胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法。


背景技术：

2.肌腱缺损/损伤是影响人们工作和生活最常见的问题之一。肌腱愈合是一个漫长而复杂的过程，包括炎症、增殖和重塑阶段。由于肌腱组织缺血管、少细胞和承受负荷的特点，其受伤后的自我修复和再生能力很差。对于肌腱损伤/缺损的治疗，多年来一直是骨科医生面临的重大挑战。
3.近年来，肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,tdscs)的研究受到越来越多的关注。tdscs具有自我更新和分化的潜力，并已被广泛应用于组织工程的研究和肌腱损伤的治疗。有研究表明，tdscs可以通过旁分泌作用有效地促进受损肌腱的修复和再生。外泌体(exosome，exo)是细胞旁分泌途径作用的主要调控者。最新文献报道tdscs外泌体有望成为治疗肌腱损伤修复的有效方法。但是，由于单纯的外泌体在体内滞留率低，从而极大地降低了外泌体的功效。因此，找到一种能够将tdscs源外泌体富集在肌腱缺损部位，并达到一定的浓度以维持其生物活性，从而促进肌腱修复的载体，成为将tdscs源外泌体应用于修复肌腱缺损的关键问题之一。
4.生物支架，尤其是来源于天然组织的细胞外基质(extracellular matrix，ecm)材料，在组织工程领域引起了越来越多的关注。脱细胞肌腱组织，由于其具有与正常肌腱类似的生物化学组成、超微结构和生物力学特征，作为有望实现肌腱再生的一种组织特异性生物支架，引起了广泛的研究兴趣。在本技术发明人先前的研究中，脱细胞小牛肌腱压片(decellularized bovine tendon sheets，dbtss)支架已被成功制备。研究表明该支架具有与完整肌腱相似的生物力学特性、超微结构、以及肌腱ecm中多种生化组分。
5.为了进一步使外泌体更稳定地结合于胶原或者含有胶原的支架上，并且达到发挥作用所需浓度，本发明旨在提供胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，以解决外泌体结合于胶原或者含有胶原的支架上的稳定性问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决上述问题，提供胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法。
7.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
8.本发明提供了胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，包括以下步骤：
9.s1、构建稳定转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs：
10.s1-1、提取大鼠tdscs和bmscs；
11.s1-2、设计及构建载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd；
12.s1-3、慢病毒载体的包装与滴度测定；
13.s1-4、构建转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株；
14.s2、提取转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体并鉴定。
15.进一步地，步骤s1-1中tdscs和bmscs提取方法为：
16.使用2w龄sprague dawley大鼠，10％的水合氯醛腹腔麻醉处死，然后分别放入碘伏和75％酒精中浸泡各5min，取出后放入超净工作台中，在无菌条件下进行操作；
17.将tdscs从大鼠跟腱和屈肌腱中分离出来的，用3mg/mli型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶在37℃下消化60min；并用70μm的细胞过滤器过滤组织溶液，以获得单细胞悬浮液；
18.进行bmscs分离，采用低糖dmem培养基从股骨骨髓腔中冲出骨髓；然后，将悬浮液通过70μm的细胞过滤器过滤，并在1200rpm下离心5min；
19.其中，bmscs和tdscs都用完全培养基重悬后，接种于t25细胞培养瓶中，置于恒温培养箱中孵育，孵育条件为37℃，5％co2；待细胞贴壁24h后首次换液，以后每2-3d换液一次，待细胞达到80-90％的融合时，使用tne进行消化，随后细胞进行传代，采用p3代的tdscs和bmscs。
20.进一步地，所述完全培养基为含15％fbs和1％双抗的低糖dmem培养基。
21.进一步地，步骤s1-2的具体方法为：
22.采用rna提取试剂盒提取大鼠tdscs的总rna，逆转录成cdna；
23.设计2个正向引物，2个反向引物，通过搭桥pcr扩增cbd、连接肽及外泌体表面膜蛋白cd63的完整序列，将cbd引入cd63第二个胞外环；
24.采用xho1和bamh1分别对目的片段和载体pcdh-cmv-puro进行酶切，并用t4dna酶进行连接，转化，涂板；
25.采用菌落pcr进行重组载体筛选，送检测序，确定成功构建载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd。
26.进一步地，步骤s1-3的具体方法为：
27.慢病毒的包装：将含有目的片段的重组质粒载体与辅助质粒pspax2和pmd2.g混合均匀后转移至hek293t细胞培养基中，转染8h后更换为正常培养基，48h后收集细胞上清液，3000rpm离心15min，取上清用0.22μm滤膜过滤，滤液存于4℃冰箱待用；
28.慢病毒滴度测定：将hek293t细胞接种至24孔板，待细胞汇合至70％时加入梯度稀释的病毒液，感染48h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。
