以BRD7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用

以brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种以含溴区结构蛋白brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.brd7基因编码brd7蛋白，其包含一个高度保守的bromodomain结构域，能够识别组蛋白h3并调控其乙酰化，参与基因的转录调控。brd7被证实为swi/snf染色质重塑复合物的核心组分，通过影响下游基因的转录活性和表达参与肿瘤的发生发展。brd7能与yb1结合并降低其蛋白稳定性，从而抑制乳腺癌细胞增殖、体内肿瘤的生长和转移。目前该蛋白的免疫调控功能尚未被完全阐明，有研究报道brd7全敲除小鼠容易发生炎症相关的表型，包括外生殖器炎症、腹部脓肿和脾脏肿大等；并证实brd7剔除通过激活nf-кb信号通路，导致il-6、tnfα、inos和cxcl1等致炎因子分泌量改变，从而参与炎症的早期发生及炎癌转变；此外，brd7在免疫细胞中普遍表达，且在cd8+t细胞中显著高表达，提示brd7可能参与免疫性疾病的发生发展。自身免疫性疾病是免疫系统对机体自身成份发生免疫反应而引发的疾病。目前，已有100多种自身免疫性疾病，如多发性硬化症、类风湿关节炎、红斑狼疮等，已成为心血管疾病和肿瘤之后的第三类主要疾病。这些疾病往往是慢性迁延不愈的，临床上尚无有效的预防及治疗药物，最终导致残疾或死亡。在多发性硬化(ms)的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)中，可诱导血液和中枢神经系统中产生连续的克隆性扩张的cd4
+
、cd8
+
和γ
+
t细胞。髓鞘肽mog
35-55
可特异性诱导扩增性cd4
+
t细胞，但相反，从酵母肽-mhc库中提取的代用肽可诱导克隆扩增的cd8
+
t细胞，这些cd8
+
t细胞通过抑制mog特异性cd4
+
t细胞的增殖来抑制免疫性疾病进展。因此，诱导自发的cd4
+
t细胞会引发调节性cd8
+
t细胞的对立动员。因此，以调控cd8
+
t细胞的为靶点的药物可有效防治多发性硬化症。
3.应该注意，上面对技术背景的介绍只是为了方便对本技术的技术方案进行清楚、完整的说明，并方便本领域技术人员的理解而阐述的。不能仅仅因为这些方案在本技术的背景技术部分进行了阐述而认为上述技术方案为本领域技术人员所公知。


