一种基于DNA机械臂的电化学传感器及其制备方法和应用

一种基于dna机械臂的电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物领域，具体涉及一种基于dna机械臂的电化学传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.新冠病毒为单链rna病毒，其基因组突变较为频繁，仅针对单一靶标检测容易出现因突变以及交叉反应引起的漏检和检测误差等问题，在临床实际的应用中存在着一定的局限性。
3.为解决上述问题，学者们设计了多靶标检测的电化学传感器，通过各靶标检测结果相互验证，提高检测的准确性。如fu等人(参考文献：sensors andactuators b:chemical,2020,305:127545.)通过在电极界面上修饰两种不同的捕获探针，并基于催化发卡组装反应实现了两个靶标的同时检测。然而，两种不同的捕获探针很难均匀的排列在电极界面上，容易出现一个捕获探针在界面上的组装密度很高而另一个很低的现象，这种不均匀性容易导致较高的测量误差和较低的重复性。deng等人(参考文献：analysis.anal chem.2023feb14；95(6):3358-3362)设计了双靶标触发的滚环扩增放大策略用于新冠病毒的灵敏检测，只有当两个靶标共存时，才能触发滚环扩增反应，并产生大量的g4重复序列，这些序列在hemin孵育后转换为具有氧化还原活性的g4/hemin复合物，从而催化tmb/h2o2底物产生显著的电流，实现新冠病毒的灵敏检测。但是该方法只有双靶标同时存在时才能实现检测，无法对每个靶标进行单独的定量。此外，以上电化学方法大多依靠核酸靶循环技术进行信号放大，操作过程复杂，反应时间长。并且，靶循环策略不仅需要对两个靶标进行信号放大，而且还要避免序列之间的互相干扰和影响，这极大地增加了序列设计的复杂性。
4.因此，开发一种能够实现简单、快速、准确、有效的新冠病毒双靶标检测的电化学传感器用于新冠病毒的筛查具有重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于dna机械臂的电化学传感器及其制备方法和应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种dna机械臂(dnarobotarms，dra)，其是由三条部分互补的单链dna探针cp1、cp2和ap按照1：1：1的摩尔比基于watson-crick碱基互补配对原则杂交形成；其中，cp1探针和cp2探针为手臂链，ap探针作为中间链跨在两条手臂链上，以共同维持t型dna支架结构；cp1探针、cp2探针的未配对碱基延伸于t型dna支架以外，作为dra的两个功能臂用于特异性捕获靶标序列。
7.上述一种dra在构建电化学生物传感器中的应用，所述dna机械臂能够提高cp1探针、cp2探针在电化学生物传感器工作电极界面组装的均一性。
8.一种基于上述的dra的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器包括1-己硫醇
修饰金电极、ag/agcl电极、铂丝电极、电化学检测液、cp1探针、cp2探针、ap探针、sp1探针和sp2探针；所述电化学检测液为含有[fe(cn)6]
3-的pbs缓冲液；所述cp1探针序列为：5'-cholesteryl-teg-gagtctgagctgttactgcactaccgggcctggcgtggtttgt-3'；所述cp2探针序列为：5'-ttagcaggattgcggcgtcattaggcagtaacagctcagactc-3'；所述ap探针序列为：5'-cccggtagtgttcctaatgacg-3'；所述sp1探针序列为：5'-caacaggaactccac-mb-3'；所述sp2探针序列为：5'-gccaatgtgatcttt-fc-3'。
[0009]
上述一种基于dra的电化学生物传感器的构建方法，步骤如下：1)用氧化铝粉抛光裸金电极，依次在无水乙醇和去离子水中超声清洗，氮气吹干，之后将电极置于0.5m硫酸溶液中以0.1v/s的扫描速率在-0.35～+1.5v电位间进行循环伏安扫描以清洗电极，至循环伏安曲线稳定，然后将电极取出用超纯水冲洗干净，氮气吹干，得到预处理后的金电极；2)使用dna固定缓冲液配制含等摩尔量的cp1探针、cp2探针、ap探针的溶液，于95℃孵育5min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到dra溶液；使用dna固定缓冲液配制含信号探针sp1的溶液，于95℃孵育5min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到退火后的sp1溶液；使用dna固定缓冲液配制含信号探针sp2探针的溶液，于95℃孵育5min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到退火后的sp2溶液；使用depc水配制含待测靶标的溶液；3)将预处理后的金电极浸泡在1-己硫醇(ht)溶液中，室温孵育1h，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到ht修饰金电极；在ht修饰金电极上滴加4μl