重组藻类中收获脂质组合物。该方法可以涉及生产针对编码wd重复序列蛋白的核酸序列的遗传修饰，其可以是功能性缺失。可以通过使藻类生物体经受紫外光来获得功能性缺失。在一些实施例中，编码含有wd重复序列的蛋白质的基因具有与以下具有至少90％序列同一性的核酸序列：seq id no:16。藻类生物体可以是绿藻藻类，任选地属于卵囊藻属，但可以是本文所述的任何重组藻类。与对照藻类相比，通过该方法生产的重组藻类可具有高至少30％的脂质生产率。
18.另一方面，本发明提供了一种生产含有脂质的组合物的方法。该方法涉及在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因中对藻类生物体进行遗传修饰，和培养该生物体从而生产含有脂质的组合物。该方法可以进一步涉及从藻类生物体中收获脂质组合物。
19.另一方面，本发明提供了一种用于鉴定具有高脂质生产率和/或高生物质生产率的重组藻类生物体的方法。该方法涉及诱变藻类生物体群；针对更高脂质生产率筛选诱变的藻类生物体；对诱变的藻类生物体的至少一部分基因组进行测序；鉴定经诱变的生物体与诱变前的藻类生物体群相比的遗传变化；在经诱变的藻类生物体亲本株中重现遗传变
化；从而鉴定具有高脂质生产率的重组藻类生物体。该方法可以进一步涉及从重组藻类生物体中收获脂质组合物。具有高脂质生产率和/或高生物质生产率的重组藻类生物体可以是本文所述的任何重组藻类生物体。在一个实施例中，与对照藻类相比，重组藻类生物体可具有高至少40％的脂质生产率。
20.上述发明内容不是限制性的，并且本发明的其他特征和优点将从以下本发明的详细描述和权利要求中显而易见。章节标题或副标题仅为方便读者而提供，并不表示偏离讨论或必然是全新的主题领域。任何主题都可以在任何章节标题或副标题下讨论或公开。
21.附图简述
22.图1a-1c是在具有通过诱变野生型细胞(株系15)对编码wd40重复序列家族蛋白的核酸序列进行的遗传修饰的株系中对fame和toc累积的影响的图示。图1a显示了各种卵囊藻属株系的2天fame累积。图1b显示了2天toc累积。图1c显示了作为碳分配指标的各种株系的fame/toc比率。经诱变的株系包括27434、27436、27550、27689和27690，它们都含有seq id no:1(含有wd40重复序列的蛋白质)的缺失。2天数据是在氮缺乏培养基中生长48小时后测量的。
23.图2a-2c是在构建为缺失编码wd40重复序列家族蛋白的核酸序列的野生型株系中fame和toc累积的图示。图2a显示了与野生型(株系15)相比，修饰的卵囊藻属物种株系(29857)的2天fame累积。图2b显示了2天toc累积。图2c显示了fame/toc比率，该比率是有用的碳分配量度。
24.图3a-3c是与(对照)实验室株系相比，构建为缺失编码wd40重复序列家族蛋白的核酸序列的实验室株系(24194)的fame和toc累积的图示。图3a显示了实验室株系(株系24194)和修饰的卵囊藻属物种株系(30525和30526)的2天fame累积。图3b显示了2天toc累积。图3c显示了fame/toc比率，该比率是有用的碳分配量度。
25.图4a-4d提供了氮缺乏条件下fame和toc生产率的5天数据的图示。图4a显示了区域fame生产率与天数。图4b显示了前2天的平均fame生产率。图4c显示了toc生产率。图4d显示了5天时段内的fame/toc比率。
26.图5是各种绿藻藻类物种的蛋白质序列的序列比对。显示出在多肽序列的关键结构域中，绿藻物种之间存在高度的序列同一性。
具体实施方式
27.本发明提供了具有针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的核酸序列的遗传修饰的重组藻类突变体。本文所述的遗传修饰产生具有更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率的重组或突变细胞或生物体。与不具有遗传修饰的相应对照细胞或生物体相比，重组藻类突变体还可以任选地具有降低的叶绿素含量和/或降低的psii天线尺寸。在各种实施例中，本文所述的遗传修饰可导致脂质生产率和/或生物质生产率的显著提高。本文公开的任何重组细胞或生物体都可以是突变的光合生物体。
28.具有本文所述遗传修饰的本发明的重组细胞或生物体可具有比相应(对照)细胞或生物体更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率。在一些实施例中，遗传修饰是减弱编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列。在任何实施例中，脂质生产率可以通过fame累积来测量，并且生物质生产率可以作为生物质累积的速率来测量，例如作为各个
细胞或生物体的总有机碳(toc)含量来测量。
29.在一个实施例中，与不具有遗传修饰的相应(对照)细胞或生物体相比，突变或重组藻类细胞或生物体在分批培养中具有更高的脂质和/或生物质生产率。分批培养是在培养细胞或生物体的时间段内，营养物质不会更新或重新供应到培养基中的培养。在其他实施例中，与相应(对照)细胞或生物体相比，突变或重组藻类细胞或生物体在氮缺乏条件下具有更高的脂质和/或生物质生产率。在一些实施例中，更高的脂质和/或生物质生产率是在分批培养和氮缺乏条件下实现的；并且在其他实施例中，更高的脂质和/或生物质生产率是在半连续或连续培养条件下实现的。半连续培养条件是定期去除固定体积的培养物并立即将等体积的新鲜培养基添加回培养物的条件。在各种实施例中，去除和添加的固定体积是总培养物体积的10％至90％。连续培养条件涉及定期去除培养物并立即更换为新鲜培养基。普通技术人员认识到时间间隔可随培养目的而变化，并且连续培养条件涉及比半连续条件更频繁地去除培养物并更换为新鲜培养基。
30.本文公开的任何突变或重组细胞或生物体都可以是光合细胞或生物体。与相应的对照细胞或生物体相比，本文所述的任何突变或重组细胞或生物体在光合自养条件(即重组细胞或生物体可以使用光、二氧化碳、水和营养物质通过光合作用生产它们自己的生物质的条件)下可以表现出提高的脂质生产率和/或提高的生物质生产率。相应(对照)细胞或生物体可用于评估任何一种或多种遗传修饰的效果。相应(对照)细胞或生物体不具有被评估的一种或多种遗传修饰，并且经受与测试细胞或生物体相同或基本相同的条件，使得该细胞或生物体的性能或特征的差异仅基于被评估的遗传修饰。在任何实施例中，相应(对照)细胞或生物体可以与测试生物体属于同一物种。它们可以源自相同的亲本细胞或亲本系。除了被评估的一种或多种遗传修饰外，它们还可以在各个方面相同或相似。在一些实施例中，相应(对照)细胞或生物体是野生型细胞或生物体。但相应(对照)细胞或生物体也可以是试验细胞或生物体的实验室株系或亲本株。基本上相同的条件可以是相同的条件或略有不同的条件，其中差异不会实质性地影响修饰的核酸序列的功能、活性或表达。
31.在各种实施例中，重组细胞或生物体是藻类细胞。在一个实施例中，重组藻类具有针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰。这些突变体的脂质产品可以进一步加工成生物燃料或用于生产其他专用化学产品。含有遗传修饰的编码含有wd40重复序列的蛋白质或结构域的基因或核酸序列可以编码本文所述的任何多肽序列，该多肽序列以所有可能的组合或子组合特此公开，如同在本文中完整阐述。
32.在一些实施例中，与相应的对照细胞或生物体相比，本发明的重组细胞或生物体可具有减少量的叶绿素b，并且可以具有提高的叶绿素a与叶绿素b的比率(chl a/chl b)。重组细胞或生物体可具有减小的光合天线尺寸，例如减少的光系统ii(psii)和/或减少的光系统i(psi)天线尺寸。在各种实施例中，与相应对照细胞或生物体的psii和/或psi天线尺寸相比，本文公开的重组细胞或生物体的psii和/或psi天线的横截面单位尺寸可以减少至少10％、至少20％、至少30％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少60％。
33.在任何实施例中，与不具有遗传修饰的相应对照细胞或生物体相比，重组细胞或生物体可具有更高的生长速率和/或更高的生物质生产率，例如每小时或每天或每2天或3天或4天或5天或6天的时段更高的生物质生产率。“生物质”是指细胞质量，无论是活细胞还
是死细胞。生物质生产率或生物质累积或生长速率可以通过本领域接受的任何方式测量，例如作为无灰干重(afdw)、干重、湿重或总有机碳(toc)生产率测量。在任何实施例中，生物质生产率或生物质累积或生长速率可以作为总有机碳(toc)生产率测量。
