一种BstDNA聚合酶及表达基因、制备方法和应用与流程

一种bst dna聚合酶及表达基因、制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种bst dna聚合酶及表达基因、制备方法和应用。


背景技术：

2.核酸检测技术常用于检测传染病病原，其中，聚合酶链式反应(pcr)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，多用于生物、医学等相关领域。然而常规的pcr技术需要依赖于热循环扩增设备，因此，限定了其应用场景，不能很好地应对各种具有核酸检测需求的场所。为了克服pcr扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术，其与pcr技术相比较，不依赖于热循环扩增设备，且反应速度快、敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增、便捷检测及现场诊断。目前市面常见的恒温扩增技术有10余种，例如交叉扩增(cpa)、滚环扩增(rca)、解旋酶依赖的恒温扩增(hda)、链置换扩增(sda)、环介导恒温扩增(lamp)等。而采用上述恒温技术实现核酸扩增，都必须有聚合酶的参与。
3.目前，从嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)中分离出许多热稳定dna聚合酶(美国专利us9890385b2)，如bst dna聚合酶等。而bst dna聚合酶首先由stenesh和roe分离(stenesh and roe biochim.biophys.acta 272:156-6.(1972)，然后kaboev等人进一步纯化了bst dna聚合酶，测定其分子量为76kda，具有5
’‑3’
和3
’‑5’
外切酶活性，核酸外切酶与聚合酶的相对活性非常低。
4.进一步研究发现，bst dna聚合酶属于dna聚合酶家族a，与其已知的相对taq dna聚合酶具有大约45％的序列同一性。kong等人报道的bst dna聚合酶在60-70℃下具有最佳活性，但不能在pcr的高温下生存。全长bst dna聚合酶(fl bst dna聚合酶)为876个氨基酸残基，具有5
’‑3’
核酸内切酶活性，但不具有3
’‑5’
核酸外切酶活性。bst dna pola大片段(即bst dna聚合酶大片段，又称lf bst dna聚合酶)缺少5
’‑3’
核酸外切酶活性和3
’‑5’
核酸外切酶活性，并且只有587个氨基酸残基，其中289个氨基酸从n末端缺失。已经发现fl bst dna聚合酶和lf bst dna聚合酶可用于等温扩增技术、链置换扩增(sda)反应、dna测序等。
5.然而，现有的核酸扩增技术中采用的bst dna聚合酶，其活性会被样本中的杂质降低或抑制，导致等温扩增的灵敏度降低。因此，核酸扩增技术扩增前通常需要对样本进行核酸前处理，例如dna提取和纯化等，从而除去样本中抑制酶活性的物质或杂质。若要实现核酸的现场快速检测，则需要进一步提高核酸扩增-检测的核心蛋白(bst dna聚合酶)的性能。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提供了一种bst dna聚合酶，该bst dna聚合酶通过在10个位点具有特定的氨基酸，从而具有良好的抗抑制性，同时还具有优秀的dna聚合性能，有效解决现有技术中常用的bst dna聚合酶容易被抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致无法进
行扩增反应的技术问题，并且能够应用于核酸现场快速检测。
7.本发明提供了一种bst dna聚合酶，该bst dna聚合酶为bst dna聚合酶大片段，在以下10个位点具有如下氨基酸：第1位氨基酸为谷氨酸或丙氨酸，第3位氨基酸为谷氨酸或赖氨酸，第284位氨基酸为苯丙氨酸、精氨酸或赖氨酸，第305位氨基酸为赖氨酸或亮氨酸，第333位氨基酸为赖氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸，第334位氨基酸为谷氨酸或脯氨酸，第335位氨基酸为精氨酸，第390位氨基酸为苏氨酸，第480位氨基酸为赖氨酸或谷氨酸，第518位氨基酸为精氨酸或天冬氨酸。
8.可以理解的，上述第n位氨基酸(n为氨基酸的位数，例如第1位氨基酸)指的是野生型bst dna聚合酶大片段中对应的第n位氨基酸，但该氨基酸在上述bst dna聚合酶中的位数不做限定。
9.上述bst dna聚合酶具有良好的抗抑制性，无需对样本进行提取、纯化等预处理，即能直接与样本进行等温扩增等pcr反应。上述bst dna聚合酶具有良好的抗抑制性，同时还具有优秀的dna聚合性能，有效解决现有技术中常用的bst dna聚合酶容易被抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致无法进行扩增反应的技术问题，并且能够应用于核酸现场快速检测。
10.在其中一个实施例中，所述bst dna聚合酶大片段除所述10个位点以外的剩余氨基酸序列与野生型bst dna聚合酶大片段的氨基酸序列相同，所述野生型bst dna聚合酶大片段的氨基酸序列如seq id no:1所示。
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19.在其中一个实施例中，所述bst dna聚合酶大片段由所述野生型bst dna聚合酶大片段突变得到。
20.在其中一个实施例中，所述突变包括随机突变或饱和突变。