dra溶液，室温孵育1h，而后超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到dra修饰金电极；在dra修饰金电极上滴加4μl退火后的sp1溶液、4μl退火后的sp2溶液、4μl靶标溶液，室温孵育30min，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到工作电极；4)将工作电极与ag/agcl电极、铂丝电极构成三电极体系，置于电化学检测液中，用方波伏安法扫描；其中，所述dna固定缓冲液的配方为：10mm tris，1mm edta
·
2na
·
2h2o，50mm nacl，1mm mgcl2，ph 8.0；所述depc水为经焦碳酸二乙酯除核酸酶处理的水；其中，所述dra溶液的浓度为2μmol/l；其中，所述退火后的sp1溶液的浓度为4μmol/l；其中，所述退火后的sp2溶液的浓度为2μmol/l；上述一种基于dra的电化学生物传感器在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
[0010]
本发明的检测原理为：首先，ht通过au-s键固定于金电极界面，形成了紧密的ht组装层，阻碍fe(cn)
63-与电极界面之间的电子传递，保证了fe(cn)
63-介导的电催化反应顺利进行。其次，将cp1、cp2以及ap预先杂交形成dna机械臂，并通过cp1末端修饰的胆固醇与ht的疏水作用固定在金电极上(图1a)。当靶标t1、t2都不存在时，修饰有亚甲基蓝(mb)的sp1和修饰有二茂铁(fc)的sp2均无法被界面上的dra捕获，几乎不产生mb和fc的信号(图1b)。当t1存在时，sp1通过碱
基互补配对原则与t1杂交形成t1-sp1复合物。接着，t1-sp1复合物中t1剩余的序列被dra的其中一个臂(cp1)特异性捕获到电极界面上，最后，在电压驱动和fe(cn)
63-的介导下，mb产生显著的电催化电流信号响应。此时，由于溶液中不存在t2，因此，sp2不能被dra特异性捕获，几乎不产生fc的电化学信号(图1c)。同理，当只有t2存在时，sp2被dra的另一个臂(cp2)捕获到电极界面上，只产生fc的催化信号(图1d)。而当t1，t2同时存在时，sp1、sp2分别被捕获到电极界面上，此时可以同时检测到mb和fc的催化电流(图1e)，根据mb、fc催化电流的变化实现靶标t1、t2的同时检测。
[0011]
本发明的显著优点在于：(1)dra的引入可有效提高两种捕获探针在电极界面组装的均一性；(2)既可以对两个不同的靶标分别进行检测，也可以同时检测两个不同的靶标；(3)采用[fe(cn)6]
3-介导的电催化反应放大亚甲基蓝和二茂铁的信号响应，可实现双靶标灵敏的无扩增检测；(4)操作步骤简单，只需30min即可实现对靶标序列的检测，且具有较高的灵敏度，检测限低。
附图说明
[0012]
图1：基于dra的电化学生物传感器的示意图。(a)dra在电极界面上的组装；(b)t1、t2均不存在时，dra无法捕获sp1、sp2；(c)单独检测t1；(d)单独检测t2；(e)同时检测t1、t2。
[0013]
图2：基于dra的电化学生物传感器单独检测t1，检测体系中t1浓度分别为1pm、100pm、10nm。
[0014]
图3：基于dra的电化学生物传感器单独检测t2，检测体系中t2浓度分别为1pm、100pm、10nm。
[0015]
图4：基于dra的电化学生物传感器同时检测t1、t2，检测体系中t1和t2浓度均为1pm、100pm、10nm。
[0016]
图5：基于dra的电化学生物传感器的灵敏度。(a)不同浓度t1的swv曲线，t1的浓度从a到f分别为：102fm、103fm、104fm、105fm、106fm、107fm；(b)t1浓度的对数值与峰电流变化值(δi)的标准曲线(n＝3)；(c)不同浓度t2的swv曲线，t2的浓度从a到f分别为：102fm、103fm、104fm、105fm、106fm、107fm；(d)t2浓度的对数值与峰电流变化值(δi)的标准曲线(n＝3)。
[0017]