34.与不具有遗传修饰的相应(对照)生物体相比，本发明的重组细胞或生物体可以在每个时间段(例如每分钟或每小时或每天或每2天或3天或4天或5天或6天的时段)生产更大量的生物产物，例如脂质产物(可以任选地作为fame测量)、脂肪酸产物、碳水化合物、蛋白质产物或聚合物。生物产物的量可以表示为g/时间段、mg/时间段、ug/时间段或本文所述的任何其他规定量/规定时间段。此类生物产品可以从本发明的任何重组细胞或生物体的裂解物或生物质或细胞分泌物中分离。在一些实施例中，与在基本相同条件下培养的相应对照藻类相比，本发明的重组细胞或生物体生产多至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少多45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的生物产物，该条件可以是分批、半连续或连续培养条件，并且可以是营养物质充足的培养条件或者可以是氮缺乏条件，并且可以是光合自养条件。在一些实施例中，本发明的重组细胞或生物体在2天时段内生产多至少20％或至少30％的脂质(例如，如通过fame测量)，或在5天时段内生产多至少30％或至少40％的脂质产物。
35.不想受任何特定理论的束缚，据信本文所述的遗传修饰导致含有wd40重复序列的蛋白质的表达减弱或部分或完全消除。此类减弱或消除引起细胞中脂质生产率的显著提高，在一个实施例中，该脂质生产率可以作为细胞生产的总fame来测量。进一步的结果可以是生物质生产率的显著提高，在一个实施例中，该生物质生产率可以通过细胞生产的有机碳来证明(如例如通过总有机碳测量)。
36.如本文所用，关于核酸或基因的“外源”表示核酸或基因已通过人为干预引入(例如“转化”)到生物体、微生物或细胞中。例如，可以通过重组核酸构建体将此类外源核酸引入细胞或生物体中。外源核酸可以是从一个物种引入到另一个物种中的序列，即“异源”核酸。异源核酸也可以是在其被引入的物种中未发现的外源合成序列。外源核酸也可以是与生物体同源的序列(即，核酸序列在该物种中天然存在或编码在宿主物种中天然存在的多肽)，该序列已被分离并随后重新引入该生物体的细胞中。在一些实施例中，包括同源序列的外源核酸可以通过存在连接到外源核酸的非天然序列与天然存在的序列区分开，所述非天然序列可以包括但不限于重组核酸构建体中附接同源基因序列的非天然调节序列。或者或另外，稳定转化的外源核酸可以通过其与已整合的基因组中的序列的并列来检测和/或与天然基因区分开来。此外，如果核酸已被引入所考虑的细胞、生物体或株系的祖细胞中，则该核酸被认为是外源的。
[0037]“重组”或“工程化”核酸分子是已通过人为操作改变的核酸分子。作为非限制性实例，重组核酸分子包括任何核酸分子，该核酸分子：1)已部分或全部在体外合成或修饰，例如使用化学或酶促技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用用于核酸分子的复制、聚合、消化(核酸外切或核酸内切)、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括例如甲基化)、整合或重组(包括同源和位点特异性重组)的酶)进行合成或修饰；2)包括在自然界中不连接的连接核苷酸序列；3)已使用分子生物学技术进行工程化，使其相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸；和/或4)已使用分子生物学技术进行操作，使其相对于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列变化或重排，或具有在天然存在的核酸中未发现的序列
(例如通过插入)。作为非限制性实例，cdna是重组dna分子，如已通过体内聚合酶反应生成的、或已附接接头的、或已整合入载体(诸如克隆载体或表达载体)的任何核酸分子。
[0038]
当应用于生物体时，术语“转基因的”、“转化的”或“重组的”或“工程化的”或“遗传工程化的”是指已通过将外源或重组核酸序列引入生物体或通过天然序列的遗传修饰(因此则是重组的有机体)进行操作的有机体。重组或遗传工程化生物体也可以是已经引入了用于基因“敲低”、缺失、减弱、失活或破坏的构建体以进行指定操作的生物体。此类构建体包括但不限于rnai、微小rna、shrna、反义和核酶构建体。重组生物体还可以包括那些具有引入的外源调节序列的生物体，所述外源调节序列可操作地连接到转基因微生物的内源基因，使得可以在生物体中进行转录。还包括其基因组已被大范围核酸酶或锌指核酸酶的活性改变的生物体。异源或重组核酸分子可以整合到遗传工程化/重组生物体的基因组中，或者在其他情况下，不整合到重组/遗传工程化生物体的基因组中，或者可以存在于载体或其他核酸构建体上。如本文所用，“重组微生物”或“重组宿主细胞”包括本公开的重组微生物的后代或衍生物。
[0039]
本文所述的任何重组藻类细胞或生物体可通过人类活动生成，例如通过经典诱变和/或遗传工程化生成，但也可通过任何可行的诱变方法生产，包括但不限于暴露于紫外光、crispr/cas9、cre/lox、伽马辐射或化学诱变。筛选方法可用于鉴定具有所需特征(例如，减少的叶绿素和提高的脂质和/或生物质生产率)的突变体。使用经典诱变、遗传工程化和表型或基因型筛选生成藻类生物体的突变体的方法是本领域已知的。
[0040]
藻类细胞或生物体
[0041]
本发明的重组藻类细胞或生物体可以是突变微藻，或突变光合生物体，或突变绿藻。重组藻类可以是任何真核微藻，诸如但不限于绿藻、褐藻(ochrophyte)或轮藻(charophyte)藻类。在一些实施例中，突变微藻可以是分类学上的绿藻纲或四爿藻纲(class chlorodendrophyceae)或真绿藻纲(class prasinophyceace)或共球藻纲或真眼点藻纲(class eustigmatophyceae)的绿藻藻类。在一些实施例中，突变微藻可以是绿藻纲的成员，诸如星胞藻属(asteromonas)、纤维藻属(ankistrodesmus)、四鞭藻属(carteria)、衣藻属(chlamydomonas)、绿球藻属(chlorococcum)、绿梭藻属(chlorogonium)、金球藻属(chrysosphaera)、杜氏藻属(dunaliella)、红球藻属(haematococcus)、单针藻属(monoraphidium)、新绿藻属(neochloris)、鞘藻属(oedogonium)、金藻属(pelagomonas)、肋球藻属(pleurococcus)、桑椹藻属(pyrobotrys)、栅列藻属(scenedesmus)或团藻属(volvox)中的任何一种或多种的物种。在其他实施例中，本发明的突变微藻可以是绿枝藻亚目(chlorodendrales)或小球藻目的成员。在其他实施例中，突变微藻可以是绿藻纲的成员，诸如绿枝藻属(prasinocladus)、scherffelia属或四爿藻属(tetraselmis)中的任何一种或多种的物种。在进一步的可替代的实施例中，突变藻类可以是真绿藻纲的成员，任选地是青绿藻属(ostreococcus)或micromonas属中的任何一种或多种的物种。进一步可替代地，突变微藻可以是共球藻纲的成员，并且任选地是小球藻目的成员，并且任选地是选自葡萄藻属(botryococcus)、小球藻属、auxenochlorella、heveochlorella、海水小球藻属(marinichlorella)、卵囊藻属、拟小球藻属、伪小球藻属(pseudochlorella)、四球藻属(tetrachlorella)、独球藻属(eremosphaera)、被棘藻属(franceia)、微星藻属(micractinium)、微绿球藻属(nannochloris)、微绿藻属、原壁菌属(prototheca)、裂丝藻
属(stichococcus)或鲜绿球藻属(viridiella)中的任何一种或多种的属，或者是这些属的所有可能组合或子组合中的任一种。在另一个实施例中，重组藻类可以是共球藻纲和胶球藻科(coccomyxaceae)以及拟单囊虫属(coccomyxa)的绿藻藻类(例如极地胶球藻(coccomyxa subellipsoidea))。或属于衣藻科(chlamydomonadaceae)和衣藻属(例如莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii))；或属于团藻科(volvocaceae)和团藻属(例如团藻(volvox carteri)、金黄色团藻(volvox aureus)、球团藻(volvox globator))。
[0042]
