靶向人DLL3的嵌合抗原受体T细胞及其应用

靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞及其应用。


背景技术：

2.肺癌是全球癌症死亡人数最高的疾病，其主要分为小细胞肺癌(small-cell lung cancer，sclc)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，nsclc)两大类，sclc和nsclc是两种完全不同的疾病，sclc是一种高级别神经内分泌癌，约占所有肺癌的15％～20％，但其恶性程度比非小细胞肺癌更高，可选的治疗方式更少。sclc主要在吸烟和既往吸烟者中发病，临床症状主要表现为咳嗽、喘息、呼吸困难、咳血等，大多数患者首次诊断时即出现癌细胞转移至对侧肺、肝、脑、骨、肾上腺等部位，预后异常差。绝大部分sclc患者接受细胞毒性药物结合放化疗治疗后早期疗效较好，但这种反应是短暂的，患者的中位生存期小于2年，而转移患者仅有约1年。因此，急需科研工作者从临床以及生物学角度对sclc的流行病学、发病机制、分子通路、细胞通路以及新的治疗方式等方面进一步研究，从而为sclc的治疗提供新的方向。
3.delta样配体3(delta-like ligand 3，dll3)是一种ⅰ型单次跨膜蛋白，属于notch配体家族成员之一。人dll3蛋白由618个氨基酸组成，包括1个dsl结构域(175～215aa)、6个egf样重复序列(216～465aa)、一个跨膜域(493～513aa)和一个胞内结构域(514～618aa)，其中胞外n端的dsl结构域序列高度保守，是与notch受体结合的必要结构。研究表明，dll3在sclc和其他神经或神经内分泌肿瘤中高表达，而在正常组织细胞中不表达或少量表达(仅在胞内表达)；尤其在sclc中，超过80％的患者癌细胞表面有dll3的阳性表达，而在正常组织及癌旁组织中不表达，这种差异性使得dll3可能成为一种良好的靶向治疗靶点。
4.纳米抗体(nanobody，nb)是存在于驼科动物和鲨鱼体内的一种天然缺失轻链和重链第一恒定区的抗体可变区(vhh)。nb被认为是目前发现的最小的具有结合完整抗原功能的抗体分子，其结构呈橄榄球状，直径约2.5nm，高约4nm，分子量(15kda)仅为传统igg抗体分子质量的1/10。与其他抗体片段相比，nb具有高稳定性、可溶性好、亲和力高、特异性强、易偶联及易改造等特性，基于上述特性，nb被广泛应用于疾病的诊断、治疗以及科学研究中。
5.嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor-t cell，car-t)作为肿瘤免疫治疗的新兴技术，在抗肿瘤研究中取得了突破性进展，尤其在多种血液系统恶性肿瘤的治疗中表现出优异的疗效，改变了血液瘤的治疗模式并有效推动了其他免疫疗法的发展。car-t是通过基因工程技术将针对肿瘤抗原的结合域与共刺激分子结构域共表达于t细胞表面，t细胞表面的抗原结合域能够特异性识别肿瘤抗原并启动下游信号通路，使得t细胞活化、增殖并释放穿孔素、颗粒酶、il-2、ifn-γ和tnf-α等细胞因子杀伤肿瘤细胞，从而达到清除肿瘤细胞的目的。
6.目前，靶向dll3用于sclc治疗的在研药物治疗形式包括单抗、adc、双抗、多抗、
car-t和car-nk等，但疗效都还有待提高。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题为：现有靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞治疗效果还有待提高的问题。
9.本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞。
10.首先，本发明提供了一种抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体包括：包含cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，所述cdr1的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:5或seq idno:9所示，所述cdr2的氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:6或seq id no:10所示，所述cdr3的氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:7或seq id no:11所示。
11.进一步的，上述抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体为：cdr1的氨基酸序列如seq idno:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3；
12.或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7；
13.或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11。
14.其中，上述抗dll3的纳米抗体中，还包括骨架区，所述纳米抗体的vhh链的结构为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