图6：基于dra的电化学生物传感器的特异性。
[0018]
图7：基于dra的电化学生物传感器的重现性。
具体实施方式
[0019]
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0020]
下述实施例中，dna固定缓冲液配方为：10mm tris，1mm edta
·
2na
·
2h2o，50mmnacl，1mm mgcl2；ph 8.00。
[0021]
下述实施例中中，含10mm[fe(cn)6]
3-的pbs缓冲液的配方为：10mm k3[fe(cn)6]，8mm na2hpo4，136mm nacl，2mm kh2po4，2.6mm kcl。
[0022]
下述实施例中，所涉及的核酸序列如表1所示：表1表1实施例1一种基于dra的电化学生物传感器的制备及其可行性验证，具体步骤如下：(1)依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉抛光直径为2mm的裸金电极，再依次在无水乙醇和去离子水中超声清洗3min，氮气吹干，之后将电极置于硫酸溶液(0.5m)中以0.1v/s的扫描速率在-0.35～+1.5v电位间进行循环伏安扫描以清洗电极，至循环伏安曲线稳定，然后将电极取出用超纯水冲洗干净，氮气吹干，得到预处理后的金电极。
[0023]
(2)使用dna固定缓冲液配制含cp1探针(2μm)、cp2探针(2μm)、ap探针(2μm)的溶液，于95℃金属浴中孵育5min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到dra溶液。使用dna固定缓冲液配制含sp1探针的溶液，于95℃金属浴中孵育5min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到退火后的sp1溶液。使用dna固定缓冲液配制含sp2探针的溶液，于95℃金属浴中孵育5min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到退火后的sp2溶液。使用depc水配制含靶标t1的溶液，得到t1溶液。使用depc水配制含靶标t2的溶液，得到t2溶液。使用depc水配制含靶标t1和t2的溶液，得到混合靶标溶液。
[0024]
(3)将预处理后的金电极浸泡在ht溶液(5mm)中，室温孵育1h以在电极表面覆盖一层紧密的烷基组装层，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到ht修饰金电极。在ht修饰金电极上滴加4μldra溶液(2μm)，室温孵育1h，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到dra修饰金电极。在dra修饰金电极上滴加4μl退火后的sp1溶液(4μm)、4μl退火后的sp2溶液(2μm)、4μl靶标溶液(所述靶标溶液为t1溶液、t2溶液或混合靶标溶液)，室温孵育30min，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到工作电极。
[0025]
(4)将工作电极与参比电极ag/agcl电极(3m kcl)、对电极铂丝电极构成三电极体系，以含10mm[fe(cn)6]
3-的pbs缓冲液作为电化学检测液，使用chi 660e电化学工作站进行方波伏安扫描(swv)。swv扫描的参数为：电压范围为-0.5～+0.1v，电压增幅为0.004v，振幅为0.025v，频率为50hz，静置时间2s。
[0026]
结果如图2至图4所示。当检测体系中仅存在靶标t1时，随着检测体系中t1浓度的增加，mb峰电流信号逐渐增加，而fc峰电流信号几乎不变，这是由于t1被电极界面的dra捕获，从而将sp1探针引入电极界面，因此mb峰电流信号随着t1浓度的增加而增加；又由于靶标t2不存在，导致sp2探针无法被dra捕获，因此，fc峰电流信号几乎不变。当检测体系中仅存在靶标t2时，fc峰电流信号随着检测体系种t2浓度的增加而增加，而mb峰电流信号几乎不变，这是因为dra捕获了t2-sp2复合物，从而产生fc峰电流信号变化。当靶标t1、t2同时存在时，随着检测体系中t1和t2浓度的增加，mb峰和fc峰电化学信号逐渐增大。以上结果表明，本发明提供的基于dra的电化学传感器既可用于单靶标分别检测，又可用于双靶标同时检测。
[0027]
实施例2采用swv法考察基于dra的电化学生物传感器的检测准确度，步骤如下：(1)同实施例1步骤(1)。
[0028]
(2)同实施例1步骤(2)。
[0029]