在另一个实施例中，重组藻类是共球藻纲或真眼点藻纲的绿藻藻类，并且可以属于小球藻目或绿枝藻亚目，并且可以属于卵囊藻科或小球藻科或单珠藻科(monodopsidaceae)，并且任选地来自选自卵囊藻属、拟小球藻属、微绿藻属、微拟球藻属(nannochloropsis)和四爿藻属中的任何一种或多种的所有可能的组合和子组合的属。重组藻类也可以来自卵囊藻属或拟小球藻属或微绿藻属或四爿藻属，或来自这些属的所有可能组合和子组合中的任一种。在一个实施例中，重组藻类细胞或生物体属于共球藻纲、属于小球藻目，并且任选地属于卵囊藻科，并且任选地可以属于卵囊藻属。
[0043]
遗传修饰
[0044]
在各种实施例中，本发明的重组藻类可具有本文公开的针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰。在一个实施例中，本发明的重组藻类具有针对编码含有wd40重复序列的蛋白质或结构域的基因的遗传修饰。在一个实施例中，遗传修饰是针对细胞或生物体的天然或内源序列。
[0045]
本发明中应用的“遗传修饰”可以是改变一个或多个基因或核酸的活性或表达的减弱、缺失、基因“敲除”、突变、破坏、插入、插入终止密码子、失活、重排、一个或多个点突变、移码突变、无义突变、倒位、单核苷酸多态性(snp)、截断、点突变中的任何一种或多种。在一些实施例中，表达的变化是表达的减少或表达或活性的消除，该表达可以是编码蛋白质的生产。可以在影响基因或核酸序列的表达或活性或其产品的性质或数量的任何序列中进行或存在遗传修饰，例如在编码或非编码序列、启动子、终止子、外显子、内含子、3'或5'utr或其他调节序列中进行或存在遗传修饰。可以基因的任何结构中进行引起减弱或消除基因或核酸产物或活性的遗传修饰。在一个实施例中，遗传修饰是缺失、破坏或失活。可以对宿主细胞的天然基因组进行遗传修饰，或将遗传修饰存在于宿主细胞的天然基因组中。在一些实施例中，具有本文公开的基因的减弱表达的重组细胞或生物体可以具有在转录起始位点的基因5'区域的一个或多个突变，该突变可以是一个或多个核碱基改变和/或一个或多个核碱基缺失和/或一个或多个核碱基插入，诸如在非限制性实例中，该突变在已知或推定的转录起始位点的约2kb内、约1.5kb内、约1kb内或约0.5kb内，或翻译起始位点的约3kb内、约2.5kb内、约2kb内、约1.5kb内、约1kb内或约0.5kb内。遗传修饰可以包括在含有wd40重复序列的蛋白质的多肽序列中缺失一个或多个氨基酸。
[0046]
移码突变是一种特殊类型的突变，涉及插入或缺失dna碱基，其中插入或缺失的碱基数不能被三整除。结果，移码突变破坏了天然密码子阅读框。这可能导致插入不同于天然存在的编程氨基酸的氨基酸。突变后整个dna序列的部分或全部也可能被破坏或读取不正确，即编程不同于自然编程氨基酸的氨基酸。在一些实施例中，移码突变可导致翻译过早终止。因此，在此类实施例中，编码的多肽序列可以短得多，并且不能在细胞或生物体中实现其天然功能。因此，基因或核酸序列已被功能性缺失。无义突变是导致终止密码子插入核酸
序列的一个或多个碱基对的取代。结果，无义突变引起翻译过早终止，并且可表示基因或核酸序列的功能性缺失。
[0047]“减弱”是导致基因或核酸序列的功能、活性或表达与不具有所检查的遗传修饰的相应(对照)细胞或生物体相比减少的遗传修饰，即功能、活性或表达减小是由于遗传修饰。核酸序列的活性可以是编码多肽的表达、结合活性、信号转导或转录调节的量，或核酸序列在生物体内发挥的其他活性。在各种实施例中，与相应(对照)细胞或生物体相比，本文公开的减弱基因或核酸序列生产的基因或核酸序列的功能、活性或表达低于90％、或低于80％、或低于70％、或低于50％、或低于30％、或低于20％、或低于10％、或低于5％或低于1％。在各种实施例中，基因减弱可以通过缺失、破坏或失活来实现。本文所述的任何遗传修饰可导致减弱的基因或核酸序列的功能、活性或表达的部分或完全减弱，这在一些实施例中可导致功能、活性或表达水平基本上不超过完全减弱的功能、活性或表达水平；例如，功能、活性或表达可产生与具有完全减弱的基因或核酸序列的重组细胞或生物体相差低于10％的结果。
[0048]
天然存在于生物体中的未修饰基因或核酸序列表示天然、内源或野生型序列。缺失可表示目标核酸序列的至少一部分缺失或编码产物的至少一部分消除。但是缺失也可以通过破坏基因来实现，例如通过将序列插入非天然存在的基因(例如选择标记)，缺失和插入的组合，或导致插入终止密码子的诱变来破坏基因。但是也可以通过普通技术人员已知的导致基因或核酸序列的表达、活性或功能丧失的其他遗传修饰来执行缺失。
[0049]
功能性缺失是去除了基因或核酸序列的至少如此多的活性或表达的遗传修饰，使得与不具有功能性缺失并在相同或基本相同条件下培养的相应(对照)细胞或生物体相比，该基因或核酸序列的任何剩余活性或表达对细胞或生物体没有显著影响。在一些实施例中，功能性缺失可以去除基因或核酸序列的所有功能、活性或表达。功能性缺失可涉及基因的编码或非编码序列的至少部分缺失，去除指定基因或核酸序列的所有功能、活性或表达。“缺失”涉及指定基因或核酸序列的缺失并去除基因或核酸序列的所有功能、活性或表达。基因的“破坏”或“敲除”是基因的编码、非编码或调节部分的核酸序列的插入、缺失或其他序列修饰(例如snp、倒位或其他修饰)，导致基因的功能、活性或表达完全丧失。敲除可涉及缺失序列中的一个或多个核苷酸，从而产生终止密码子。“失活”导致失活基因或核酸序列的活性或表达丧失，并且可以是可逆的或不可逆的(例如组分与基因或核酸序列的可逆或不可逆结合)。功能性表达是指核酸序列的功能性产物或活性的表达。当核酸的表达产物是多肽时，功能性表达表示多肽活性的表达是不具有修饰并在相同或基本相同条件下培养的相应(对照)细胞或生物体的活性的至少10％或至少25％或至少50％或至少75％。对于基因或核酸序列的活性，功能性表达表示表达或活性是不具有讨论中的修饰并在相同或基本相同条件下培养的相应(对照)细胞或生物体的表达或活性的至少10％或至少25％或至少50％或至少75％。因此，可以为各种类型的遗传修饰赋予描述重叠的术语。普通技术人员知道，描述遗传修饰的特定术语可能取决于基因或其组分或核酸序列如何发生物理变化以及上下文。本发明的重组细胞或生物体可以具有本文所述的遗传修饰的任何类型。
[0050]
在一个实施例中，遗传修饰是破坏(例如“敲除”)，涉及将终止密码子引入本文所述的编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列或其变体中。例如，遗传修饰可以是终止密码子或移码突变(或本文所述的其他遗传修饰)，其被引入seq id no:14-26中任
何一个或多个或任一个的变体的基因或核酸，或被引入编码seq id no:1-13(含有wd40重复序列的蛋白质)中任何一个或多个或任一个的变体的基因或核酸序列。在一个实施例中，遗传修饰是终止密码子或移码突变，其被插入以下的基因或核酸序列：seq id no:15或16或任一个的变体，或编码以下的基因或核酸序列：seq id no:1或其变体。在另一个实施例中，遗传修饰是终止密码子或移码突变，其被插入编码以下的基因或核酸序列：seq id no:8或其变体(拟小球藻属的含有wd40重复序列的蛋白质)。本文所述任何序列的变体序列与以下中的任何一个或多个的任一核苷酸或多肽序列具有至少60％的序列同一性或至少70％的序列同一性或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％的序列同一性：seq id no:1-26。在一些实施例中，变体序列还可具有以下中的任何一个的至少25或至少50或至少75或至少100或至少150或至少200或至少250或至少300或至少350或至少400个连续氨基酸：seq id no:1-13，并且任选地，也具有记载的同一性百分比。在其他实施例中，变体序列可具有以下中的任一序列的至少500或至少600或至少700或至少800或至少1000或至少1200或至少1400或至少1500个连续氨基酸：seq id no:14-26，并且任选地，也具有记载的同一性百分比。
[0051]
在一个实施方案中，遗传修饰是引起终止密码子、无义突变或移码突变(或本文所述的其他遗传修饰)的修饰，其在编码以下的序列中：seq id no:14(agactcgcaccg)(v204fs)或其变体，或在以下中：seq id no:15或16或任一个的变体。遗传修饰还可以靶向调节序列，具有消除或减少以下的基因或核酸序列：seq id no:14-26中任何一个或多个或任一个的变体，或编码以下的基因或核酸序列的活性或表达的作用：seq id no:1-13中任何一个或其任一个的变体。
[0052]