21.在其中一个实施例中，所述突变包括：第1位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸或丙氨酸，第3位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸或赖氨酸，第284位氨基酸由组氨酸突变为苯丙氨酸、精氨酸或赖氨酸，第305位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸或亮氨酸，第333位氨基酸由天冬酰胺突变为赖氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸，第334位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酸或脯氨酸，第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸，第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，第
480位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸或谷氨酸，第518位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸或天冬氨酸。
22.在其中一个实施例中，所述bst dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5，或seq id no:6所示。
23.eeeekplagmdfaiadsvtdemladkaalvvevvgdnyhhapivgialanergrfflrpetaladpkfla
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31.如seq id no:2所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列，通过野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸，第3位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，第284位氨基酸由组氨酸突变为苯丙氨酸，第305位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸，第333位氨基酸由天冬酰胺突变为赖氨酸，第334位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酸，第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸，第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，第480位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸，第518位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸。
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40.如seq id no:3所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列，通过野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸，第3位氨基酸
由甘氨酸突变为赖氨酸，第284位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，第305位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第333位氨基酸由天冬酰胺突变为谷氨酰胺，第334位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸，第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，第480位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸，第518位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸。
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42.awlgdetkkktmfdskraavalkwkgielrgvvfdlllaaylldpaqaagdvaavakmhqyeavrsd
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49.如seq id no:4所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列，通过野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸，第3位氨基酸由甘氨酸突变为赖氨酸，第284位氨基酸由组氨酸突变为赖氨酸，第305位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第333位氨基酸由天冬酰胺突变为甘氨酸，第334位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸，第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，第480位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸，第518位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸。