29.进一步地，步骤s1-4的具体方法为：
30.将每孔5
×
105tdscs接种至6孔板中，待细胞融合至约30％，弃掉培养基按预实验筛选的最佳感染复数，加入pcdh-cmv-puro-cd63-cbd病毒液，培养箱中感染24h后更换培养液；
31.更换含最佳浓度嘌呤霉素的培养基筛选获得稳定表达的细胞株(cbd-tdscs)。
32.进一步地，步骤s2的具体方法为：
33.分别将tdscs、vector-tdscs和cbd-tdscs培养至密度为50％-70％时，去除原有的含血清的培养基，换成新鲜的含5％无外泌体血清的培养基继续培养，当细胞密度达到80％-95％时收集上清，分别提取单纯tdscs的外泌体(exo)、转染空载的vector-tdscs的外泌体(vector-exo)和稳定转染cbd-tdscs的外泌体(cbd-exo)并对其进行鉴定。
34.进一步地，所述干细胞源为肌腱干细胞、骨髓干细胞或脂肪干细胞等。
35.本发明还提供了上述所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法在制备含胶原的脱细胞支架的应用。
36.进一步地，通过将胶原靶向tdscs源外泌体负载于含胶原的脱细胞支架上，所述含胶原的脱细胞支架为脱细胞sis支架、脱细胞皮肤支架或脱细胞脱钙骨基质支架等。
37.与现有技术相比，本方案的有益效果：
38.通过本发明的方法构建的胶原靶向的干细胞源外泌体，能够应用于通过将胶原靶向干细胞源外泌体负载于含胶原的脱细胞支架上，解决了外泌体结合于含胶原的脱细胞支架上的稳定性问题，便于外泌体达到发挥作用所需浓度，使得外泌体达到一定的浓度从而在体内环境下实现促组织再生的目的。
附图说明
39.图1是本发明实施例中空载质粒和cd63-cbd质粒；
40.图2是本发明实施例中rt-qpcr检测cd63基因水平的表达量((n＝3)。*表示与tdscs组相比，p值《0.05，#表示与vector-tdscs组相比，p值《0.05)；
41.图3是本发明实施例中免疫荧光检测cd63蛋白水平的表达量(图3中a：免疫荧光染色，标尺＝200μm，绿色为cd63，蓝色为dapi；图3中b：定量分析(n＝3)。*表示与tdscs组相比，p值《0.05，#表示与vector-tdscs组相比，p值《0.05)；
42.图4是本发明实施例中外泌体的分离及鉴定(图4中a：外泌体形态示意图，红色代表cbd，红色连接的蓝色块状部分代表cd63；图4中b：wb检测外泌体标志蛋白；图4中c:透射电镜观察外泌体形态，标尺＝100nm；图4中d：nta检测)；
43.图5是本发明实施例中edu染色观察外泌体对bmscs增殖能力的影响(图a:edu染色，红色代表edu+细胞，蓝色代表dapi，标尺＝100μm；图b:edu阳性率的定量统计；图c：rt-qpcr检测pcna基因水平的表达量(n＝3)。*表示与control组相比，p值《0.05。；
44.图6是本发明实施例中cck-8检测外泌体对bmscs的增殖能力的影响(*表示与对照组相比，p值《0.05)；
45.图7是本发明实施例中trans-well检测外泌体对bmscs的迁移能力的影响(图7中的a：dapi和结晶紫染色，标尺＝100μm；图7中的b：定量统计。*表示与对照组相比，p值《0.05)；
46.图8是本发明实施例中实时荧光定量pcr检测外泌体对bmscs的腱向和骨向分化能力的影响(图8中的a：转录因子scx；图8中的b：腱调节蛋白tnmd；图8中的c：血小板反应蛋白4thbs-4；图8中的d：成骨特异性转录因子runx2。*表示与对照组相比，p值《0.05)；
47.图9是本发明实施例中nta检测cbd-exo+d的外泌体(a：外泌体结合率；图b：外泌体缓释率。*表示与exo+d组相比，p值《0.05)；
48.图10是本发明实施例中cbd-exo+d形态观察(a：大体观察cbd-exo+d表面形态；b：sem观察复合支架表面拓扑结构，标尺＝1μm)；
49.图11是本发明实施例中激光共聚焦显微镜观察cbd-exo+d的外泌体和支架的耦合情况(a：激光共聚焦，标尺＝10μm；绿色：dbts支架(i型胶原自发绿色荧光)；红色：cm-dil荧光标记的外泌体；b：定量分析。*表示与exo+d组相比，p值《0.05)；
50.图12是本发明实施例中tem观察cbd-exo+d释放出的外泌体形态(标尺＝100nm)；
51.图13是本发明实施例中激光共聚焦显微镜观察cbd-exo+d释放出的外泌体进入bmscs内部(标尺＝10μm。(绿色，鬼笔环肽；蓝色，dapi；红色：外泌体))。
具体实施方式
52.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
53.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
54.实施例：
55.在本实施例中，利用一种胶原结合结构域(collagen binding domain，cbd)特异性结合i型胶原，dbtss是i型胶原非常丰富的材料。通过将胶原靶向tdscs源外泌体负载于dbtss支架上，使得外泌体达到一定的浓度从而在体内环境下实现促肌腱再生的目的。
56.本发明实施例提供的方案如上述发明内容所述，提供了胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，包括以下步骤：
57.s1、构建稳定转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs：
58.s1-1、提取大鼠tdscs和bmscs；
59.s1-2、设计及构建载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd；
60.s1-3、慢病毒载体的包装与滴度测定；