在一些实施例中，遗传修饰也可以是引入本文公开的编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列(包括支持此类基因或核酸序列的调节序列)的移码突变、终止密码子突变或无义突变。在各种实施例中，基因或核酸序列是seq id no:14-26中任何一个或多个或任一个的变体；在一个具体实施例中，该基因或核酸序列编码seq id no:1(或其变体)的多肽或seq id no:8(或其变体)的多肽，该突变可以在序列的任何位置引入或引入到控制序列的调节序列，其中修饰引起基因转录在其自然点之前终止。因此，在一个实施例中，突变是引入功能性缺失或破坏基因或核酸序列的活性或表达的移码突变、终止密码子或无义突变。减弱基因或编码多肽的活性并引起基因功能性缺失的移码突变、终止密码子或无义突变(或其他修饰)也可以在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因内的许多不同位点或位置中的任一个引入，或在调节序列(例如启动子、终止子或其他调节序列)中引入。可以对序列进行类似的修饰以获得类似的效果。此类插入或缺失或其他突变也可引起编码的含有wd40重复序列的蛋白质的表达、功能或活性的丧失，并导致提高脂质生产率的效果。
[0053]
在其他实施例中，遗传修饰可以针对以下的核酸序列：seq id no:15或16，或针对任一个的与以下的任一核苷酸序列具有至少70％序列同一性或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的变体：seq id no:15或16。
[0054]
本发明的任何重组细胞或生物体可具有减少的psii功能吸收横截面和/或减少的psii天线尺寸。例如，与不具有遗传修饰的相应(对照)细胞或生物体的psii和/或psii天线尺寸的功能吸收横截面相比，psii天线的横截面单位尺寸可以减少至少约10％、至少20％、至少30％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少
约70％、或至少约80％。在一些实施例中，本发明的重组细胞或生物体可以额外地(且任选地)具有与相应(对照)细胞或生物体相比减少的psi功能吸收横截面或减少的psi天线尺寸，减少量与上述相同。除非另有说明，否则本文所有关于生化参数(例如fame生产率或toc生产率)提高的陈述均与相应(对照)细胞或生物体相比。
[0055]
在一些实施例中，相对于相应对照细胞或生物体，本文提供的重组藻类细胞或生物体可具有提高的fv/fm。例如，与相应(对照)光合生物体相比，突变的光合生物体可具有提高至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的fv/fm。在各种实施例中，相对于对照光合生物体体，fv/fm可以提高5％-50％或5％-30％或5％-20％。
[0056]
此外，相对于对照或野生型细胞，本文提供的突变光合生物体在光系统ii的受体侧可具有提高的电子传输速率。与相应对照细胞或生物体相比，该速率可以高至少约20％、30％、40％、50％、60％、80％或100％。此外，本发明的突变光合细胞或生物体可具有碳固定速率(pmax(c))，相对于对照生物体，该碳固定速率在本文提供的重组细胞或生物体中可升高。例如，与相应对照细胞或生物体相比，pmax(14c)可以提高至少约20％、30％、40％、50％、60％、80％或100％。
[0057]
在一些实施例中，与相应(对照)或野生型生物体相比，本发明的重组细胞或生物体具有减小的psi和/或psii天线尺寸，并且还可以任选地具有更高量的核酮糖二磷酸羧化酶活化酶(rubisco活化酶或“ra”)，例如，对照生物体的ra量的至少1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2或2.5倍。在一些实施例中，突变体表现出6、8、10、12或14个lhcp基因的表达减少和ra基因(诸如ra-a或ra-p基因)的表达提高。因此，本发明的重组细胞或生物体可以是具有减少的叶绿素和减小的psii天线尺寸的突变光合生物体，其中该突变体具有比对照光合生物体更高量的rubisco活化酶。
[0058]
lhc超基因家族编码构成光合装置天线系统的捕光叶绿素a/b结合(lhc)蛋白。本发明的重组藻类突变体还可以具有一个或多个lhc基因的表达减少。因此，在一些实施例中，本发明的重组细胞或生物体具有至少6、至少8、至少10或至少12个相对于其在相应(对照)细胞或生物体中的表达水平减弱或下调的lhc基因。在各种实施例中，与对照细胞或生物体相比，一个或多个lhc基因的表达减少可以是lhc转录物水平减少至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％。
[0059]
基因的结构由许多元素组成，蛋白质编码序列只是其中的一部分。该基因包括未转录的核酸序列和作为rna非翻译区的序列。基因还含有调节序列，包括启动子、终止子、增强子、沉默子、内含子、3'和5'utr和编码序列，以及已知属于基因一部分的其他序列。在各种实施例中，任何这些结构或核酸序列(例如seq id no:14-26中任一个或任一个的变体)可具有本文所述的一种或多种导致本文所述的更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率的遗传修饰。
[0060]
含有wd40重复序列的蛋白质
[0061]
含有wd40重复序列的蛋白质(或结构域)具有四个或更多个重复单元，其含有末端为色氨酸-天冬氨酸(wd)的保守核心基序。此类蛋白质具有形成β螺旋桨结构的结构域折叠，该折叠是具有4-9个围绕中心轴呈放射状排列的反平行四链β片层的对称折叠。该结构域形成平台，蛋白质复合物在该平台上可逆组装。它们被认为在蛋白质-蛋白质复合物的形
成中起关键作用。在任何实施例中，对含有wd40重复序列的蛋白质的遗传修饰可以是针对蛋白质的任何含有wd40重复序列的结构域。
[0062]
本发明的重组藻类细胞或生物体可以具有本文所述的遗传修饰，该遗传修饰针对以下的核酸序列：seq id no:14-26中任何一个或多个，或针对与以下中的任何一个或多个具有至少60％的序列同一性或至少70％的序列同一性或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％的序列同一性的核酸序列：seq id no:14-26。核酸序列可以编码含有wd40重复序列的蛋白质。遗传修饰也可以是任何公开的序列，并且也具有以下中的任何一个或多个的至少500或至少600或至少700或至少800或至少1000或至少1200或至少1400或至少1500个连续氨基酸：seq id no:14-26(并且任选地，也具有记载的同一性百分比)。
[0063]
遗传修饰可以针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列或任何所述核酸序列的变体，该蛋白质具有seq id no:1-13中任何一个或多个的多肽序列，并且遗传修饰可以导致本文所述的更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率。在各种实施例中，遗传修饰可以针对编码含有wd40重复序列的蛋白质(或结构域)的核酸序列，该蛋白质(或结构域)与以下中的任何一个或多个具有至少60％的序列同一性或至少70％的序列同一性或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％的序列同一性：seq id no:1-13。在一些实施例中，核酸序列可以是所述的变体并且也编码以下的至少25或至少50或至少75或至少100或至少150或至少200或至少250或至少300或至少350或至少400个连续氨基酸：seq id no:1-13中任何一个或多个或任一个的变体。
[0064]
在任何实施例中，含有wd40重复序列的蛋白质可以是含有功能性wd40重复序列的蛋白质。在各种实施例中，重组藻类细胞或生物体可具有本文所述的遗传修饰，该遗传修饰针对以下的核酸序列：seq id no:15或16，或针对任一个的具有至少70％或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的变体。
[0065]