50.eekekplagmdfaiadsvtdemladkaalvvevvgdnyhhapivgialanergrfflrpetaladpkfl
51.awlgdetkkktmfdskraavalkwkgielrgvvfdlllaaylldpaqaagdvaavakmhqyeavrsd
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57.rnfnvrsfaertamntpiqgsaadiikkrmidlsvrlreerlqarlllqvhdelileapkeeierlcrlvpevmeqavtlrvplkvdyhygptwydak(seq id no:5)；
58.如seq id no:5所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列，通过野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，第3位氨基酸由甘氨酸突变为赖氨酸，第284位氨基酸由组氨酸突变为苯丙氨酸，第305位氨基酸由缬氨
酸突变为亮氨酸，第333位氨基酸由天冬酰胺突变为赖氨酸，第334位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸，第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，第480位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸，第518位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸。
59.aeeekplagmdfaiadsvtdemladkaalvvevvgdnyhhapivgialanergrfflrpetaladpkfl
60.awlgdetkkktmfdskraavalkwkgielrgvvfdlllaaylldpaqaagdvaavakmhqyeavrsd
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62.vdtkrleqmgaelteqlqaverriyelagqefninspkqlgtvlfdklqlpvlkktktgystsadvlekl
63.aphheivekilhyrqlgklqstyiegllklvhpvtgkvhtmfnqaltqtgrlssvepgernipirleegrki
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66.rnfnvrsfaertamntpiqgsaadiikkdmidlsvrlreerlqarlllqvhdelileapkeeierlcrlvpevmeqavtlrvplkvdyhygptwydak(seq id no:6)；
67.如seq id no:6所示的bstdna聚合酶的氨基酸序列，通过野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸，第3位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，第284位氨基酸由组氨酸突变为赖氨酸，第305位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第333位氨基酸由天冬酰胺突变为甘氨酸，第334位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酸，第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸，第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，第480位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸，第518位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸。
68.本发明还提供了一种编码所述bst dna聚合酶的表达基因。
69.在其中一个实施例中，所述表达基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。
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86.本发明还提供了一种表达载体，包括所述表达基因。
87.本发明还提供了一种重组细胞，包括所述表达载体。
88.本发明还提供了一种所述bst dna聚合酶的制备方法，包括以下步骤：将所述表达基因插入初始载体中，构建得到表达载体，将表达载体转入感受态的宿主细胞中，通过筛选得到阳性重组细胞，诱导表达，即得。
89.本发明还提供了一种用于核酸检测的试剂盒，包括：核糖核酸酶、探针、引物组、dntps、扩增缓冲液、逆转录酶和所述bst dna聚合酶。
90.本发明还提供了所述bst dna聚合酶在等温扩增中的应用。
91.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