(3)dra修饰金电极的制备与实施例1相同。在dra修饰金电极上滴加4μl退火后的sp1溶液(4μm)、4μl退火后的sp2溶液(2μm)、4μl混合靶标溶液，室温孵育30min，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到工作电极。
[0030]
(4)同实施例1步骤(4)。
[0031]
如图5所示，mb峰和fc峰电流信号随着检测体系中靶标t1、t2浓度的增加而增加。在检测体系中靶标为100fm～10nm浓度范围内，电流信号δi分别与靶标t1和t2浓度的对数呈现良好的线性关系，回归方程分别为δi
mb
＝0.6747(logc
t1
)-0.2140、相关系数r＝0.9944，δi
fc
＝1.599(logc
t2
)+0.2199、相关系数r＝0.9993。依据3σ规则计算该方法的lod分别为0.80fm(t1)和3.55fm(t2)。
[0032]
实施例3采用swv法考察基于dna机械臂的电化学传感器的特异性，步骤如下：(1)同实施例1步骤(1)。
[0033]
(2)dra溶液、退火后的sp1溶液、退火后的sp2溶液的配制与实施例1相同。使用depc水配制含靶标t1(1nm)和t2(1nm)的溶液，得到混合靶标溶液。用depc水配制含干扰序列(1nm)的溶液，所述干扰序列为v.vulnificus、e.colio157：h7、mers-cov或influenzaa基因组片段。
[0034]
(3)dra修饰金电极的制备与实施例1相同。在dra修饰金电极上滴加4μl退火后的sp1溶液(4μm)、4μl退火后的sp2溶液(2μm)、4μl混合靶标溶液或干扰序列溶液，室温孵育30min，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到工作电极。
[0035]
(4)同实施例1步骤(4)。
[0036]
如图6所示，t1和t2产生的电流变化值(δi)至少比其他干扰序列大10倍。该结果表明该电化学方法对t1和t2具有较好的特异识别能力。
[0037]
接着，通过计算5次实验的rsd考察了传感器的重现性。结果如图7所示，1pm的t1和t2的rsd分别为3.91％和3.86％，1nm的t1和t2的rsd分别为3.11％和1.81％，表明该传感器具有较好的重现性。
[0038]
实施例4采用swv法考察基于dra的电化学传感器的临床价值，步骤如下：(1)同实施例1步骤(1)。
[0039]
(2)dra溶液、退火后的sp1溶液、退火后的sp2溶液的配制与实施例1相同。将靶标t1和t2溶解于pbs稀释的健康人群唾液样本中，得到待测溶液。
[0040]
(3)dra修饰金电极的制备与实施例1相同。在dra修饰金电极上滴加4μl退火后的sp1溶液(4μm)、4μl退火后的sp2溶液(2μm)、4μl待测溶液，室温孵育30min，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到工作电极。
[0041]
(4)同实施例1步骤(4)。
[0042]
根据δi与logc之间的线性关系进行定量，并计算回收率。如表2和表3所示，100fm、10pm和1nm的t1回收率在96.35％～105.10％之间，rsd分别为4.13％、2.92％、1.98％。此外，100fm、10pm和1nm的t2回收率在96.00％～106.00％之间，rsd分别为1.94％、4.24％、4.97％。结果表明该传感器有望用于新冠病毒的临床实际样本检测中。
[0043]
表2t1在唾液样本中的回收率测定表2t1在唾液样本中的回收率测定表3 t2在唾液样本中的回收率测定
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种dna机械臂，其特征在于：由三条部分互补的单链dna探针cp1、cp2和ap按照1：1：1的摩尔比基于watson-crick碱基互补配对原则杂交形成；其中，cp1探针和cp2探针为手臂链，ap探针作为中间链跨在两条手臂链上，以共同维持t型dna支架结构；cp1探针、cp2探针的未配对碱基延伸于t型dna支架以外，作为dna机械臂的两个功能臂用于特异性捕获靶标序列。2.如权利要求1所述的dna机械臂在构建电化学生物传感器中的应用，其特征在于：所述dna机械臂能够提高cp1探针、cp2探针在电化学生物传感器工作电极界面组装的均一性。3.一种基于权利要求1所述的dna机械臂的电化学生物传感器，其特征在于：所述电化学生物传感器包括1-己硫醇修饰金电极、ag/agcl电极、铂丝电极、电化学检测液、cp1探针、cp2探针、ap探针、sp1探针和sp2探针；所述电化学检测液为含有[fe(cn)6]3‒