普通技术人员知道如何计算两个序列之间的“序列同一性”百分比。任何被本领域大多数普通技术人员接受或本领域另外广泛接受的确定序列同一性的方法都可用于确定两个序列之间的序列同一性。在一个实施例中，序列同一性的百分比可以通过blast(基本局部比对搜索工具)分析使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(altschul(1997),nucleic acids res.25,3389-3402和karlin(1990),proc.natl.acad.sci.usa 87,2264-2268)采用的算法确定。在一个实施例中，直方图、描述、比对、期望(即，报告针对数据库序列的匹配的统计学显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤(低复杂性)的搜索参数可以是默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵可以是blosum62矩阵(henikoff(1992),proc.natl.acad.sci.usa 89,10915-10919)。对于blastn，评分矩阵由m(即，一对匹配残基的奖分)与n(即，错配残基的罚分)的比率设定，其中m和n的默认值可以分别为+5和-4。四个blastn参数可以调整如下：q＝10(空位生成罚分)；r＝10(空位延伸罚分)；wink＝1(沿着查询在每个winkth位置生成字命中)；以及gapw＝16(设置在其中生成空位比对的窗口宽度)。用于氨基酸序列比较的等效blastp参数设置可以是：q＝9；r＝2；wink＝1；以及gapw＝32。在gcg软件包10.0版中可用的序列之间的最佳拟合(bestfit)比较可以使用dna参数gap＝50(空位生成罚分)和len＝3(空位延伸罚分)，并且蛋白质比较中的等效设置可以为gap＝8和len＝2。
[0066]
实验室株系
[0067]
在各种实施例中，一种或多种遗传修饰可以在作为野生型、亲本或实验室株系的细胞或生物体中进行(即衍生自该细胞或生物体)。实验室株系是在实验室环境中培养的细胞或生物体。作为经过一段时间培养的结果，株系已经历了一些有利于在实验室环境中生长的适应。因此，实验室株系可以从源自在实验室环境中的培养时间的适应性中发展一种或多种有利特性。例如，实验室株系可具有比野生型株系更高的生物质生产率和/或更高的脂质生产率。在一些实施例中，可对实验室株系执行本文公开的一种或多种遗传修饰以产生本发明的重组藻类细胞或生物体。因此，在此类实施例中，实验室株系可以是本文所述的不具有所考虑的遗传修饰的相应对照藻类细胞或生物体。测试细胞可以源自相应对照细胞或生物体。例如，相应对照细胞或生物体可以是测试细胞或生物体的亲本株。
[0068]
提高脂质生产率
[0069]
具有针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列的遗传修饰或本文所述的其他修饰的本发明的重组突变藻类可以显示出该细胞或生物体与相应(对照)细胞或生物体相比脂质产量提高。遗传修饰可以是本文所述的任何遗传修饰。脂质生量提高可以通过任何接受的和合适的方法测量，例如使用脂肪酸甲酯(fame)分析的方法。在一个实施例中，脂质产量提高作为重组生物体生产的总fame的提高测量。本发明的重组细胞或生物体具有针对编码含有wd重复序列的蛋白质或结构域的基因或核酸序列的遗传修饰，并且与相应对照细胞或生物体相比，可以表现出高至少20％或至少25％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少100％的脂质生产率，如本文所述。在其他实施例中，脂质生产率的提高可以是15％-25％或15％-35％或15％-45％或15％-50％或20％-25％或25％-45％或25％-55％或25％-70％或25％-90％或25％-100％或25％-150％或25％-200％或30％-35％或30％-45％或30％-55％。提高可以是脂质的重量/重量(w/w)。在任何实施例中，脂质可以是脂肪酸。在一个实施例中，脂质生产率是使用相应细胞或生物体的fame曲线(脂肪酸甲酯)来测量的。在一个实施例中，脂质生产率可以表示为mg/l。在其他实施例中，本发明的重组细胞或生物体在培养5天后可以表现出至少50g/m2或至少60克/平方米或至少70克/平方米或至少80克/平方米的fame累积。生产fame曲线的方法是本领域普通技术人员已知的。可以使用任何合适的和接受的方法来确定fame曲线，例如本领域大多数普通技术人员接受的方法。任选地，本发明的重组细胞或生物体也可以具有生物质生产率提高，该提高可以为15％-35％或15％-40％或25％-45％或15％-50％或25％-70％或50％-100％或50％-200％(w/w)。
[0070]
脂质产量或脂质生产率的提高可以通过重量来测量，但也可以以每平方米培养容器(例如烧瓶、光生物反应器、培养池)表面每天的克数来测量。在各种实施例中，本发明的重组细胞或藻类生产的脂质产量为至少3或至少4或至少5或至少6或至少7或至少8或至少10或至少12或至少13或至少14克每天每平方米，该脂质产量可通过fame曲线测量。在任何实施例中，高脂质和/或高生物质生产率表型可在氮缺乏条件下获得，这在一些实施例中可涉及在生长期间用新鲜的氮缺乏培养基稀释和/或更换培养基。稀释可以是任何合适的量，例如稀释约50％或约60％或约70％或至少70％或约80％或超过80％，该稀释可以每天、每2天、每3天或每4天或每5天进行。在一个实施例中，脂质产物是脂肪酸和/或脂肪酸的衍生物。在一个实施例中，脂肪酸和/或脂肪酸的衍生物包含一种或多种具有c8与c12之间和/或
c8与c18之间和/或c8与c20之间和/或c8与c22之间和/或c8与c24之间(特此以所有可能的组合和子组合公开)的碳链的分子的物种。在一个实施例中，生长条件可以是分批生长，涉及旋转细胞以从培养基中去除氮，用氮缺乏培养基替换，并恢复分批生长。
[0071]
在任何实施例中，针对编码含有wd重复序列的蛋白质的基因或核酸序列的遗传修饰可导致相应基因的表达的减弱。这些基因或核酸中的任何一个或多个的遗传修饰可以是本文描述的那些中的任一种，例如seq id no:14-26中任何一个或多个。在一个实施例中，遗传修饰是缺失、破坏或失活。在另一个实施例中，遗传修饰是基因的缺失(任选地，可以是功能性缺失)或破坏。
[0072]
生物质生产率
[0073]
本发明的重组藻类细胞具有本文所述的针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列的遗传修饰，并且还可以具有比不具有遗传修饰的相应(对照)生物体更高的生物质生产率。生物质可以作为细胞或生物体生产的总有机碳(toc)的提高测量，例如通过本领域普通技术人员已知的toc分析测量。与相应(对照)细胞或生物体相比，本发明的重组细胞可以具有高至少12％、或高至少15％、或高至少20％、或高至少25％、或高至少30％、或高至少35％、或高至少50％、或高至少60％、或高至少70％、或高至少80％、或高至少90％、或高至少100％、或高至少125％、或高至少150％的生物质生产率，该生物质生产率可以通过总有机碳分析来测量。在其他实施例中，生物质生产率可以高10％-15％或高15％-25％或高20％-25％或高20％-30％或高20％-40％或高20％-45％。任选地除了脂质生产率的提高之外，可以还有生物质生产率的提高。
[0074]
各种测量总有机碳的方法是本领域普通技术人员已知的。生物质生产率可以作为每个时间段(例如1天或2天或3天或4天或5天)培养物的mg/ml来测量。在一些实施例中，本文所述的更高的生物质生产率和/或更高的脂质生产率可以在氮缺乏条件下发生。因此，在一个实施例中，与相应(对照)细胞或生物体相比，本发明的重组藻类或细胞可具有更高的脂质产量和/或更高的总有机碳产量，该更高量可以在氮缺乏或低氮条件下生产。氮缺乏条件可涉及在缓冲液中培养，该缓冲液具有低于0.5mm的细胞或生物体外部任何可用形式的氮。在一些实施例中，细胞可以在作为氮源的0.5mm或更少的kno3或尿素中培养。其他缓冲液也可以使用并且是氮缺乏的[[假设与将细胞培养在不含细胞或生物体外部氮源的培养基中相比，它们所含的氮水平对氮相关参数生理学(例如脂质生产率或生物质生产率)的改变不超过10％。]]在任何实施例中，可以通过测量细胞的总有机碳的提高来评估生物质生产率。营养物质充足的条件是培养生物体的生长不受任何营养物质缺乏限制的条件。无氮培养基也被认为是氮缺乏条件。
[0075]
生产脂质的方法
[0076]
本发明还提供了用于生产含脂质的产品的方法。该方法涉及培养本文所述的重组藻类细胞或生物体，从而生产脂质产品。任何方法还可以涉及收获由本文所述的重组藻类细胞或生物体生产的脂质的步骤。培养可以持续合适的时间段，例如至少1天或至少3天或至少5天。
[0077]
本发明还提供了用于生产含有脂质的组合物的方法。在一个实施例中，该方法可涉及执行在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列中针对藻类生物体的遗传修饰。该方法还可以涉及培养本文所述的重组藻类细胞或生物体从而生产含有脂质的组合