92.本发明的一种bst dna聚合酶及表达基因、制备方法和应用，该bst dna聚合酶通过在10个位点具有特定的氨基酸，从而具有良好的抗抑制性，同时还具有优秀的dna聚合性能，有效解决现有技术中常用的bst dna聚合酶容易被抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致无法进行扩增反应的技术问题，并且能够应用于核酸现场快速检测。同时，该bst dna聚合酶还可以搭配lamp、near、rpa等多种恒温扩增方法使用，可对现场采集的样本直接进行检测，无需进行如核酸提取等样本的前处理操作。通过该bst dna聚合酶，能够将简单的样本处理法与等温扩增技术实现联用，真正缩短检测周期，发挥出等温扩增快速、灵敏、便捷的特点。
附图说明
93.图1为实施例中无鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))的实时荧光结果图；
94.图2为实施例中无鼻拭子有模板对照组(rtase(w)+bst(w))的实时荧光结果图；
95.图3为实施例中无鼻拭子无模板对照组1(rtase(w)+bst(m)阴性对照)的实时荧光结果图；
96.图4为实施例中无鼻拭子无模板对照组2(rtase(w)+bst(w)阴性对照)的实时荧光结果图；
97.图5为实施例中有鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))的实时荧光结果图；
98.图6为实施例中有鼻拭子有模板对照组(rtase(w)+bst(w))的实时荧光结果图；
99.图7为实施例中有鼻拭子无模板对照组1(rtase(w)+bst(m)阴性对照)的实时荧光结果图；
100.图8为实施例中有鼻拭子无模板对照组2(rtase(w)+bst(w)阴性对照)的实时荧光结果图；
101.图9为对比例中bst dna聚合酶其他突变的对照蛋白1和rtase野生型(rtase(w)+bst(对照蛋白1))的实时荧光结果图；
102.图10为对比例中bst dna聚合酶其他突变的对照蛋白2和rtase野生型(rtase(w)+bst(对照蛋白2))的实时荧光结果图。
具体实施方式
103.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
104.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
105.来源：
106.以下实施例、对比例所用的试剂或材料均为市售或自制；鼻拭子耗材购自江苏涵恒医疗科技有限公司，a-0116；释放剂为自行配置(核酸释放剂包括tris-hcl(ph 8.8)、nacl和nf水，tris-hcl(ph 8.8)的浓度为10mm，nacl的浓度为50mm)；sars-cov-2假病毒购自湖南丰晖生物科技有限公司。
107.本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
108.本发明人在实践中发现部分bst dna聚合酶具有良好的抗抑制性，并通过扩增实验证实上述如seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示的bst dna聚合酶均成功扩增绝大多数样本。其中，如seq id no:2所示的bst dna聚合酶具有非常优异的效果，以下以该seq id no:2所示的bst dna聚合酶进行性能验证实验。
109.实施例
110.一种用于核酸检测的试剂盒。
111.采用该试剂盒对sars-cov-2进行实时荧光检测。
112.一、测试材料准备。
113.1、本实施例所用的sars-cov-2反应体系包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、
rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(野生型w/突变体m)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和sars-cov-2假病毒。
114.其中，本实施例采用的等温扩增缓冲液(rham buffer)包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、tween 20、mgso4；rtase(野生型w)的氨基酸序列如seq id no:8所示，以下简称为rtase(w)；bst dna聚合酶(野生型w)的氨基酸序列如seq id no:1所示，以下简称为bst(w)；bst dna聚合酶(突变体m)的氨基酸序列如seq id no:2所示，以下简称为bst(m)。
115.tlniedehrlhetskepdvslgstwlsdfpqawaetggmglavrqapliiplkatstpvsikqypmsqearlgikphiqrlldqgilvpcqspwntpllpvkkpgtndyrpvqdlrevnkrvedihptvpnpynllsglppshqwytvldlkdaffclrlhptsqplfafewrdpemgisgqltwtrlpqgfknsptlfdealhrdladfriqhpdlillqyvddlllaatseldcqqgtrallqtlgnlgyrasakkaqicqkqvkylgyllkegqrwltearketvmgqptpktprqlreflgtagfcrlwipgfaemaaplypltktgtlfnwgpdqqkayqeikqalltapalglpdltkpfelfvdekqgyakgvltqklgpwrrpvaylskkldpvaagwppclrmvaaiavltkdagkltmgqplvilaphavealvkqppdrwlsnarmthyqallldtdrvqfgpvvalnpatllplpeeglqhncldilaeahgtrpdltdqplpdadhtwytdgssllqegqrkagaavtteteviwakalpagtsaqraelialtqalkmaegkklnvytdsryafatahihgeiyrrrglltsegkeiknkdeilallkalflpkrlsiihcpghqkghsaeargnrmadqaarkaaitetpdtstll(seq id no:8)。