15.进一步的，上述抗dll3的纳米抗体中，所述纳米抗体的vhh链的氨基酸序列为seq idno:4、seq id no:8或seq id no:12中的任意一种。
16.进一步的，上述抗dll3的纳米抗体cdr1的氨基酸序列如seq id no:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3，vhh的氨基酸序列如seq id no:4；
17.或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7，vhh的氨基酸序列如seq id no:8；
18.或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11，vhh的氨基酸序列如seq id no:12。
19.其中，上述抗体序列如下表1所示：
20.表1抗体氨基酸序列
[0021][0022]
进一步的，上述抗dll3的纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体或融合型纳米抗体中的至少一种。
[0023]
本发明还提供了一种嵌合抗原受体，其胞外域包含了上述抗dll3的纳米抗体。
[0024]
其中，上述嵌合抗原受体中，还包括了信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
[0025]
进一步的，所述的信号肽包括cd8α信号肽；铰链区包括cd8α铰链区；跨膜区包括cd28跨膜域；所述信号转导结构域包括cd3ζ或4-1bb胞内区。
[0026]
本发明提供了一种car-t细胞，包括上述嵌合抗原受体。
[0027]
进一步的，所述的述car-t细胞包括通用型car-t细胞和自体car-t细胞中的至少一种。
[0028]
进一步的，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，编码上述纳米抗体或嵌合抗原受体。
[0029]
进一步的，上述分离的多核苷酸的核苷酸序列为seq id no:13、seq id no:14或seq idno:15所示。
[0030]
本发明还提供了一种重组载体，含有上述分离的多核苷酸。
[0031]
本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的重组载体。
[0032]
本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，包括上述抗dll3的纳米抗体或嵌合抗原受体。
[0033]
进一步的，本发明还提供了一种上述抗dll3的纳米抗体、嵌合抗原受体、car-t细胞、分离的多核苷酸和宿主细胞在制备预防、诊断或治疗肿瘤的药物中的用途。
[0034]
进一步的，所述的肿瘤包括小细胞肺癌、神经内分泌前列腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、转移性去势性前列腺癌、大细胞神经内分泌癌、小细胞膀胱癌、肺神经内分泌瘤或多形性胶质细胞瘤中的至少一种。
[0035]
本发明具有以下有益效果：
[0036]
本发明筛选到效果显著的抗dll3纳米抗体，并以抗dll3纳米抗体为抗原结合域制备car-t细胞，得到car-t细胞均具有良好的抗肿瘤活性，可应用于制备预防或治疗小细胞肺癌、神经内分泌前列腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、转移性去势性前列腺癌、大细胞神经内分泌癌、小细胞膀胱癌、肺神经内分泌瘤或多形性胶质细胞瘤等肿瘤的药物，具有广泛的用途。
附图说明
[0037]
图1是本发明实施例中利用间接elisa检测抗dll3抗体效价；
[0038]
图2是本发明实施例中利用sds-page检测抗dll3-nb的表达及纯化；
[0039]
图3是本发明实施例中利用间接elisa分析抗dll3-nb的结合特异性；
[0040]
图4是本发明实施例中利用间接elisa分析抗dll3-nb与dll3抗原的结合活性；
[0041]
图5是本发明实施例中利用facs分析抗dll3-nb与dll3-shp-77细胞表面dll3的结合特异性；
[0042]
图6是本发明实施例中抗dll3的嵌合抗原受体结构示意图；
[0043]
图7是本发明实施例中抗dll3的car在t细胞表面表达效率检测；
[0044]
图8是本发明实施例中car-t细胞对dll3-shp-77细胞的体外杀伤效率检测。
具体实施方式
[0045]
本发明提供了一种抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体包括：包含cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，所述cdr1重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:5或seq idno:9所示，所述cdr2重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:6或seq idno:10所示，所述cdr3重链可变区的氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:7或seq idno:11所示。