物的步骤。该组合物可以是含有本文所述的任何一种或多种重组藻类的生物质组合物或生物质产物。可以在有助于藻类生长的任何合适的培养基(例如藻类生长培养基或本文所述的任何培养基)中进行培养。该方法还可以涉及从含有脂质的组合物或生物质中收获脂质的步骤。该方法可以涉及从重组细胞或生物体中收获脂质的步骤。本文中的任何方法还可以涉及纯化含脂质的组合物以生产生物燃料或生物燃料前体的步骤。生物燃料前体是含有脂质分子的组合物，可以将其纯化或以其他方式转化为生物燃料。
[0078]
本发明还提供了生产重组藻类细胞或生物体的方法，该重组藻类细胞或生物体具有比相应对照细胞或生物体更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率。该方法涉及将藻类细胞或生物体暴露于紫外光以生产本文所述的重组细胞或生物体，该重组细胞或生物体具有比相应对照细胞或生物体更高的脂质生产率。在一个实施例中，具有更高脂质生产率的藻类生物体可以通过使重组细胞与鉴定脂质的染色剂(例如通过bodipy染料)接触来鉴定。任选地，方法可以包括从重组藻类生物体中分离脂质的步骤。可以通过toc分析鉴定具有更高生物质生产率的生物体。重组藻类可以在任何合适的藻类生长培养基中培养，诸如本文所述那些培养基中的任一种。uv处理可涉及例如使培养物经受uv光或伽马辐射或两者，持续合适的时间段，或使培养物在合适的uv方案或伽马辐射方案下。普通技术人员了解用于诱变的uv暴露的合适方案。uv方案可以涉及将细胞或生物体暴露于uv辐射，这可以分批执行，每批接受一个剂量。多个细胞批次可以接受针对每批细胞的不同剂量的能量。使藻类生物体经受紫外光可包括将细胞或生物体暴露于至少10或至少15uj/cm2的能量，该暴露可在1秒内或5秒内或30秒内或1分钟内执行。在一些实施例中，4或5批次的细胞可以接受暴露于16-57uj/cm2能量的剂量，并且暴露能量可以随着每个单独的批次而提高。暴露完成后，可以将细胞批次合并在一起。在暴露后，可以培养重组藻类(或合并藻类)至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少6天、或至少10天、或至少20天、或2-10天、或2-20天、或2-25天。重组藻类生物体可以是本文所述的任何重组藻类生物体。uv方案可涉及将细胞或生物体暴露于uv辐射的多次暴露下，该uv辐射会逐渐变强。
[0079]
可以分批、半连续或连续培养方式培养本发明的任何重组细胞或生物体以生产更高的生物质生产率和/或更高的脂质生产率。在一些实施例中，培养基可以是营养物质充足的或氮缺乏的(-n)。在一些实施例中，培养是在光合自养条件下进行的，并且在这些条件下，无机碳(例如，二氧化碳或碳酸盐)可以是培养基中唯一的或基本上唯一的碳源。
[0080]
本发明还提供了包含本文所述的任何重组细胞或生物体的脂质产物的生物燃料。生物燃料通过纯化由本文所述的重组藻类细胞或生物体生产的含有脂质的组合物而生产。生物燃料可以通过纯化或以其他方式转化由本文所述的重组藻类细胞或生物体生产的脂质产物以生产生物燃料来生产。在一个实施例中，生物燃料是生物柴油燃料，其可以含有比例足以在内燃机中燃烧的脂肪酸甲酯分子。在各种实施例中，生物燃料可含有平均碳链长度为至少5个碳原子、或至少8个碳原子、或至少10个碳原子的碳链。
[0081]
fame和toc分析方法
[0082]
细胞或生物体的脂质生产率可以通过本领域接受的任何方法测量，例如作为细胞中包含的脂肪酸甲酯的提高或减小(即fame分析)来测量。在各种实施例中，与相应对照细胞或生物体相比，本发明的任何重组藻类细胞或生物体可具有本文所述的更高的生物质生产率。在一些实施例中，与相应对照细胞或生物体相比，本发明的重组藻类细胞或生物体可
具有更高的脂质生产率以及更高的生物质生产率。生物质生产率可以通过本领域接受的任何方法测量，例如通过测量细胞的总有机碳(toc)含量来测量。实例中提供了两种方法的实施例。
[0083]“fame脂质”或“fame”是指具有可衍生为脂肪酸甲酯的酰基部分的脂质，诸如例如单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰基甘油酯、蜡酯和膜脂(诸如磷脂、半乳糖脂等)。在一些实施例中，脂质生产率被评估为以毫克每升(mg/l)计的fame生产率，并且对于藻类，可以报告为每天每平方米的克数(g/m2/天)。在半连续测定中，通过考虑入射辐射面积(scpa烧瓶架孔径为1 1/2英寸3 3/8"，或0.003145m2)和培养物体积(550ml)，将mg/l值转换为g/m2/天。为获得以g/m2/天计的生产率值，将mg/l值乘以每日稀释率(30％)和转换系数0.175。当脂质或其子类(例如，tag或fame)被称为百分比时，该百分比是重量百分比，除非另有说明。术语“脂肪酸产品”包括游离脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯(包括但不限于蜡酯)；和碳氢化合物，包括但不限于烷烃和烯烃)。
[0084]
示例性实施例
[0085]
在一个实施例中，本发明提供了一种共球藻纲的重组藻类生物体，其具有在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列中的遗传修饰。与不具有遗传修饰的相应对照藻类细胞相比，重组藻类表现出更高的脂质生产率和/或生物质生产率。在各种实施例中，共球藻纲生物体可以来自卵囊藻科或小球藻科。在一个实施例中，生物体属于卵囊藻属。
[0086]
在一个实施例中，本发明提供了一种重组的共球藻纲生物体，其具有在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列中的缺失、破坏或失活。在一个实施例中，破坏是敲除突变。在一个实施例中，缺失或破坏(例如敲除)涉及在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列的编码或非编码序列中插入无义突变或移码突变。在一个实施例中，编码的含有wd40重复序列的蛋白质可以与以下具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％的序列同一性：seq id no:1或8。在另一个实施例中，重组细胞或生物体可以在编码含有wd40重复序列的蛋白质的核酸序列中具有缺失、破坏或失活，该核酸序列可以是与以下具有至少80％或至少90％或至少95％的序列同一性的核酸：seq id no:15或seq id no:16。与不具有遗传修饰的相应对照藻类细胞相比，重组藻类表现出更高的脂质生产率和/或生物质生产率。藻类可以是共球藻纲生物体，例如来自卵囊藻科，并且任选地来自卵囊藻属。在任何实施例中，脂质生产率的提高可以是至少20％w/w或至少25％w/w或30％w/w-50％w/w或30％w/w-55％w/w的2天fame累积提高，可以任选地在氮缺乏条件下培养。任选地，重组细胞或生物体还可以具有至少12％或至少15％或至少20％或15％-25％或20％-40％的生物质生产率提高，这可以表示为2天toc累积。因此，在一个实施例中，与对照细胞或生物体相比，重组细胞或生物体具有30％-55％的脂质生产率提高(如通过fame测量测量)和至少20％的生物质生产率提高。在另一个实施例中，脂质生产率提高可以是20％-40％。fame累积和/或toc累积的提高可以在培养两天或五天后测量，并且可以处于氮缺乏条件。培养2天后，重组细胞或生物体的fame/toc比率也可以大于0.3。
[0087]
在另一个实施例中，本发明的重组细胞或生物体可以具有至少20％的脂质生产率提高(通过2天fame累积测量)和任选的至少12％的生物质生产率提高(如通过toc测量)；并且任选地还具有大于0.3或0.4的fame/toc比率。在另一个实施例中，本发明的细胞或生物
体可以具有至少20％的脂质生产率提高(如通过2天fame累积测量)；并且任选地还具有大于0.5的fame/toc比率。
[0088]