116.本实施例采用的bst dna聚合酶(突变体m)通过上述bst dna聚合酶(野生型w)的氨基酸序列在第1个氨基酸、第3个氨基酸、第284个氨基酸、第305个氨基酸、第333个氨基酸、第334个氨基酸、第335个氨基酸、第390个氨基酸、第480个氨基酸、第518个氨基酸位点进行突变后经密码子优化得到。
117.本实施例采用的rtase(w)、bst(m)和bst(w)的制备方法为：采用seq id no:7所示的表达基因构建表达载体(即重组载体)，然后将表达载体转入感受态的宿主细胞获得重组细胞的克隆菌株；最后依次经诱导培养、破碎、纯化后获得对应的酶。
118.其中，本实施例所用的单链探针probe从5’到3’的顺序的核苷酸序列为agcgctgggggcaaattgtgcaatt(seq id no:9)，下划线标记的碱基表示被修饰，其中探针sars-cov-2-probe的5’末端修饰淬灭基团，由5’至3’的第7位的g、第13位的a、第20位的g为rna碱基，3’末端修饰报告荧光基团与c3 spacer。
119.本实施例所用的引物组合primers mix为sars-cov-2实时荧光检测的引物，其核苷酸序列如下表所示。
120.表1 sars-cov-2实时荧光检测的测试引物
121.122.2、测试分组。
123.待测样本分为八组，下述模板即指sars-cov-2假病毒，8组分别为：
124.(1)无鼻拭子有模板实验组、无鼻拭子有模板对照组、无鼻拭子无模板对照组1、无鼻拭子无模板对照组2。
125.无鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(突变体m)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其包括sars-cov-2假病毒和释放剂)。
126.无鼻拭子有模板对照组(rtase(w)+bst(w))包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(野生型w)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其包括sars-cov-2假病毒和释放剂)。
127.无鼻拭子无模板对照组1(rtase(w)+bst(m)阴性对照)包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(突变体m)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其只含有释放剂)。
128.无鼻拭子无模板对照组2(rtase(w)+bst(w)阴性对照)包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(野生型w)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其只含有释放剂)。
129.(2)有鼻拭子有模板实验组、有鼻拭子有模板对照组、有鼻拭子无模板对照组1、有鼻拭子无模板对照组2。
130.有鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(突变体m)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其包括鼻拭子、sars-cov-2假病毒和释放剂)。
131.有鼻拭子有模板对照组(rtase(w)+bst(w))包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(野生型w)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其包括鼻拭子、sars-cov-2假病毒和释放剂)。
132.有鼻拭子无模板对照组1(rtase(w)+bst(m)阴性对照)包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(突变体m)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其只含有鼻拭子和释放剂)。
133.有鼻拭子无模板对照组2(rtase(w)+bst(w)阴性对照)包括：等温扩增缓冲液(rham buffer)、rtase(野生型w)、bst dna聚合酶(野生型w)、核糖核酸酶抑制剂rnasin、rnasehii、单链探针probe、引物组合primers和样本(其只含有鼻拭子和释放剂)。
134.二、测试步骤。
135.1、无鼻拭子的测试组步骤包括：
136.(1)无鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))测试步骤包括：取7ml的1
×
释放剂，记为a液。向a液中加入26μl假病毒(终浓度约为371copies/ml)，记为b液。其次取6240μl的b液加入9360μl的1
×
释放剂01中(终浓度约为148copies/ml，即按照反应液中模板(sars-cov-2假病毒):总体积＝10:25配制)，记为样本。按照该方法共制备八个样本。
137.将上述样本按照下表的配置反应体系混匀后进行等温扩增反应。
138.等温扩增反应条件：65℃，30min(每隔1min收集荧光)，结果如图1所示。
139.(2)无鼻拭子有模板对照组(rtase(w)+bst(w))测试步骤与上述无鼻拭子有模板实验组相似，区别在于将bst dna聚合酶(野生型w)替换上述的bst dna聚合酶(突变体m)，其余步骤和体系参数与无鼻拭子有模板实验组一致，结果如图2所示。