[0046]
进一步的，上述抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体为：cdr1的氨基酸序列如seq idno:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3；
[0047]
或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7；
[0048]
或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11。
[0049]
其中，上述抗dll3的纳米抗体中，还包括骨架区，所述纳米抗体的vhh链的结构为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0050]
进一步的，上述抗dll3的纳米抗体中，所述纳米抗体的vhh链的氨基酸序列为seq idno:4、seq id no:8或seq id no:12中的任意一种。
[0051]
进一步的，上述抗dll3的纳米抗体cdr1的氨基酸序列如seq id no:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3，vhh的氨基酸序列如seq id no:4；
[0052]
或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7，vhh的氨基酸序列如seq id no:8；
[0053]
或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11，vhh的氨基酸序列如seq id no:12。
[0054]
进一步的，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体或融合型纳米抗体中的至少一种。
[0055]
进一步的，所述抗体可以为重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。
[0056]
本发明还提供了一种嵌合抗原受体，其胞外域包含了上述抗dll3的纳米抗体。
[0057]
其中，上述嵌合抗原受体中，还包括了信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
[0058]
进一步的，所述的信号肽包括cd8α信号肽；铰链区包括cd8α铰链区；跨膜区包括cd28跨膜域；所述信号转导结构域包括cd3ζ或4-1bb胞内区。
[0059]
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
[0060]
本发明提供了一种car-t细胞，包括上述嵌合抗原受体。
[0061]
进一步的，所述的car-t细胞包括通用型car-t细胞和自体car-t细胞中的至少一种。
[0062]
进一步的，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，编码上述纳米抗体或嵌合抗原受体。
[0063]
进一步的，上述分离的多核苷酸的核苷酸序列为seq id no:13、seq id no:14或seq idno:15所示。
[0064]
seq id no：13编码抗体nb15的核苷酸序列
[0065]
caggtgcagctgcaggagtctgggggagatagcgtgcaggcgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttgatgaactgagctatagctggtttcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtgagcggcattgatagccagggcgatgtgccggaaagcaaatatgcggaaagcgtgaacggccgctttaccattagccaggatgatgcgaaatataccgtgtatctgcgcatgaacaacctgaaaccggaagataccgcggtgtatacctgcgcggcgcgcagcacctgggatgtggatagcttttgccatcgcattagcgcgtttacctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcg。
[0066]
seq id no：14编码抗体nb63的核苷酸序列
[0067]
caggtgcagctgcaggagtctgggggaggcagcgtgcagaccggcggcagcctgcgcgtgagctgcgcgtgcagcaaatttaaccgcgtgcattatacctggtttcgccaggcgccgggcaaagaacgcgaaggcgtgagctttatttatcgcggctttagcaccctgtatgcggatagcgtgaacggccgctttgcgattagcaaaaacaacgcgaaaaacaccctgtatctgctgatgaacagcctgcgcccggaagataccgcgatgtatttttgcgcggcggtggatccgtgcggcaccagcaaatggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcg。