61.s1-4、构建转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株；
62.s2、提取转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体并鉴定。
63.还提供了上述所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法在制备脱细胞小牛肌腱压片支架上的应用。
64.具体的，通过将胶原靶向tdscs源外泌体负载于脱细胞小牛肌腱压片支架上，使得外泌体达到一定的浓度在体内环境下促肌腱再生。在本方案中，利用一种胶原结合结构域(collagen binding domain，cbd)特异性结合i型胶原，dbtss是i型胶原非常丰富的材料。通过将胶原靶向tdscs源外泌体负载于dbtss支架上，使得外泌体达到一定的浓度从而在体内环境下实现促肌腱再生的目的。
65.以下为本发明实施例方案的具体实验：
66.一、实验材料
67.主要试剂及耗材：
68.[0069][0070][0071]
主要仪器：
[0072][0073]
二、实验方法
[0074]
1、构建稳定转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs
[0075]
1.1、大鼠tdscs和bmscs的提取
[0076]
tdscs和bmscs提取方法如上述发明内容所述。
[0077]
1.2、载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的设计与构建采用rna提取试剂盒提取大鼠tdscs的总rna，逆转录成cdna。设计2个正向引物，2个反向引物，通过搭桥pcr扩增cbd、连接肽及外泌体表面膜蛋白cd63的完整序列，将cbd引入cd63第二个胞外环。采用xho1和bamh1分别对目的片段和载体pcdh-cmv-puro进行酶切，并用t4dna酶进行连接，转化，涂板。采用菌落pcr进行重组载体筛选，送检测序，确定成功构建载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd。
[0078]
1.3、慢病毒载体的包装与滴度测定
[0079]
慢病毒的包装：将含有目的片段的重组质粒载体与辅助质粒pspax2和pmd2.g混合均匀后转移至hek293t细胞培养基中，转染8h后更换为正常培养基，48h后收集细胞上清液，3000rpm离心15min，取上清用0.22μm滤膜过滤，滤液存于4℃冰箱待用。
[0080]
慢病毒滴度测定：将hek293t细胞接种至24孔板，待细胞汇合至70％时加入梯度稀释的病毒液，感染48h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。
[0081]
1.4、构建转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株
[0082]
将每孔5
×
105tdscs接种至6孔板中，待细胞融合至约30％，弃掉培养基按预实验筛选的最佳感染复数(multiplicity of infection，moi)，加入pcdh-cmv-puro-cd63-cbd病毒液，培养箱中感染24h后更换培养液。更换含最佳浓度嘌呤霉素的培养基筛选获得稳定表达的细胞株(cbd-tdscs)。
[0083]
1.5、检测过表达pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株是否构建成功
[0084]
以tdscs作为对照组1，只转染病毒载体的tdscs(vector-tdscs)作为对照组2，转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs(cbd-tdscs)作为实验组，从以下几个方面进行检测：
[0085]
1.5.1、检测目的基因的表达
[0086]
将三组细胞分别按每孔1
×
106的数量接种在24孔板上，待细胞长满后，提取总rna，反转录为cdna，设计cd63和cd63-cbd引物，用rt-qpcr检测目的基因表达。
[0087]
1.5.2、检测目的蛋白的表达
[0088]
将三组细胞分别按每孔1
×
104的数量接种在24孔板的爬片上，24h后，取出爬片进行cd63的免疫荧光染色，具体步骤如下：
[0089]
(1)固定：4％多聚甲醛固定20min，pbs洗3次。
[0090]
(2)破膜：1％triton-x破膜10min，pbs洗3次。
[0091]
(3)血清封闭：1％bsa，在室温条件下封闭30min左右，用滤纸吸掉多余血清。
[0092]
(4)一抗孵育：将抗体用抗体稀释液或pbs缓冲液按比例进行稀释，滴加一抗工作液，置于湿盒内，4℃条件下孵育至少12h。pbs缓冲液洗涤3次，每次3min。
[0093]
(5)二抗孵育：按1：1000的比例稀释二抗(抗体稀释液或pbs缓冲液)，滴加于组织切片，37℃条件下孵育1h。pbs缓冲液洗涤3次，每次3min。
[0094]
(6)dapi染核：用pbs缓冲液按1：1000的比例配制dapi工作液，滴加于组织切片，室温孵育3-5min，pbs缓冲液洗涤3次，每次3min。
[0095]
(7)封片：使用荧光防淬灭剂封片。
[0096]
1.6、提取转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体并鉴定
[0097]
分别将tdscs，vector-tdscs和cbd-tdscs(实验所用细胞为p3-p6代)培养至密度为50％-70％左右时，去除原有的含血清的培养基，换成新鲜的含5％无外泌体血清的培养基继续培养，当细胞密度达到80％-95％左右收集上清，分别提取单纯tdscs的外泌体(exo)、转染空载的tdscs的外泌体(vector-exo)和稳定转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的外泌体(cbd-exo)并对其进行鉴定。