140.(3)无鼻拭子无模板对照组1(rtase(w)+bst(m)阴性对照)测试步骤与上述无鼻拭子有模板实验组相似，区别在于样本中不添加sars-cov-2假病毒，其余步骤和体系参数与无鼻拭子有模板实验组一致，结果如图3所示。
141.(4)无鼻拭子无模板对照组2(rtase(w)+bst(w)阴性对照)测试步骤与上述无鼻拭子有模板对照组相似，区别在于样本中不添加sars-cov-2假病毒，其余步骤和体系参数与无鼻拭子有模板对照组一致，结果如图4所示。
142.表2等温扩增反应配置反应体系
143.组分用量rham buffer2.5μlrtase(野生型w)200u/μl0.5μlbst dna聚合酶(突变体m)8u/μl1μl核糖核酸酶抑制剂rnasin 40u/μl0.5μlrnasehii 5u/μl0.2μl单链探针probe 10pm0.5μl引物组合primers mix1.6μl样本10μl/0μltotal25μl
144.2、有鼻拭子的测试组步骤包括：
145.(1)有鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))测试步骤包括：分别采集20个人鼻拭子(1人1拭子)后，放入2ml的ep管中。随后将这20个样本放进14ml的1
×
释放剂01中，记为a液。接着，取7ml的a液，向该a液中加入26μl的假病毒(终浓度约为371copies/ml)，记为b液。最后，取6240μl的b液加入9360μl的1
×
释放剂01中(终浓度约为148copies/ml，即按照反应液中模板(sars-cov-2假病毒)：总体积＝10：25配制)，记为样本。按照该方法共制备八个样本。
146.将上述样本按照上表的配置反应体系混匀后进行等温扩增反应。
147.等温扩增反应条件：65℃，30min(每隔1min收集荧光)，结果如图5所示。
148.(2)有鼻拭子有模板对照组(rtase(w)+bst(w))测试步骤与上述有鼻拭子有模板实验组相似，区别在于将bst dna聚合酶(野生型w)替换上述的bst dna聚合酶(突变体m)，其余步骤和体系参数与有鼻拭子有模板实验组一致，结果如图6所示。
149.(3)有鼻拭子无模板对照组1(rtase(w)+bst(m)阴性对照)测试步骤与上述有鼻拭子有模板实验组相似，区别在于样本中不添加sars-cov-2假病毒，其余步骤和体系参数与有鼻拭子有模板实验组一致，结果如图7所示。
150.(4)有鼻拭子无模板对照组2(rtase(w)+bst(w)阴性对照)测试步骤与上述有鼻拭子有模板对照组相似，区别在于样本中不添加sars-cov-2假病毒，其余步骤和体系参数与有鼻拭子有模板对照组一致，结果如图8所示。
151.3、结果分析。
152.由上述结果可知，图3、图4、图7、图8为不添加模板(sars-cov-2假病毒)的阴性对照结果，无扩增曲线的出现，符合测试预期；图1和图2为检测8个样本的采用bst dna聚合酶(野生型w/突变体m)检测纯模板的结果，两种bst dna聚合酶均能在无鼻拭子环境下对模板进行扩增；图5和图6分别为检测8个样本的采用bst dna聚合酶(野生型w/突变体m)检测有鼻拭子环境的模板的结果，图6为野生型bst dna聚合酶在鼻拭子环境下的扩增模板的实验结果，8个样本中有3个样本可收集荧光信号，从3个样本的信号绘制的扩增曲线图像可知，其中1条扩增曲线形状呈现类s型对数曲线，另外2条扩增曲线形状为斜线，没有呈现单一的对数增长的s型曲线，也没有出现明显的平台期，说明野生型bst酶在鼻拭子环境下反应质量不好。
153.图5为本发明bst dna聚合酶突变体m在鼻拭子环境下的扩增模板的实验结果，8个样本中有7个样本可收集荧光信号，从7个样本的信号绘制的扩增曲线图像可知，7条扩增曲线形状呈现类s型对数曲线，其中，7条的扩增曲线的平台期高度较高，1条较低，说明bst dna聚合酶突变体m在鼻拭子环境下反应质量较好，具有优秀的抗干扰的能力。
154.对比例
155.本对比例与上述实施例中的有鼻拭子有模板实验组(rtase(w)+bst(m))相似，区别在于将bst dna聚合酶(突变体m)替换为bst的对照蛋白1和2。上述对照蛋白1的氨基酸序列如seq id no:16所示，该对照蛋白1为在野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸、第3位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸、第284位氨基酸由组氨酸突变为苯丙氨酸、第305位氨基酸由缬氨酸突变为色氨酸、第333位氨基酸由天冬酰胺突变为谷氨酰胺、第334位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸、第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸、第390位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸、第480位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸、第518位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸。
156.eeeekplagmdfaiadsvtdemladkaalvvevvgdnyhhapivgialanergrfflrpetaladpkfla
157.wlgdetkkktmfdskraavalkwkgielrgvvfdlllaaylldpaqaagdvaavakmhqyeavrsdea