在一个实施例中，本发明提供了一种共球藻纲的重组藻类生物体，其具有针对编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列的遗传修饰。在一个实施例中，该基因或核酸序列是seq id no:14-26中任何一个或多个或任一个的变体，或者可以是编码以下的基因或核酸序列：seq id no:1-13中任何一个或多个或任一个的变体。遗传修饰可以是基因或核酸序列的缺失(任选地功能性缺失)或破坏(例如敲除)。缺失可以是功能性缺失。与不具有遗传修饰的相应对照藻类细胞相比，重组藻类表现出更高的脂质生产率和任选的更高的生物质生产率。在各种实施例中，共球藻纲生物体可以来自卵囊藻科或小球藻科。在一个实施例中，生物体属于卵囊藻属。脂质生产率的提高可以是至少20％w/w或30％w/w-50％w/w或30％w/w-55％w/w的2天或5天fame累积提高，可以任选地在缺氮条件下培养。任选地，重组细胞或生物体还可以具有至少15％或至少20％或15％-25％或20％-40％的生物质生产率提高，这可以表示为2天或5天toc累积。因此，在一个实施例中，重组细胞或生物体具有30％-55％的脂质生产率提高和至少20％的生物质生产率提高。在另一个实施例中，脂质生产率提高可以是20％-40％。fame累积和/或toc累积的提高可以在氮缺乏条件下培养两天或五天后测量。在另一个实施例中，本发明的细胞或生物体可以具有至少50％的脂质生产率提高(如通过5天fame累积测量)；并且任选地还具有5天培养后大于0.5或0.6的fame/toc比率。
[0089]
在所有实施例中，脂质生产率和/或toc生产率的提高可以相对于相应(对照)细胞或生物体，其可以是野生型细胞或实验室株系。
[0090]
实例1
[0091]
使10ml株系15(str00015或“野生型”)卵囊藻属物种的各种等分试样适应在尿素补充的基本培养基上的昼夜生长条件。然后使浓度为2x 106个细胞/ml的不同等分试样的细胞暴露于uv交联设备中不同量的uv辐射(22.4mj/cm2、33.6mj/cm2、44.8mj/cm2和56mj/cm2，分别使用总共50ml、50ml、50ml和20ml的培养物)中。使经诱变的细胞等分试样在黑暗中恢复48小时。然后在第一轮富集之前在低光(约100ue)下放大培养物。然后使经诱变的细胞适应在约100ue的光强度和1％ co2下的尿素补充基本培养基中的昼夜生长一周。使培养物在昼夜条件下在约1400ue的最大辐照度下在鼓入1％ co2下放大3天至od730为约1.0。然后将培养物以5000g离心10分钟，并将细胞沉淀重悬于无氮基本培养基中至od730为约0.9。然后使这种无氮培养物在方底烧瓶中在昼夜条件下在约1400ue的最大辐照度下在鼓入1％ co2下孵育48小时。在无氮批次生长48小时后，取出等分试样的细胞并在黑暗中用脂质特异性染料bodipy染色10分钟，最终浓度为0.2ug/ml。
[0092]
具有最高bodipy染色水平的突变细胞通过荧光激活细胞分选(facs)富集。如上所述，使富集的细胞群放大并缺氮，然后进行额外轮次的基于bodipy的facs富集。这个迭代过程共重复五轮，每次迭代中保留前2％、1％、1％、0.25％和0.25％的群。
[0093]
将最后一类铺在补充有尿素的基本培养基琼脂板上以分离单个无菌群体。
[0094]
使分离株在t25组织培养瓶中的补充有尿素的基本培养基中放大，然后将培养基转变为无氮基本培养基，持续48小时。将分离突变体的脂质和生物质累积与亲本株str00015进行比较，脂质含量通过总脂肪酸甲酯(fame)分析测量，并且生物质通过总有机
碳(toc)测量。从图1中可以看出，筛选出的几个分离株显示出累积fame和toc以及fame/toc提高，fame/toc是将固定碳分配给脂质的指标。这表明已通过所述过程分离出具有改善的脂质生产率的突变体。株系27434被鉴定为具有高fame和生物质累积。
[0095]
实例2
[0096]
基因组dna与亲本(野生型)株系15一起从株系27434中分离出来，并在高通量测序系统上进行测序，从而生成150bp的配对末端读数。读数经过处理，映射到野生型株系作为参考基因组，并通过算法小变种进行分析。算法小变种的实例是freebayes多态性检测软件，尽管也可以成功使用其他程序。snp和小插入/缺失(indels)的分析揭示株系
‘
434总共含有170个多态性。这些突变中的二十四个位于外显子内或剪接点处，并且cas9介导的基因缺失优先，因为它们改变基因功能和/或活性的可能性最高，如下表1所示。
[0097]
表1
–
株系
‘
434中在外显子内或剪接点处鉴定的突变
[0098]
[0099][0100]
其余146个突变或者是基因间突变，或者存在于基因的内含子中。对株系15(wt)和株系27434的转录组学数据的评估表明，这146个突变都不具有对基因表达或转录物剪接的任何显著影响。
[0101]
实例3
–
突变的鉴定
[0102]
为了鉴定哪些突变导致株系27434中的高脂质表型，通过基于rnp的cas9介导的基因破坏在以下两个背景株系中进行株系中带有snp的基因的独立敲除(表1)：(i)株系15野生型亲本株；和(ii)株系24194—由株系15进化并具有改善的生物质和脂质生产率的实验室株系。
[0103]
在t25烧瓶中在氮饥饿期间，测试所有生成株系的生物质和脂质累积改善。从该分析中鉴定出三个具有3eukt2027500(编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因)缺失的独立品系。与亲本品系相比，这些品系显示出显著更高的生物质和脂质累积。其中一个是在株系15(wt)对照株系中构建的(图2)，而另外两个是在株系24194对照株系中构建的(图3)。如图2所示，与株系15相比，第一个遗传工程化株系(鉴定为株系29857)显示出累积fame和toc分别改善了22％和15％。在株系24194对照中工程化的株系(鉴定为株系30525和30526)显示出fame累积提高了22％(图3)。
[0104]
实例4
[0105]
如上所述在500ml方底烧瓶中进行大规模生产率测试，但历经5天时段。该研究揭示，实验室株系24194中的两个基因敲除品系(株系30525和30526)显示出脂质生产率分别
改善了14％和21％(图4)，证实了t25烧瓶中的结果。两种工程化株系在实验的每一天测量的fame/toc也显著更高(图4)。因此，数据显示出3eukt2027500的缺失基本上提高了碳分配和脂质生产率。
[0106]
实例5
[0107]
分析了3eukt2027500(表1中的#2)的氨基酸序列的功能结构域和其他物种的直系同源物。3eukt2027500编码含有wd40重复序列的蛋白质，该蛋白质具有四个与wd40重复序列的相似性较弱的串联结构域。wd40重复序列是约40个氨基酸的短最小保守结构基序，通常以甘氨酸-组氨酸(gh)二肽开始，并且以色氨酸-天冬氨酸(wd)二肽结束。这些重复序列的多个拷贝折叠在一起形成wd40结构域，该结构域起到支架的作用，使得能够与蛋白质和核酸相互作用并促进多蛋白复合物的形成。含有wd40重复序列的蛋白质参与多种细胞过程，包括细胞周期进展、转录调节、信号转导、细胞凋亡、植物细胞壁的生物合成、花青素生物合成等。
[0108]
表2中总结的进一步序列同一性分析揭示出3eukt2027500的直系同源物是高度保守的并广泛分布于绿色藻类和植物中。
[0109]
表2
–
3eukt2027500直系同源物的完整蛋白质序列的比对
[0110]
[0111][0112]
进行来自表2直系同源物的蛋白质序列的比对研究，并且显示出跨越绿藻藻类物种并且跨越蛋白质的整个长度的高度序列保守性，并且特别是在图5所示的关键结构域中的高度序列保守性。使用生物信息学矩阵blosum62计算序列相似性以进行序列比对。
[0113]
对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。
[0114]
在不具有未在本文中具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的发明。因此，例如，在本文的每个实例中，任何术语“包含”、“基本上由
……
组成”和“由
……
组成”可以用其他两个术语中的任一个代替。已使用的术语和表达作为描述而非限制性术语使用，并且无意在使用此类术语和表达时排除所示和描述的特征或其部分的任何等同物，但是认识到在要求保护的发明的范围内可以进行各种修改。此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本发明也由此根据马库什组的任何个体成员或成员的亚组描述。例如，如果x被描述为选自由溴、氯和碘组成的组，则x是溴的权利要求和x是溴和氯的权利要求都得到了充分描述。其他实施例在所附权利要求内。

技术特征：