[0098]
1.6.1超速离心法提取cbd-exo
[0099]
(1)500g，4℃离心5min去除活细胞。
[0100]
(2)2000g，4℃离心15min去除凋亡小体。
[0101]
(3)10000g，4℃离心45min去除微囊泡。
[0102]
(4)吸取离心后的上清液，0.22μm的滤器过滤后，将其转移至超速离心管中，100000g，4℃离心90min。
[0103]
(5)弃掉上清，用pbs缓冲液重悬后，加入36ml的pbs,100000g，4℃离心90min。
[0104]
(6)弃掉上清，用100μl无菌pbs重悬外泌体。
[0105]
(7)放入-80℃冰箱保存备用。
[0106]
1.6..2nta检测cbd-exo
[0107]
(1)取10μl外泌体样品稀释在990μl的pbs缓冲溶液中，然后使其混合均匀。
[0108]
(2)将1ml混合液用注射器注射到nta仪器的进样孔进行检测。1.6.3tem观察cbd-exo
[0109]
(1)取5μl稀释好的外泌体样品滴加在带碳膜的铜网上，静置3min。
[0110]
(2)用滤纸吸去多余的样本。
[0111]
(3)取5μl磷钨酸染液滴加在带样本铜网上，静置3min
[0112]
(4)用滤纸吸去多余的样本磷钨酸染液，静置干燥。
[0113]
(5)利用透射电镜进行形态学观察。
[0114]
1.6.4免疫印迹法检测cbd-exo特异性蛋白
[0115]
(1)将蛋白裂解物在100℃水浴条件下加热5min变性。
[0116]
(2)将20μg外泌体样本加到聚丙烯酰胺凝胶孔中，在100v电压下电泳2h。
[0117]
(3)转膜：使用之前先将pvdf膜用甲醇活化，然后剥下分离胶放在滤纸上，用pvdf膜盖在胶上，避免有气泡。最后，将另一个海绵垫盖在上边。200ma转膜1h，转膜过程中将转膜的槽放在冰水中降温。
[0118]
(4)免疫反应：将转好的膜在室温下，用5％的脱脂牛奶(0.5％tbst配)在脱色摇床上，封闭1h。孵育一抗(cd9,cd63,tsg101)，4℃过夜。室温下，用tbst溶液在脱色摇床上洗三次，每次5min。用tbst稀释二抗1000倍，室温下孵育60min后，用tbst在脱色摇床上洗三次，每次5min。
[0119]
(5)通过显影技术拍摄化学发光。
[0120]
1.7、转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体对bmscs功能的影响
[0121]
1.7.1edu染色
[0122]
取p3代bmscs，按5000cells/孔的密度接种到24孔板中，分为4组，除对照组以外，其余三组分别按1μg/ml加入exo、vector-exo和cbd-exo在5％无外泌体fbs的dmem中进行预处理，每组3个复孔，接着放入37℃、5％co2培养箱，在2d时进行edu检测，并用imagej软件进行计数。
[0123]
1.7.2cck8检测
[0124]
取p3代bmscs，按2000cells/孔的密度接种到96孔板中，分为4组，除对照组以外，其余三组分别按1μg/ml加入exo、vector-exo和cbd-exo在5％无外泌体fbs的dmem中进行预处理，每组3个复孔，接着放入37℃、5％co2培养箱，分别在1d，2d和3d时进行cck-8检测。
[0125]
1.7.3增殖基因pcna检测
[0126]
取p3代bmscs，按1
×
106cells/孔的密度接种到12孔板中，分为4组，除对照组以外，其余三组分别按1μg/ml的比例加入exo、vector-exo和cbd-exo在5％无外泌体fbs的
dmem中进行预处理，每组3个复孔，接着放入37℃、5％co2培养箱进行培养，在3d时，提取rna，逆转录为从cdna，进行rt-qpcr检测。
[0127]
pcna引物序列：
[0128]
forward：cacgtatatgccgggacctt
[0129]
reverse：tccccactcgcagaaaactt
[0130]
1.7.4trans-well小室
[0131]
取p3代bmscs，按1
×
106cells/孔的密度接种到24孔的trans-well小室的上室，分为4组，除对照组以外，其余三组下室分别按1μg/ml的比例加入exo、vector-exo和cbd-exo在5％无外泌体fbs的dmem中进行预处理，每组3个复孔，接着放入37℃、5％co2培养箱进行培养，在1d时，进行dapi和结晶紫染色，并用imagej软件进行计数。
[0132]
1.7.5rt-qpcr检测
[0133]
取p3代bmscs，按2
×
106cells/孔的密度接种到6孔板，分为4组，除对照组以外，其余三组分别按1μg/ml的比例加入exo、vector-exo和cbd-exo在5％无外泌体fbs的dmem中进行预处理，每组3个复孔，接着放入37℃、5％co2培养箱进行培养，在3d和7d时，提取rna，逆转录为cdna，进行rt-qpcr检测。
[0134]
1.7.6免疫荧光检测
[0135]
取p3代bmscs，按1
×
104cells/孔的密度接种到24孔板的爬片上，分为4组，除对照组以外，其余三组分别按1μg/ml的比例加入exo、vector-exo和cbd-exo在5％无外泌体fbs的dmem中进行预处理，每组3个复孔，接着放入37℃、5％co2培养箱进行培养，在3d时，进行tnmd(bs-7525r，1：200)和thbs4(ab263898，1：500)的免疫荧光染色。
[0136]
1.8、统计学分析
[0137]
所有计量资料均以均数
±
标准差表示，用spss16.0统计分析软件进行统计学分析。
[0138]
1.9、结果
[0139]
1.9.1成功构建转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株