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163.nfnvrsfaertamntpiqgsaadiikkfmidlsvrlreerlqarlllqvhdelileapkeeierlcrlvpevmeqavtlrvplkvdyhygptwydak(seq id no:16)。
164.编辑对照蛋白1的表达基因的核苷酸序列如seq id no:17所示。
165.gaagaagaagaaaaaccgctggcgggcatggattttgcgattgcggatagcgtgaccgatgaaatgct
ggcggataaagcggcgctggtggtggaagtggtgggc
166.gataactatcatcatgcgccgattgtgggcattgcgctggcgaacgaacgcggccgcttttttctgcgcccggaaaccgcgctggcggatccgaaatttctggcgtgg
167.ctgggcgatgaaaccaaaaaaaaaaccatgtttgatagcaaacgcgcggcggtggcgctgaaatggaaaggcattgaactgcgcggcgtggtgtttgatctgctgct
168.ggcggcgtatctgctggatccggcgcaggcggcgggcgatgtggcggcggtggcgaaaatgcatcagtatgaagcggtgcgcagcgatgaagcggtgtatggc
169.aaaggcgcgaaacgcaccgtgccggatgaaccgaccctggcggaacatctggtgcgcaaagcggcggcgatttgggcgctggaagaaccgctgatggatgaac
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171.tggaacagatgggcgcggaactgaccgaacagctgcaggcggtggaacgccgcatttatgaactggcgggccaggaatttaacattaacagcccgaaacagctgg
172.gcaccgtgctgtttgataaactgcagctgccggtgctgaaaaaaaccaaaaccggctatagcaccagcgcggatgtgctggaaaaactggcgccgcatcatgaaatt
173.gtggaatttattctgcattatcgccagctgggcaaactgcagagcacctatattgaaggcctgctgaaatgggtgcatccggtgaccggcaaagtgcataccatgtttaa
174.ccaggcgctgacccagaccggccgcctgagcagcgtggaaccgcaggcgcgcaacattccgattcgcctggaagaaggccgcaaaattcgccaggcgtttgtgc
175.cgagcgaaccggattggctgatttttgcggcggattatagccagattgaactgcgcgtgctggcgcatattgcggaagatgataacctgattgaagcgtttcgccgcg
176.gcattgatattcataccaaaaccgcgatggatatttttcatgtgagcgaagaagatgtgaccgcgaacatgcgccgccaggcgaaagcggtgaactttggcattgtgta
177.tggcattagcgattatggcctggcgcagaacctgaacattacccgcaaagaagcggcggaatttattgaacgctattttgcgagctttccgggcgtgaaacagtatatg
178.gataacattgtgcaggaagcgaaacagaaaggctatgtgaccaccctgctgcataaacgccgctatctgccggatattaccagccgcaactttaacgtgcgcagcttt
179.gcggaacgcaccgcgatgaacaccccgattcagggcagcgcggcggatattattaaaaaattcatgattgatctgagcgtgcgcctgcgcgaagaacgcctgcagg
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181.上述对照蛋白2的氨基酸序列如seq id no:18所示，该对照蛋白2为在野生型bst dna聚合酶大片段进行以下10个位点的突变得到：第1位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸、第3位氨基酸由甘氨酸突变为苏氨酸、第284位氨基酸由组氨酸突变为苯丙氨酸、第305位氨基酸由缬氨酸突变为色氨酸、第333位氨基酸由天冬酰胺突变为赖氨酸、第334位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酸、第335位氨基酸由谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第390位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸、第480位氨基酸由精氨酸突变为组氨酸、第518位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸。
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183.wlgdetkkktmfdskraavalkwkgielrgvvfdlllaaylldpaqaagdvaavakmhqyeavrsdea
184.vygkgakrtvpdeptlaehlvrkaaaiwaleeplmdelrrneqdrllteleqplagilanmeftgvkvd