1.一种重组藻类生物体，其包含在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因或核酸序列中的遗传修饰，其中与不具有所述遗传修饰的相应对照藻类细胞相比，重组藻类表现出更高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率。2.根据权利要求1所述的重组藻类，其中所述重组藻类是绿藻藻类。3.根据权利要求1-2中任一项所述的重组藻类，其中所述藻类属于共球藻纲。4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组藻类，其中所述编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因包含与以下中的任何一个或多个核酸序列具有至少75％序列同一性的核酸序列：seq id no:14-26。5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组藻类，其中所述编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因包含与以下的核酸序列具有至少75％序列同一性的核酸序列：seq id no:15或seq id no:16。6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组藻类，其中所述编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因与以下的核酸序列具有至少75％序列同一性：seq id no:16。7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组藻类，其中针对所述编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的所述遗传修饰是敲除突变。8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组藻类，其中所述编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的所述遗传修饰引起所述核酸序列的表达减弱。9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组藻类，其中所述编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因的所述遗传修饰包括含有wd40重复序列的蛋白质的多肽序列中的一个或多个氨基酸的缺失或取代。10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组藻类，其中所述编码含有wd重复序列的蛋白质的基因的遗传修饰包括移码突变。11.根据权利要求1-10中任一项所述的重组藻类，其中所述遗传修饰是缺失、破坏或失活。12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组藻类，其中与不包含所述遗传修饰的相应对照藻类相比，所述重组藻类具有高至少30％的脂质生产率。13.根据权利要求1-12中任一项所述的重组藻类，其中与不包含所述遗传修饰的对照藻类相比，所述重组藻类具有高至少15％的如通过总有机碳测量的生物质生产率。14.根据权利要求1-13中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类在培养5天后表现出至少40克/平方米/天的脂质产量。15.根据权利要求1-14中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类具有更高的如通过总有机碳(toc)的生产测量的每单位时间的生物质生产率。16.根据权利要求1-15中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类在氮缺乏条件下具有更高的生物质生产率。17.根据权利要求1-16中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类在氮缺乏条件下具有更高的总有机碳产量。18.根据权利要求1-17中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类属于选自由以下项组成的组的科：卵囊藻科、小球藻科和真眼点藻纲。19.根据权利要求1-18中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类属于选自由以下
项组成的组的属：小球藻属、拟小球藻属、微绿藻属(picochlorum)、四爿藻属和卵囊藻属。20.根据权利要求1-19中任一项所述的重组藻类，其中所述重组藻类是卵囊藻属的藻类。21.根据权利要求1-20中任一项所述的重组藻类生物体，其中所述遗传修饰包含在与以下具有至少80％序列同一性的核酸序列中：seq id no:16。22.一种由根据权利要求1-21中任一项所述的重组藻类生产的含脂质产物。23.一种生物质产物，其包含根据权利要求1-21中任一项所述的重组藻类。24.一种生产含有脂质的组合物的方法，所述方法包括培养根据权利要求1-21中任一项所述的重组藻类，以及从而生产含有脂质的组合物。25.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括从所述重组藻类中收获脂质组合物。26.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其中针对编码含有wd重复序列的蛋白质的序列的遗传修饰是功能性缺失。27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中执行所述功能性缺失包括使所述藻类生物体经受紫外光。28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述编码含有wd重复序列的蛋白质的基因包含与以下具有至少90％序列同一性的核酸序列：seq id no:16。29.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述藻类生物体是绿藻藻类。30.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述绿藻藻类属于卵囊藻属。31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法，其中与对照藻类相比，所述重组藻类具有高至少30％的脂质生产率。32.一种生产含有脂质的组合物的方法，包括，在编码含有wd40重复序列的蛋白质的基因中对藻类生物体执行遗传修饰；培养所述生物体，以及从而生产含有脂质的组合物。33.根据权利要求32所述的方法，进一步包括从所述藻类生物体中收获脂质组合物。34.一种鉴定具有高脂质生产率和/或高生物质生产率的重组藻类生物体的方法，包括：诱变藻类生物体群；针对更高脂质生产率筛选经诱变的藻类生物体；对所述经诱变的藻类生物体的基因组的至少一部分进行测序；鉴定经诱变的生物体与诱变前的藻类生物体群相比的遗传修饰；在所述经诱变的藻类生物体的亲本株中重现所述遗传修饰；从而鉴定具有高脂质生产率的重组藻类生物体。35.根据权利要求34所述的方法，进一步包括从所述藻类生物体中收获脂质组合物。36.根据权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰存在于编码wd重复序列家族蛋白的基因中。37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰是敲除突变。38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述藻类生物体是绿藻藻类。39.权利要求36-38所述的方法，其中所述编码含有wd重复序列的蛋白质的基因包含与以下具有至少90％序列同一性的核酸序列：seq id no:16。
40.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述重组藻类生物体是卵囊藻属的藻类。41.根据权利要求34-40中任一项所述的方法，其中与对照藻类相比，所述重组藻类生物体具有高至少40％的脂质生产率。

技术总结
本发明提供了具有针对编码含有WD40重复序列的蛋白质或结构域的基因或核酸序列的遗传修饰的重组藻类突变体。编码含有WD40重复序列的蛋白质或结构域的一个或多个核酸序列的所述遗传修饰引起具有提高的脂质生产率和/或更高的生物质生产率(如通过总有机碳测量)的突变生物体。遗传修饰可以是基因减弱或功能性缺失。这些突变体的脂质产品可用作生物燃料或用于其他专用化学产品。还公开了制备和使用重组藻类突变体的方法以及生产脂质的方法。组藻类突变体的方法以及生产脂质的方法。组藻类突变体的方法以及生产脂质的方法。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：维里多斯公司
技术研发日：2021.11.04
技术公布日：2023/10/8