[0140]
本实验成功构建了两种质粒，包括空载质粒和cd63-cbd质粒，cd63-cbd质粒包括cd63蛋白和cbd序列，cbd在cd63第二个胞外环(如图1所示)。通过rt-qpcr检测cd63基因水平的表达量，发现cbd-tdscs组的cd63表达量显著高于单纯tdscs组和vector-tdscs组(如图2所示)。免疫荧光染色结果可见单纯tdscs组、vector-tdscs组和cbd-tdscs组的cd63蛋白表达的差异(图3中的a)；定量分析发现cbd-tdscs组的cd63表达量显著高于单纯tdscs组和vector-tdscs组，并且单纯tdscs组和vector-tdscs组无显著性差异(如图3中的b所示)。上述结果证实，我们成功构建转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株(cbd-tdscs)。
[0141]
1.9.2转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体的提取及鉴定
[0142]
如图4所示，其为为外泌体形态示意图，对exo、vector-exo和cbd-exo外泌体标志物检测结果表明，cbd-exo组cd63的表达量高于其他两组，说明cbd-exo可能携带了cd63-cbd序列。cd9和tsg101在三组中均特异性表达(如图4中的b所示)。tem结果显示三组均为茶托状结构(如图4中的c所示)，这是外泌体的典型形态。nta分析显示，我们纯化的外泌体大小位于100-200nm的范围内(如图4中的d所示)。这些结果说明cd63上的基因修饰不会改变外泌体的大小和形状。
[0143]
1.9.3转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体对bmscs功能的影响
[0144]
1.9.3.1细胞增殖能力评价
[0145]
在本实验中，我们探究了exo、vector-exo和cbd-exo对bmscs增殖能力的影响。通过edu染色可见对照组、tdscs组、vector-tdscs组和cbd-tdscs组的cd63蛋白表达的差异(如图5中的a所示)；定量分析发现exo、vector-exo和cbd-exo组的edu+率均显著高于对照组，并且三组之间无显著性差异(如图5中的b所示)。通过rt-qpcr检测增殖相关基因pcna的表达量，也得到类似的结果(如图5中的c所示)。cck-8检测结果显示：随着培养时间的延长，各组的吸光度值逐步增加。培养3d时，exo、vector-exo和cbd-exo组的细胞增殖活性显著高于对照组(如图6所示)。说明，cd63上的基因修饰不会改变外泌体对bmscs的增殖的影响。
[0146]
1.9.3.2细胞迁移能力评价
[0147]
进一步，我们为了探究exo、vector-exo和cbd-exo对bmscs迁移能力的影响。分别用1μg/ml的三组外泌体预处理bmscs，连续培养24h后，通过结晶紫和dapi染色来观察bmscs的迁移情况，四组均有bmscs从上室穿过小室膜迁移到下室(如图7中的a所示)，半定量结果显示exo、vector-exo和cbd-exo组中迁移的数目无明显差异，但是均显著多于对照组(如图7中的b所示)。说明cd63上的基因修饰不会改变外泌体对bmscs迁移的影响。
[0148]
1.9.3.3细胞分化能力评价
[0149]
rt-qpcr结果显示：当exo、vector-exo和cbd-exo处理bmscs3d时，腱向分化基因scx、tnmd和thbs4的表达水平明显高于对照组，且三组之间无显著性差异。当exo、vector-exo和cbd-exo处理bmscs7d时，腱向分化基因scx、thbs4的表达水平明显高于对照组(如图8中的a、b和c所示)。而骨向分化基因runx2的表达水平在3d和7d时均明显低于对照组，并且三组之间无明显差异(如图8中的d所示)。在第3d时，tnmd和thbs4的免疫荧光检测也得到相同的结果(如图9所示)。以上结果提示，cd63上的基因修饰不会改变外泌体对bmscs的腱向分化能力的影响。
[0150]
在本实验中，获得稳定转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs，并且从基因层面和蛋白层面均证明我们转染成功。接着，通过提取外泌体的经典方法超速离心法获得经过cbd修饰的外泌体，使得修饰后的外泌体具有特异性靶向胶原的特性。
[0151]
接着，本技术发明人研究了基因修饰后的外泌体形态和对bmscs功能的影响。发现在cd63上进行基因修饰加入cbd并不改变外泌体的大小和形状。修饰后的外泌体依然具有促进bmscs增殖、迁移和腱向分化的能力。
[0152]
关于胶原靶向肌腱干细胞源外泌体耦合脱细胞肌腱支架的体外表征
[0153]
将本技术上述构建的胶原靶向的外泌体(cbd-exo)与dbtss支架特异性结合(cbd-exo+d)，实现外泌体与dbtss支架的耦合，克服外泌体在体内滞留率低的缺点，使得外泌体达到一定的浓度以维持其生物活性，从而增强dbtss支架的生物活性，截止目前，尚未见报道。dbtss支架为tdscs源外泌体创造良好的微环境，使得外泌体稳定负载于dbtss支架并且在需要时将其持续作用到缺损部位实现修复肌腱的目的。而且，作为载体的dbtss支架具有与天然肌腱匹配的缝合保留强度和拉伸性能，为桥接修复大段肌腱缺损的缝合和初始负重提供良好的条件。
[0154]
实验材料
[0155]
1、主要试剂及耗材
[0156][0157][0158]
2、主要仪器
[0159][0160]
3、实验方法
[0161]
3.1 cbd-exo+d支架的制备
[0162]
3.1.1肌腱材料的获取
[0163]
由新希望集团养牛场(四川洪雅县)提供出生一天的西门塔尔小牛10只。将新鲜的小牛后肢取出，小心解剖出跟腱，生理盐水清洗，-40℃冷冻保存以备用。