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189.nfnvrsfaertamntpiqgsaadiikkvmidlsvrlreerlqarlllqvhdelileapkeeierlcrlvpevmeqavtlrvplkvdyhygptwydak(seq id no:18)。
190.编辑对照蛋白2的表达基因的核苷酸序列如seq id no:19所示。
191.gaagaaaccgaaaaaccgctggcgggcatggattttgcgattgcggatagcgtgaccgatgaaatgctggcggataaagcggcgctggtggtggaagtggtgggc
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204.ggataacattgtgcaggaagcgaaacagaaaggctatgtgaccaccctgctgcatcatcgccgctatctgccggatattaccagccgcaactttaacgtgcgcagcttt
205.gcggaacgcaccgcgatgaacaccccgattcagggcagcgcggcggatattattaaaaaagtgatgattgatctgagcgtgcgcctgcgcgaagaacgcctgcag
206.gcgcgcctgctgctgcaggtgcatgatgaactgattctggaagcgccgaaagaagaaattgaacgcctgtgccgcctggtgccggaagtgatggaacaggcggtgaccctgcgcgtgccgctgaaagtggattatcattatggcccgacctggtatgatgcgaaataa(seq id no:19)。
207.结果分析：对照蛋白1和2的荧光图为在鼻拭子环境下的扩增模板的实验结果(图9和图10)，对照蛋白1和2的结果显示，8个样本中有3个样本可收集荧光信号，从3个样本的信号绘制的扩增曲线图像可知，3条扩增曲线形状为斜线，没有呈现单一的对数增长的s型曲线，也没有出现明显的平台期，说明野生型bst dna聚合酶在鼻拭子环境下反应质量不好，野生型bst dna聚合酶的抗干扰能力差。
208.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
209.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种bst dna聚合酶，其特征在于，该bst dna聚合酶为bst dna聚合酶大片段，在以下10个位点具有如下氨基酸：第1位氨基酸为谷氨酸或丙氨酸，第3位氨基酸为谷氨酸或赖氨酸，第284位氨基酸为苯丙氨酸、精氨酸或赖氨酸，第305位氨基酸为赖氨酸或亮氨酸，第333位氨基酸为赖氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸，第334位氨基酸为谷氨酸或脯氨酸，第335位氨基酸为精氨酸，第390位氨基酸为苏氨酸，第480位氨基酸为赖氨酸或谷氨酸，第518位氨基酸为精氨酸或天冬氨酸。2.根据权利要求1所述的bst dna聚合酶，其特征在于，所述bst dna聚合酶大片段除所述10个位点以外的剩余氨基酸序列与野生型bst dna聚合酶大片段的氨基酸序列相同，所述野生型bst dna聚合酶大片段的氨基酸序列如seq id no:1所示。3.根据权利要求2所述的bst dna聚合酶，其特征在于，所述bst dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5，或seq id no:6所示。4.一种编码权利要求1-3中任一项所述bst dna聚合酶的表达基因。5.根据权利要求4所述的bst dna聚合酶的表达基因，其特征在于，所述表达基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。6.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求4-5中任一项所述的表达基因。7.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求6所述的表达载体。8.一种权利要求1-3中任一项所述的bst dna聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4-5中任一项所述表达基因插入初始载体中，构建得到表达载体，将表达载体转入感受态的宿主细胞中，通过筛选得到阳性重组细胞，诱导表达，即得。9.一种用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括：核糖核酸酶、探针、引物组、dntps、扩增缓冲液、逆转录酶和权利要求1-3中任一项所述的bst dna聚合酶。10.权利要求1-3中任一项所述的bst dna聚合酶在等温扩增中的应用。

技术总结
本发明涉及一种Bst DNA聚合酶及表达基因、制备方法和应用，涉及核酸检测技术领域。该Bst DNA聚合酶通过在10个位点具有特定的氨基酸，从而具有良好的抗抑制性，同时还具有优秀的DNA聚合性能，有效解决现有技术中常用的Bst DNA聚合酶容易被抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致无法进行扩增反应的技术问题，并且能够应用于核酸现场快速检测。够应用于核酸现场快速检测。


技术研发人员：季宇 赖钦科 陈翀
受保护的技术使用者：广州普世君安生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/10/15