[0068]
seq id no：15编码抗体nb86的核苷酸序列
[0069]
caggtgcagctgcaggagtctgggggaggcagcgtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgc
gggcccgcgctttctgagccaggaagcgtattgctggtatcgccaggcgccgggcaaagaactggaaggcgtggcgaccattagcaacggcccgatgcgcgcgcagacctattatgcgccgagcgtgaaaggccgctttaccattagccaggatagcgcgaaaaacaccgtgtttctgagcatgaacagcctgaaaccggaagataccgcgatgtatagctgcgcggcggatagctatcgctgccattatgattatggccaggcgtggcataaaaactatagctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcg。
[0070]
本发明还提供了一种重组载体，含有上述分离的多核苷酸。
[0071]
所述重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化、转染或转导的方式将目的dna片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内进行目的基因表达。其中一种类型的载体是质粒，即环状双链dna分子，可将目的dna片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的dna片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)，这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
[0072]
本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的重组载体。
[0073]
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前述任意实施例所述的重组载体。具体地，宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞以及噬菌体中的至少一种。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、链霉菌或枯草杆菌等。所述真核宿主细胞可以为293细胞、293t细胞、293ft细胞、cho细胞、cos细胞、per6细胞，酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、部分昆虫细胞以及植物细胞。293系列细胞，per6细胞和cho细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
[0074]
本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，包括上述抗dll3的纳米抗体或嵌合抗原受体。
[0075]
进一步的，所述免疫缀合物还包括治疗剂。
[0076]
所述治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、抗体偶联药、双(多)特异性抗体、放射性核素、毒素、因子、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种。
[0077]
本发明所述的“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。一些药物组合物是通过联合施用一些可药用成分或化合物，达到增强本发明的生物功效或减小药物副作用(例如，可以和其他抗肿瘤药物联合使用，增强抗肿瘤效果)。另一些药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收，增强稳定性或靶向性，延长半衰期，进而更好的发挥本发明的生物功效。
[0078]
进一步的，所述药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
[0079]
进一步的，本发明还提供了一种上述抗dll3的纳米抗体、嵌合抗原受体、car-t细胞、分离的多核苷酸和宿主细胞在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
[0080]
本发明所述的“治疗”包括治愈、改善、降低患者的病情或病理特征，或抑制病情的恶化。
[0081]
可选地，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种。
[0082]
可选地，所述治疗肿瘤的产品包括靶向dll3以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
[0083]
可选地，所述肿瘤包括小细胞肺癌、神经内分泌前列腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、转移性去势性前列腺癌、大细胞神经内分泌癌、小细胞膀胱癌、肺神经内分泌瘤或多形性胶质细胞瘤中的至少一种。