[0164]
3.1.2 dbtss支架的制备
[0165]
(1)压缩处理：截取跟腱均匀部分，长度40mm，测量每根跟腱段的直径d，沿垂直于直径方向压缩为δd(压缩应变为80％)，即δd＝0.8d进行压缩；
[0166]
(2)反复冻融：液氮中冷冻1min，37℃生理盐水水浴复温5min，反复5次；
[0167]
(3)核酸酶溶液处理：包括150iu/mldna酶、100μg/mlrna酶和100u/ml
“‑
galactosidase酶，37℃摇床震荡6h。预冷pbs清洗5次，每次30min；
[0168]
(4)清洗完成后，获得小牛脱细胞肌腱压片dbtss；
[0169]
(5)制备好的dbtss支架修剪成长
×
宽＝0.6cm
×
0.2cm大小的材料备用。
[0170]
3.1.3 cbd-exo的制备
[0171]
(1)大鼠tdscs和bmscs的提取。
[0172]
(2)构建过表达pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株。
[0173]
(3)提取cbd-exo。
[0174]
3.1.4cbd-exo耦合dbtss构建复合支架
[0175]
dbtss切成条状(6mm
×
2mm)，将dbtss放入1
×
1010颗粒数的外泌体溶液中,4℃放置6h，利用外泌体的胶原耦合特性，完成dbtss支架对修饰过的外泌体特异性结合，实现胶原靶向tdscs源外泌体与dbtss支架的耦合，得到复合支架材料(cbd-exo+d)。
[0176]
3.2cbd-exo+d的表征
[0177]
3.2.1cbd-exo+d中外泌体结合率检测
[0178]
将dbtss放入1
×
1010颗粒数的外泌体溶液中，以单纯的tdscs源外泌体复合dbtss支架作为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架作为实验组。4℃放置6h后，利用纳米颗粒追踪仪检测剩余溶液中外泌体的颗粒数。将总的颗粒数减去剩余的颗粒数，就是dbtss支架结合的颗粒数，计算出外泌体的结合率。
[0179]
3.2.2cbd-exo+d中外泌体缓释率检测
[0180]
以单纯的tdscs源外泌体复合dbtss支架作为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架作为实验组(设置dbtss组，排除dbtss支架释放的外泌体对实验结果的干扰)，置于pbs溶液中。每24h更换新鲜pbs溶液，并且检测pbs溶液中外泌体的颗粒数的变化。
[0181]
3.2.3扫描电镜(sem)观察
[0182]
以单纯的tdscs源外泌体复合dbtss支架作为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架作为实验组进行复合支架表面拓扑结构观察，检测外泌体与dbtss支架的结合情况。
[0183]
(1)分别取每组各三个样本，2.5％戊二醛固定24h；
[0184]
(2)pbs清洗3次，每次30min；
[0185]
(3)冷冻干燥24h，将材料冻干；
[0186]
(4)真空喷金后扫描电镜观察，采图。
[0187]
3.2.4激光共聚焦显微镜观察
[0188]
分别将tdscs源外泌体和tdscs源cbd修饰的外泌体用cm-dil染色，接着按3.2.1.4的方法分别与dbtss支架结合，4℃放置6h后，用pbs洗去未结合的外泌体，激光共聚焦显微镜观察，红色为外泌体，i型胶原自发绿色荧光，检测外泌体与dbtss的结合情况。
[0189]
3.2.5cbd-exo+d释放的外泌体tem观察
[0190]
以单纯的tdscs源外泌体复合dbtss支架作为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架作为实验组，置于pbs溶液中。24h后，取pbs溶液中的外泌体做tem观察，检测复合支架释放的外泌体形态是否改变。
[0191]
3.2.6cbd-exo+d释放的外泌体示踪
[0192]
取p3代bmscs，按1
×
104cells/孔的密度接种到24孔板的爬片上，待细胞贴壁后，换5％无外泌体血清的低糖dmem培养基。分为2组，分别将tdscs源外泌体和tdscs源cbd修饰的外泌体用cm-dil染色，单纯的tdscs源外泌体复合支架作为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架作为实验组。分别将复合支架与接种bmscs的24孔板的爬片共培养12h后，取出24孔板爬片进行固定及染色。
[0193]
(1)4％多聚甲醛固定20min，1％triton-x破膜25min，pbs洗3次。
[0194]
(2)5μg/ml鬼笔环肽室温染色30min，时间可以更长一些，pbs洗3次。
[0195]
(3)dapi染细胞核5min，pbs洗2次，激光共聚焦显微镜下随机挑取5个视野，拍照和计数，并行统计学分析。
[0196]
3.3cbd-exo+d对bmscs和tdscs体外诱导功能的影响
[0197]
3.3.1cck-8检测
[0198]
取p3代bmscs，按2000cells/孔的密度接种到96孔板中，待细胞贴壁后，换5％无外泌体血清的低糖dmem培养基，分为3组，每组5个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合dbtss支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。分别将各组的复合支架放入96孔板中，每孔放入1片。分别在1d，3d和5d时进行cck-8检测，观察吸光度值。
[0199]