技术实现要素：

4.鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种以含溴区结构蛋白brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用，本技术通过实验验证了brd7小分子抑制剂与采用grna敲除brd7一样都对多发性硬化症具有很好的治疗效果。本发明证明通过抑制brd7蛋白活性和基因表达能抑制t细胞活化，降低cd4
+
t细胞百分比，增加cd8
+
t细胞百分比，同时抑制cd8
+
t细胞活化，从而抑制自身免疫系统，起到治疗自身免疫性疾病如多发性硬化症的效果。本发明揭示了brd7基因在免疫细胞和免疫系统中的新角色，并以brd7基因或蛋白为靶点设计制备治疗多发性硬化症的药物或其他治疗手段。
5.为了达到上述目的，本发明提供一种以含溴区结构蛋白brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用所述药物为brd7小分子抑制剂，所述brd7小分子抑制剂bi-7273，分
子量353.51，cas号1883429-21-7，分子式c
20h23
n3o3，其结构式如ⅰ所示：
[0006][0007]
依照本发明的一个方面，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。
[0008]
依照本发明的一个方面，所述以含溴区结构蛋白brd7为靶点为采用化学药物降低brd7的蛋白活性或者使brd7沉默。
[0009]
本发明的有益效果：
[0010]
本技术的brd7基因敲除能抑制t细胞活化，降低cd4
+
t细胞百分比，增加cd8
+
t细胞百分比，同时抑制cd8
+
t细胞活化，从而抑制自身免疫系统。
[0011]
本发明实验证明条件性敲除t细胞brd7和brd7抑制剂干预均可显著改善eae(ms动物模型)小鼠的神经功能评分。条件性敲除t细胞brd7可改善eae模型小鼠的神经脱髓鞘损伤。本发明同时证明了通过抑制t细胞brd7基因表达，降低eae小鼠脾脏cd4
+
t细胞百分比，增加cd8
+
t细胞百分比；同时，条件性敲除t细胞brd7小鼠脾脏t细胞在pha刺激后，cd8
+
t细胞活化标志物cd86的百分比下降，但cd4
+
t细胞活化标志物mhc-ii无明显差异，说明brd7通过调控cd8
+
t细胞活化发挥作用，进而抑制自身免疫反应，起到治疗自身免疫性疾病的作用，并据此研发了新的自身免疫性疾病治疗方式：brd7基因特异性sirna，brd7小分子抑制剂。本技术以brd7为靶点设计了治疗和/预防多发性硬化症的药物。揭示了brd7在免疫细胞和免疫系统中的新角色，并为防治多发性硬化症提供了新的治疗靶标和有效新药。
附图说明
[0012]
图1为本发明实施例所述的构建brd7-cko小鼠的工艺流程图；
[0013]
图2为本发明实施例的wt小鼠(n＝20)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型每隔1天进行的eae症状评分情况；
[0014]
图3a为本发明实施例的wt小鼠(n＝20)的c57bl/6成年雌性小鼠和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠的构建eae模型每隔1天进行的eae症状评分情况；图3b为本发明实施例2的wt小鼠(n＝20)的c57bl/6成年雌性小鼠和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠的构建eae模型每隔1天进行的eae症状评分后收集小鼠脊髓和大脑样本，石蜡切片的lfb染色图；
[0015]
图4a为本发明实施例的wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型，eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd3
+
t细胞的分布情况；图4b为图4a局部区域的cd4
+
t细胞的分布情况；图4c为wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型，eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd3
+
t细胞百分
比；图4d为wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型，eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd4
+
t细胞百分比；图4e为wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型，eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd8
+
t细胞百分比；
[0016]
图5a为本发明实施例wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型。eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd3+细胞激活标志物cd86表达；图5b为本发明实施例wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型。eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd8+t细胞激活标志物cd86的表达；图5c为本发明实施例wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型。eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd4+t细胞激活标志物cd86的表达；图5d为本发明实施例wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7(cko，n＝10)的c57bl/6成年雌性小鼠构建eae模型。eae模型评分结束后，分离获得脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测cd4+t细胞激活标志物mhc-ii的表达。
具体实施方式
[0017]
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。
[0018]
需要说明的是，“brd7-201”表示brd7基因有7个转录本，本技术使用转录本是201这个转录本。
[0019]
需要说明的是，本技术敲除brd7基因小鼠是基于c57bl/6小鼠进行敲除其brd7基因，简称brd7-cko小鼠；本技术的c57bl/6小鼠简称wt小鼠。
[0020]
需要说明的是，本技术的brd7基因特异性sirna为grna，具体包括grna1和grna2。grna1的序列号为：5
’‑
agtgtgaccgtgagacagcg-3’，如seq id no.6所示；grna2的序列号为：5
’‑