[0084]
本发明还提供了一种抗体的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞，以获得抗体。具体地，本发明对宿主细胞的培养条件没有具体地限定，基于常规技术知识可获得能够使得宿主细胞表达产生所述抗体的培养条件。
[0085]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0086]
实施例1dll3蛋白真核表达载体的构建及其表达、纯化
[0087]
1.1载体构建
[0088]
以含有dll3全长基因(基因编号nm_016941.4)的质粒为模板，设计引物扩增获得dll3胞外区(ecd)基因，并利用同源重组的方式将其连接至经限制性内切酶hindⅲ和kpnⅰ双酶切后的pcdna3.1-his载体中，通过转化至dh5α感受态中涂布氨苄抗性平板置于37℃温箱培养过夜，挑取单克隆测序鉴定，对构建成功的克隆扩大培养提取质粒。
[0089]
1.2dll3重组蛋白的表达及纯化
[0090]
将构建成功的含有dll3胞外区基因的重组质粒pcdna3.1-dll3-his转染至hek293t细胞中，瞬转8h后更换为293freestyle培养基并培养5天后收集细胞培养上清，利用nta-ni柱通过亲和层析的方式纯化获得高纯度的重组蛋白dll3-his。
[0091]
实施例2抗dll3蛋白纳米抗体的筛选与制备
[0092]
2.1动物免疫
[0093]
将1mg纯化的dll3-his重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后对阿拉善双峰驼通过颈部皮下进行第一次免疫，然后每隔2周将1mg蛋白与不完全弗氏佐剂乳化后连续进行3次免疫，冲击免疫后第7天采集外周抗凝血和凝血，并将dll3-his重组蛋白包被于96孔酶标板，通过间接elisa检测抗体效价，结果如图1所示，骆驼外周血中抗dll3-his重组蛋白的抗体效价为1:512000，表明免疫效果良好，可以进行后续抗体文库构建。
[0094]
2.2vhh噬菌体抗体文库的构建及淘选
[0095]
2.2.1外周血淋巴细胞的分离
[0096]
从骆驼颈部静脉无菌采集200ml外周抗凝血，先用等体积的无菌pbs稀释，再用ficoll-paque plus淋巴细胞分离液(catalog 17144002，cytiva)和淋巴细胞分离管通过离心的方式分离获得8
×
108个外周血淋巴细胞，得到的淋巴细胞可直接提取总rna或冻存于-80℃备用。
[0097]
2.2.2vhh基因扩增
[0098]
首先按照说明书提取淋巴细胞总rna(catalog 74134,rneasy plus mini kit,qiagen)，再利用反转录试剂盒(catalog 18080051,superscriptⅲfirst-strand synthesis system,invitrogen)以rna为模板反转录获得cdna，再以cdna为模板，利用巢式pcr扩增vhh基因，第一轮pcr所用引物为call001(核苷酸序列如seq id no：16所示)和call002(核苷酸序列如seq id no：17所示)，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收约700bp条带；然后以回收的700bp产物为模板进行第二轮pcr扩增，第二轮pcr所用引物为vhh-for(核苷酸序列如seq id no：18所示)和vhh-rev(核苷酸序列如seq id no：19所示)，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收400bp条带，引物序列如下表2所示。
[0099]
表2vhh基因扩增所需引物序列
[0100]
引物名称序列编号引物序列(5
’‑3’
)call001seq id no：16gtcctggctgctcttctacaaggcall002seq id no：17ggtacgtgctgttgaactgttccvhh-forseq id no：18caggtgcagctgcaggagtctgggggagrvhh-revseq id no：19ctagtgcggccgctgaggagacggtgacctgggt
[0101]
2.2.3vhh噬菌体展示载体的构建
[0102]
将2.2.2中回收的400bp产物和噬菌体展示载体pmecs均用pst i和not i双酶切并回收，然后利用t4 dna连接酶连接。
[0103]
2.2.4连接产物电转tg1感受态细胞及噬菌体抗体文库的收获
[0104]
将2.2.3中连接产物加入大肠杆菌tg1感受态细胞中通过电转的方式使其进入tg1中，电转完成后立即加入soc培养基并于37℃、200rpm培养1h后，涂布于lb/amp-glu平板，37℃培养6～8h后，收集菌苔，加入1/3体积的50％甘油，即为制备的噬菌体文库。
[0105]
2.2.5噬菌体文库多样性和库容的测定
[0106]
将电转化产物进行10倍梯度稀释后涂布于lb/amp-glu平板，37℃培养12h后，计数转化子数量，得到库容量为3.92
×
109的噬菌体文库。
[0107]
2.2.6抗dll3蛋白的特异性纳米抗体筛选
[0108]
以制备的噬菌体文库为抗体来源，利用噬菌体展示技术经过3轮筛选。首先将纯化的dll3-his重组蛋白(2μg/ml)包被于96孔酶标板，次日用3％脱脂奶粉于37℃封闭1h，每孔加入1