取p3代tdscs，按1000cells/孔的密度接种到96孔板中，待细胞贴壁后，换5％无外泌体血清的低糖dmem培养基，分为3组，每组5个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合支架dbtss组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。分别将各组的复合支架放入96孔板中，每孔放入1片。分别在1d，3d和5d时进行cck-8检测，观察吸光度值。
[0200]
3.3.2增殖基因pcna检测
[0201]
取p3代bmscs，按1
×
106cells/材料的密度接种到材料上，用5％无外泌体血清的低糖dmem培养基培养，分为3组，每组3个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。在3d时，提取rna，逆转录为cdna，进行rt-qpcr检测。
[0202]
取p3代tdscs，按1
×
106cells/材料的密度接种到材料上，用5％无外泌体血清的低糖dmem培养基培养，分为3组，每组3个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。在3d时，提取rna，逆转录为cdna，进行rt-qpcr检测。
[0203]
3.3.3trans-well小室
[0204]
取p3代bmscs，按1
×
105cells/孔的密度接种到24孔的trans-well小室的上室，分为3组，每组3个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。下室中分别放入同样数量的dbtss，exo+d和cbd-exo+d材料，接着上室和下室均加入5％无外泌体血清的低糖dmem培养基，放入37℃、5％co2培养箱进行培养，24h后，进行dapi和结晶紫染色，并用imagej软件进行计数。
[0205]
取p3代tdscs，按1
×
105cells/孔的密度接种到24孔的trans-well小室的上室，分为3组，每组3个复孔。dbtss支架组，单纯的tdscs源外泌体复合支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。下室中分别放入同样数量的dbtss，exo+d和cbd-exo+d材料，接着上室和下室均加入5％无外泌体血清的低糖dmem培养基，放入37℃、5％co2培养箱进行培养，24h后，进行dapi和结晶紫染色，并用imagej软件进行计数。
[0206]
3.3.4rt-qpcr检测
[0207]
取p3代bmscs，按1
×
106cells/材料的密度接种到材料上，用5％无外泌体血清的低糖dmem培养基培养，分为3组，每组3个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。在3d和7d时，提取rna，逆转录为cdna，进行rt-qpcr检测。
[0208]
取p3代tdscs，按1
×
106cells/材料的密度接种到材料上，用5％无外泌体血清的低糖dmem培养基培养，分为3组，每组3个复孔。dbtss支架组(d)，单纯的tdscs源外泌体复合支架组(exo+d)为对照组，tdscs源外泌体利用cbd耦合dbtss支架组(cbd-exo+d)为实验组。在3d和7d时，提取rna，逆转录为cdna，进行rt-qpcr检测。
[0209]
3.4统计学分析
[0210]
所有计量资料均以均数
±
标准差表示，用spss16.0统计分析软件进行统计学分析。
[0211]
3.5结果
[0212]
3.5.1cbd-exo+d的表征
[0213]
3.5.1.1cbd-exo+d的外泌体结合率
[0214]
nta检测结果显示，单纯的tdscs源外泌体和cbd修饰的tdscs源外泌体均可以与dbtss支架结合。而cbd-exo+d的结合率显著高于exo+d组(如图10中的a)。
[0215]
3.5.1.2cbd-exo+d的外泌体缓释率
[0216]
nta检测结果显示，两组均在第3d时释放趋于稳定，但是exo+d组的释放率显著高于cbd-exo+d组(如图10中的b所示)。说明含有胶原结合结构域cbd的外泌体与支架结合更紧密一些。
[0217]
3.5.1.3cbd-exo+d形态观察
[0218]
大体观察显示：exo+d和cbd-exo+d表面均呈乳白色，二者无明显差异(如图11中的a所示)。sem结果显示：cbd-exo+d材料表面可以看到大量大小均一，并且分布比较均匀的外泌体，偶尔会看到外泌体聚集现象；exo+d复合支架表面外泌体含量较少，分布较分散(如图11中的b所示)。激光共聚焦显微镜观察结果显示：cbd-exo+d材料组表面可以看到大量的外泌体(红色)分布在材料(绿色)表面(如图11中的a所示)，定量统计结果显示cbd-exo+d组的结合率与exo+d组相比显著增高(如图11中的b所示)。
[0219]
3.5.1.4cbd-exo+d释放的外泌体形态观察及示踪
[0220]
tem结果显示：cbd-exo+d释放的外泌体呈椭圆形，符合外泌体典型的形态特征(如图12所示)。将复合支架(含外泌体)与bmscs培养12h后，用dapi标记细胞核，fitc标记的鬼笔环肽染肌动蛋白骨架，激光共聚焦显微镜拍照观察，结果显示：cbd-exo+d释放的外泌可以进入细胞内部，被细胞摄取从而影响细胞的功能(如图13所示)。
[0221]