的pbs缓冲液；所述cp1探针序列为：5'-cholesteryl-teg-gagtctgagctgttactgcactaccgggcctggcgtggtttgt-3'；所述cp2探针序列为：5'-ttagcaggattgcggcgtcattaggcagtaacagctcagactc-3'；所述ap探针序列为：5'-cccggtagtgttcctaatgacg-3'；所述sp1探针序列为：5'-caacaggaactccac-mb-3'；所述sp2探针序列为：5'-gccaatgtgatcttt-fc-3'。4.如权利要求3所述的基于dna机械臂的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤如下：1）用氧化铝粉抛光裸金电极，依次在无水乙醇和去离子水中超声清洗，氮气吹干，之后将电极置于0.5 m硫酸溶液中以0.1 v/s的扫描速率在-0.35 ~ +1.5 v电位间进行循环伏安扫描以清洗电极，至循环伏安曲线稳定，然后将电极取出用超纯水冲洗干净，氮气吹干，得到预处理后的金电极；2）使用dna固定缓冲液配制含等摩尔量的cp1探针、cp2探针、ap探针的溶液，于95℃孵育5 min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到dra溶液；使用dna固定缓冲液配制含信号探针sp1的溶液，于95℃孵育5 min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到退火后的sp1溶液；使用dna固定缓冲液配制含信号探针sp2探针的溶液，于95℃孵育5 min，再以1℃/min的速率降温至25℃，得到退火后的sp2溶液；使用depc水配制含待测靶标的溶液；3）将预处理后的金电极浸泡在1-己硫醇溶液中，室温孵育1 h，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到1-己硫醇修饰金电极；在1-己硫醇修饰金电极上滴加4
ꢀµ
l dra溶液，室温孵育1 h，而后超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到dra修饰金电极；在dra修饰金电极上滴加4
ꢀµ
l退火后的sp1溶液、4
ꢀµ
l退火后的sp2溶液、4
ꢀµ
l靶标溶液，室温孵育30 min，而后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，得到工作电极；4）将工作电极与ag/agcl电极、铂丝电极构成三电极体系，置于电化学检测液中，用方波伏安法扫描。5.根据权利要求4所述的基于dna机械臂的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于：所述dna固定缓冲液的配方为：10 mm tris，1 mm edta
·
2na
·
2h2o，50mm nacl，1 mm mgcl2，ph 8.0；所述depc水为经焦碳酸二乙酯除核酸酶处理的水。
6.根据权利要求4所述的基于dna机械臂的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于：所述dra溶液的浓度为2 μmol/l。7.根据权利要求4所述的基于dna机械臂的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于：所述退火后的sp1溶液的浓度为4 μmol/l。8.根据权利要求4所述的基于dna机械臂的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于：所述退火后的sp2溶液的浓度为2 μmol/l。9.如权利要求4所述的基于dna机械臂的电化学生物传感器的应用，其特征在于：用于制备新型冠状病毒检测产品。

技术总结
本发明涉及一种基于DNA机械臂的电化学传感器及其制备方法和应用。所述DNA机械臂由三条部分互补的单链DNA探针Cp1、Cp2和Ap杂交形成；Cp1、Cp2为手臂链，Ap作为中间链跨在两条手臂链上，共同维持T型DNA支架结构；Cp1、Cp2的未配对碱基延伸于T型DNA支架以外，作为DNA机械臂的功能臂用于特异性捕获靶标序列。基于该DNA机械臂构建的电化学生物传感器具有如下特点：（1）T型DNA支架结构的引入有效提高了捕获探针在电极界面组装的均一性；（2）既可以对两个不同的靶标分别进行检测，也可以同时检测两个不同的靶标；（3）[Fe(CN)6]3‒


技术研发人员：陈敬华 许丽兰 陈观宇 陈珠华 杨宁 卢诗 兰建明 吴芳 章溪 姚旭
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/10/15