atgtgcaagggccaaccgac-3’，如seq id no.7所示。
[0021]
实施例1
[0022]
利用crispr/cas9技术构建t细胞敲除brd7小鼠(brd7-cko小鼠)。流程图如图1所示。
[0023]
brd7基因有7个转录本，brd7基因的dna序列的正义链的序列号如seq id no.1所示。根据brd7基因的结构，brd7-201(ensmust00000034085.7)转录本的第3外显子-第4外显子为敲除区域，第3个外显子的序列号如seq id no.2所示，第4个外显子的序列号如seq id no.3所示。该区域包含188bp的编码序列，敲除该区域将导致蛋白质功能的破坏。我们使用crispr/cas9技术来编辑brd7基因。简要过程如下：crispr/cas9系统grna被微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，该受精卵生产的小鼠为阳性f0小鼠，并通过pcr和测序进行
确认。通过将阳性f0代小鼠与c57bl/6jgpt小鼠交配，获得稳定的f1代小鼠模型。稳定的f1代小鼠(携带flox小鼠)与表达cre重组酶的小鼠(通用的工具小鼠)交配后将brd7基因的3-4号外显子敲除，导致brd7在t细胞中的功能丧失。grna设计如下：以序列号如seq id no.1所示的brd7基因的dna序列的正义链的brd7brd7-201(ensmust00000034085.7)转录本编辑目标序列，loxp插入位点分别如seq id no.4和seq id no.5所示。其中，crispr/cas9系统的grna包括grna1和grna2，其分别用于切割第3外显子和第4外显子，grna1的5
’‑3’
序列号为：5
’‑
agtgtgaccgtgagacagcg-3’，如seq id no.6所示；grna2的5
’‑3’
序列号为：5
’‑
atgtgcaagggccaaccgac-3’，如seq id no.7所示。
[0024]
需要说明的是，3-4号外显子两侧插入loxp标签，cre识别两侧插入的loxp标签并将标签内的第3外显子-第4外显子的敲除区域，达到基因编辑的目的。
[0025]
需要说明的是，由于本技术人设备有限，我们把上述brd7基因的3-4号外显子敲除的方案提供给江苏集萃药康生物科技有限公司进行代加工，制备得到敲除brd7基因的3-4号外显子的小鼠(brd7-cko小鼠)用于本技术的实验，其具体参加证据1。
[0026]
需要说明的是，本技术的上述小鼠只是用于实验室目的，没有用于商业用途，其crispr/cas9系统的grna在本技术之前尚未公开。
[0027]
需要说明的是，本技术的crispr/cas9系统的grna的合成为碱基合成，其为序列合成的通用方法，在此不进行赘述。
[0028]
实施例2
[0029]
采用wt小鼠(n＝20)的c57bl/6或实施例1的brd7敲除(brd7-cko)成年雌性小鼠构建eae模型。具体eae造模方法如下：将mog
35-55
溶于无菌pbs中，并与含结核杆菌的完全弗氏佐剂混合制备成乳剂。在小鼠颈部和小鼠左右后肢皮下注射乳剂，同时尾静脉注射百日咳毒素。造模第二天再次尾静脉注射百日咳毒素。eae模拟临床多发性硬化症症状评分标准为：0分，无症状；1分，尾巴无力；2分，尾巴无力且部分肢体无力；3分，一侧后肢瘫痪；4分；两侧后肢瘫痪；5分，垂死或死亡。自造模当天起(记为day 0)，随机分为两组，每组10只，标记为对照组和bi-727组。bi-727组每只小鼠给予每日口服180mg/kg bi-7273抑制剂，对照组给予每只小鼠口服相同体积的饮用水。每隔1天采用双盲法对eae模型小鼠神经功能评分，其评分结果如图2和图3a所示。由图2和图3a可知，与wt小鼠相比，cko小鼠临床神经功能评分显著降低；与口服相同体积的饮用水的wt小鼠，bi-727组小鼠临床神经功能评分也显著降低。即bi-727组小鼠与cko小鼠具有相似的临床神经功能评分规律。
[0030]
实施例3
[0031]
采用wt小鼠(n＝10)和条件性敲除t细胞brd7的c57bl/6(cko，n＝10)成年雌性小鼠构建eae模型。具体eae造模方法和评分标准同实施例1。自造模当天起(记为day 0)，每隔1天进行eae症状打分。并在疾病终点，收集小鼠脊髓和大脑样本，石蜡切片进行lfb染色。由图2-3可知，与wt小鼠相比，cko-eae小鼠临床神经功能评分显著降低，且lfb染色显示脊髓和大脑胼胝体的脱髓鞘病变显著改善。
[0032]
实施例4
[0033]
eae模型评分结束后，分离获得对照组小鼠(n＝3)和brd7敲除鼠(n＝4)脾脏细胞，采用流式细胞分析技术检测t细胞分化的影响；磁珠分选上述两组t细胞，cfse染色两组t细胞，体外加入pha刺激培养7d，采用流式细胞分析技术检测t细胞增殖。其结果如图4所示，由
图4可知，与wt-eae模型小鼠脾脏细胞相比，cko-eae模型小鼠脾脏cd3
+
t细胞百分比无差异，cd4
+
t细胞下降，cd8
+
t细胞上调。
[0034]
实施例5
[0035]
eae模型评分结束后，分离获得对照组小鼠(n＝3)和brd7敲除鼠(n＝4)脾脏细胞，磁珠分选t细胞。细胞按照4m/ml，500μl/孔(24孔板)布板，体外加入pha刺激培养1d，采用流式细胞分析技术检测t细胞激活(cd86/mhc-ii)。其结果如图5所示，由图5可知，体外刺激培养1d，95％以上的t细胞都是活细胞；与wt小鼠脾脏t细胞相比，cko小鼠脾脏t细胞在pha刺激后，cd86的百分比下降，提示t细胞激活的能力下降，但mhc-ii无明显差异。这些实验结果说明brd7通过cd8
+
t细胞发挥免疫调控作用。
[0036]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.以含溴区结构蛋白brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述药物为brd7小分子抑制剂，所述brd7小分子抑制剂bi-7273，其结构式如ⅰ所示：2.根据权利要求1所述的以含溴区结构蛋白brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。3.根据权利要求1所述的以含溴区结构蛋白brd7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述以含溴区结构蛋白brd7为靶点为采用化学药物降低brd7的蛋白活性或者使brd7沉默。

技术总结
本发明公开了以BRD7为靶点在防治自身免疫性疾病药物中的应用，药物为BRD7小分子抑制剂，BRD7小分子抑制剂BI-7273。自身免疫性疾病为多发性硬化症。本申请通过实验验证了BRD7小分子抑制剂与采用gRNA敲除BRD7一样都对多发性硬化症具有很好的治疗效果。本发明证明通过抑制BRD7蛋白活性和基因表达能抑制T细胞活化，降低CD4


技术研发人员：胡招兰 罗雁威 郭洁 李俏
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2023.02.24
技术公布日：2023/10/15