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：包括以下步骤：s1、构建稳定转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs：s1-1、提取大鼠tdscs和bmscs；s1-2、设计及构建载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd；s1-3、慢病毒载体的包装与滴度测定；s1-4、构建转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs的稳株；s2、提取转染pcdh-cmv-puro-cd63-cbd的tdscs源外泌体并鉴定。2.如权利要求1所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：步骤s1-1中tdscs和bmscs提取方法为：使用2w龄spraguedawley大鼠，10％的水合氯醛腹腔麻醉处死，然后分别放入碘伏和75％酒精中浸泡各5min，取出后放入超净工作台中，在无菌条件下进行操作；将tdscs从大鼠跟腱和屈肌腱中分离出来的，用3mg/mli型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶在37℃下消化60min；并用70μm的细胞过滤器过滤组织溶液，以获得单细胞悬浮液；进行bmscs分离，采用低糖dmem培养基从股骨骨髓腔中冲出骨髓；然后，将悬浮液通过70μm的细胞过滤器过滤，并在1200rpm下离心5min；其中，bmscs和tdscs都用完全培养基重悬后，接种于t25细胞培养瓶中，置于恒温培养箱中孵育，孵育条件为37℃，5％co2；待细胞贴壁24h后首次换液，以后每2-3d换液一次，待细胞达到80-90％的融合时，使用tne进行消化，随后细胞进行传代，采用p3代的tdscs和bmscs。3.如权利要求2所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：所述完全培养基为含15％fbs和1％双抗的低糖dmem培养基。4.如权利要求1所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：步骤s1-2的具体方法为：采用rna提取试剂盒提取大鼠tdscs的总rna，逆转录成cdna；设计2个正向引物，2个反向引物，通过搭桥pcr扩增cbd、连接肽及外泌体表面膜蛋白cd63的完整序列，将cbd引入cd63第二个胞外环；采用xho1和bamh1分别对目的片段和载体pcdh-cmv-puro进行酶切，并用t4dna酶进行连接，转化，涂板；采用菌落pcr进行重组载体筛选，送检测序，确定成功构建载体pcdh-cmv-puro-cd63-cbd。5.如权利要求1所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：步骤s1-3的具体方法为：慢病毒的包装：将含有目的片段的重组质粒载体与辅助质粒pspax2和pmd2.g混合均匀后转移至hek293t细胞培养基中，转染8h后更换为正常培养基，48h后收集细胞上清液，3000rpm离心15min，取上清用0.22μm滤膜过滤，滤液存于4℃冰箱待用；慢病毒滴度测定：将hek293t细胞接种至24孔板，待细胞汇合至70％时加入梯度稀释的病毒液，感染48h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。6.如权利要求1所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：步骤s1-4的
具体方法为：将每孔5
×
105tdscs接种至6孔板中，待细胞融合至约30％，弃掉培养基按预实验筛选的最佳感染复数，加入pcdh-cmv-puro-cd63-cbd病毒液，培养箱中感染24h后更换培养液；更换含最佳浓度嘌呤霉素的培养基筛选获得稳定表达的细胞株(cbd-tdscs)。7.如权利要求1所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：步骤s2的具体方法为：分别将tdscs、vector-tdscs和cbd-tdscs培养至密度为50％-70％时，去除原有的含血清的培养基，换成新鲜的含5％无外泌体血清的培养基继续培养，当细胞密度达到80％-95％时收集上清，分别提取单纯tdscs的外泌体(exo)、转染空载的vector-tdscs的外泌体(vector-exo)和稳定转染cbd-tdscs的外泌体(cbd-exo)并对其进行鉴定。8.如权利要求1所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，其特征是：所述干细胞源为肌腱干细胞、骨髓干细胞或脂肪干细胞。9.如权利要求1-8任意一项所述的胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法在制备含胶原的脱细胞支架的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征是：通过将胶原靶向干细胞源外泌体负载于含胶原的脱细胞支架上，所述含胶原的脱细胞支架为脱细胞肌腱切片、脱细胞sis支架、脱细胞皮肤支架或脱细胞脱钙骨基质支架。

技术总结
本发明公开了胶原靶向的干细胞源外泌体的构建方法，涉及生物医学技术领域，该方法包括以下步骤：S1、构建稳定转染pCDH-CMV-Puro-CD63-CBD的TDSCs：S1-1、提取大鼠TDSCs和BMSCs；S1-2、设计及构建载体pCDH-CMV-Puro-CD63-CBD；S1-3、慢病毒载体的包装与滴度测定；S1-4、构建转染pCDH-CMV-Puro-CD63-CBD的TDSCs的稳株；S2、提取转染pCDH-CMV-Puro-CD63-CBD的TDSCs源外泌体并鉴定。本发明的方法构建的胶原靶向的干细胞源外泌体，能够应用于通过将胶原靶向干细胞源外泌体负载于含胶原的脱细胞支架上，解决了外泌体结合于含胶原的脱细胞支架上的稳定性问题，便于外泌体达到发挥作用所需浓度，使得外泌体达到一定的浓度从而在体内环境下实现促组织再生的目的。从而在体内环境下实现促组织再生的目的。从而在体内环境下实现促组织再生的目的。


技术研发人员：秦廷武 崔静 张艳净 李瑄
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/15