×
10
10
个含有纳米抗体的重组噬菌体，37℃孵育1h后用pbst洗涤5次，再用0.1m甘氨酸(ph 1.5)洗脱与dll3-his结合的噬菌体，并用1m tris-hcl(ph 8.0)中和，洗脱液再次感染宿主菌tg1并扩大培养，连续进行3轮筛选。从第三轮筛选的平板中随机挑选96个克隆扩大培养，利用单克隆elisa鉴定其中能够特异性结合dll3蛋白的纳米抗体，结果表明96个克隆中共有85个为阳性克隆(p/n》3.0，p代表dll3孔od
450
数值，n代表对照孔od
450
数值)；对阳性克隆测序结果比对分析，共获得3株抗dll3的特异性纳米抗体。
[0109]
实施例3抗dll3蛋白的特异性纳米抗体的制备
[0110]
以实施例2.2.6中含有纳米抗体基因的质粒为模板扩增vhh基因并通过同源重组的方式构建至真核表达载体pcdna3.1-hfc中，经测序无误后提取质粒并将其转染至hek293t细胞中，表达5天后收集上清，利用nta-ni柱通过亲和层析的方式纯化获得重组纳米抗体(110kda，非还原)(如图2所示)。
[0111]
实施例4抗dll3蛋白纳米抗体的特异性分析
[0112]
以实施例3中制备的抗dll3特异性纳米抗体为一抗(2μg/ml)，与包被于酶标板中的dll3-his重组蛋白及其他无关抗原(cd276-his、pd1-his、cd5-his、cd7-his和cd47-his)(200ng/孔)在37℃共孵育1h，pbst洗涤3次后，每孔加入100μl hrp标记的goat anti-human抗体(1:4000)并于37℃孵育1h，pbst洗涤3次后，用tmb显色5min后用2m h2so4终止反应，并读取od450 nm吸光值。结果如图3所示，获得的3株纳米抗体与dll3蛋白均能够结合，且不与其他无关抗原反应，表明上述纳米抗体与dll3蛋白均具有良好的特异结合活性。
[0113]
实施例5间接elisa检测纳米抗体与dll3蛋白的结合
[0114]
将dll3-his重组蛋白按照每孔200ng包被于96孔酶标板中，用3％脱脂奶粉于37℃
封闭1h，pbst洗涤3次后，每孔加入100μl不同浓度的(102～10-5
μg/ml)实施例3中制备的重组纳米抗体并于37℃孵育1h，pbst洗涤3次后，每孔加入100μl hrp标记的goat anti-human抗体(1:4000)并于37℃孵育1h，pbst洗涤3次后，tmb显色5min后用2m h2so4终止反应，并读取od450 nm吸光值。结果如图4所示，获得的3株纳米抗体与dll3蛋白均具有良好的结合活性，且对照蛋白hfc不结合。
[0115]
实施例6biacore检测纳米抗体与dll3蛋白的亲和力
[0116]
为进一步检测纳米抗体与dll3蛋白的亲和力，本发明将制备的抗dll3重组纳米抗体分别与包被于cm5芯片上的dll3-his抗原利用biacore 8k仪器检测结合亲和力，结果如表3所示，3株纳米抗体与dll3蛋白的亲和力在10-10
～10-9
m，属于高亲和力抗体。
[0117]
表3抗dll3纳米抗体与dll3蛋白体外结合亲和力和动力学分析
[0118]
抗体结合速率ka(1/m*s)解离速率kd(1/s)亲和力kd(m)nb154.23e+055.23e-051.24e-10nb631.24e+053.87e-043.12e-09nb864.92e+059.24e-041.88e-09
[0119]
实施例7facs检测纳米抗体与细胞水平dll3的结合
[0120]
将实施例3中制备的重组纳米抗体(5μg/ml)分别与过表达dll3的shp-77细胞(小细胞肺癌)及敲除dll3的shp-77细胞(dll3-ko-shp-77)于37℃孵育1h，pbs洗涤3次后，与apc标记的goat anti-human二抗(1:600)于37℃孵育1h，pbs洗涤3次后利用流式分析仪进行检测，结果如图5所示，上述纳米抗体与dll3-shp-77细胞具有良好的结合活性，与dll3-ko-shp-77细胞均不结合，表明本发明制备的3株抗dll3的纳米抗体与细胞水平的dll3均具有良好的特异结合活性。
[0121]
实施例8嵌合抗原受体(car)慢病毒载体构建
[0122]
以本发明中抗dll3纳米抗体质粒为模板扩增靶向dll3的纳米抗体基因并利用同源重组方式克隆至慢病毒载体pslcar-bbz中，构建获得一种二代car，该car主要包含以下元件：cd8α信号肽、抗原结合域(αdll3-nb)、cd8α铰链区、cd28跨膜域、4-1bb胞内信号转导结构域和cd3ζ信号转导结构域(图6)。
[0123]
实施例9car-t细胞体外抗肿瘤活性检测
[0124]
9.1car-t细胞制备
[0125]
采集健康供者外周血并分离淋巴细胞，利用cd3/cd28磁珠刺激48h，活化扩增获得高纯度的t细胞，将本发明中构建的car慢病毒质粒与包装质粒pspax2和pmd2.g共转染hek293t细胞48h后收集培养上清，0.45μm滤器过滤后超速离心浓缩获得car慢病毒，再利用获得的car慢病毒感染刺激活化的t细胞制备成car-t细胞。结果如图7所示，car-15、car-63和car-86的表达效率分别为80.79％、77.52％和79.67％。
[0126]
9.2car-t细胞抗肿瘤活性检测
[0127]
通过体外共培养试验检测car-t细胞抗肿瘤效果，将对数生长期的dll3-shp-77-luciferase(2
×
104/孔)细胞接种于96孔细胞培养板中，并按照效靶比(10:1)加入制备的car-t细胞，共培养24h后每孔加入3μl荧光素钾盐(15mg/ml)，混匀孵育5min后置于多功能酶标仪中检测562nm处吸光值，根据不同处理组别吸光值计算car-t细胞的杀伤效率，杀伤效率计算公式为：杀伤效率％＝(1-实验组荧光值/阴性对照组荧光值)
×
100％，其中阴性
对照组为不添加car-t细胞的正常生长的dll3-shp-77-luciferase组。
[0128]
结果如图8所示，靶向dll3的car-15、car-63、car-86以及无关对照靶向cd19的car-cd19对dll3-shp-77细胞的杀伤效率分别为74.20％、75.78％、72.18％和5.06％，表明本发明制备的靶向dll3的car-t细胞对dll3阳性的肿瘤细胞具有良好的特异杀伤活性(p《0.0001)。
[0129]
本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.抗dll3的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括：包含cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，所述cdr1的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:5或seq id no:9所示，所述cdr2的氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:6或seq id no:10所示，所述cdr3的氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:7或seq id no:11所示。2.根据权利要求1所述的抗dll3的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体为：cdr1的氨基酸序列如seq id no:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3；或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7；或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11。3.根据权利要求1或2所述的抗dll3的纳米抗体，其特征在于：还包括骨架区，所述纳米抗体的vhh链的结构为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。4.根据权利要求3所述的抗dll3的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的vhh链的氨基酸序列为seq id no:4、seq id no:8或seq id no:12中的任意一种。5.嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的胞外域包含了权利要求1-4任一项所述的抗dll3的纳米抗体。6.car-t细胞，其特征在于：包括权利要求5所述的嵌合抗原受体。7.分离的多核苷酸，其特征在于：编码权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或权利要求5所述的嵌合抗原受体。8.根据权利要求7所述的分离的多核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列为seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15所示。9.权利要求1-4任一项所述的抗dll3的纳米抗体、权利要求5所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的car-t细胞、权利要求7或8所述的分离的多核苷酸在制备预防、诊断或治疗肿瘤的药物中的用途。10.根据权利要求9所述的制备预防、诊断或治疗肿瘤的药物中的用途，其特征在于：所述的肿瘤包括小细胞肺癌、神经内分泌前列腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、转移性去势性前列腺癌、大细胞神经内分泌癌、小细胞膀胱癌、肺神经内分泌瘤或多形性胶质细胞瘤中的至少一种。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种靶向人DLL3的嵌合抗原受体T细胞及其应用。针对现有靶向人DLL3的嵌合抗原受体T细胞治疗效果还有待提高的问题，本发明提供了一种靶向人DLL3的嵌合抗原受体T细胞及应用。本发明利用噬菌体展示技术从VHH免疫文库中筛选到3株可特异性识别和结合细胞表面DLL3抗原的特异性纳米抗体，同时利用上述抗体制备的CAR-T细胞对DLL3阳性的肿瘤细胞具有良好的杀伤活性，其能够应用于制备DLL3阳性肿瘤的免疫治疗药物。药物。药物。


技术研发人员：张衍 黄倩 孙彤林
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15