一种海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法与流程

260nm，洗脱时间≥13-15min，检测波长为310-330nm。
11.进一步地，步骤(1)满足如下a-e中的任意一项或者多项：
12.a、步骤1)中，水饱和正丁醇萃取的次数为1～3次，供试品的质量与水的体积以及每次使用的水饱和正丁醇的体积之比为0.1-0.6:10-20:20；质量与体积的配比关系为g/ml；
13.b、步骤2)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.1-0.6:20；质量与体积的配比关系为g/ml；
14.c、所述提取溶剂选自体积百分数为30-90％的甲醇水溶液或者乙醇水溶液，优选为体积百分数为70％的甲醇水溶液；
15.d、步骤2)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-60min；
16.e、步骤3)中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤。
17.进一步地，采用capcell core c18柱为色谱柱；和/或，采用柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm的色谱柱；和/或，所述海金沙草及其制剂选自海金沙草药材、海金沙草饮片、海金沙草水提物或者海金沙草药物制剂；和/或，所述甲酸溶液的体积百分数为0.05-0.2％；和/或，流速为0.5-0.9ml/min；和/或，柱温为19-30℃。
18.进一步地，所述的构建方法还包括采用原儿茶酸、咖啡酸、4-香豆素、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、蒙花苷中的一种或者多种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；优选的，溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶液；优选的，每1ml对照品溶液中含各对照品15-100μg。
19.进一步地，所述的构建方法还包括采用海金沙草对照药材加水提取、滤过后得到的滤液采用水饱和正丁醇萃取；取正丁醇液干燥后加入提取溶剂提取，得到提取液；将提取液固液分离，取液体，即得对照药材参照物溶液，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
20.进一步地，所述海金沙草及其制剂的特征图谱具有11个特征峰，以咖啡酸参照物峰相应的峰为s峰，峰4为s峰，峰1～峰3和峰5～峰11与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内，峰1～峰3和峰5～峰11的规定值依次为：0.48、0.77、0.94、1.06、1.45、1.93、2.17、2.32、2.52、3.16。
21.进一步地，所述海金沙草及其制剂的特征图谱具有11个特征峰，峰1为原儿茶酸、峰4为咖啡酸、峰6为4-香豆酸、峰7为异槲皮苷、峰8为山柰酚-3-o-芸香糖苷、峰11为蒙花苷。
22.本发明还提供了任一所述的海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法在海金沙草及其制剂的质量检测中的应用。
23.本发明还提供了一种海金沙草及其制剂产品的质量检测方法，其特征在于，包括将待测产品按照上述任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤。
24.本发明技术方案，具有如下优点：
25.1.本发明提供的海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法，供试品溶液通过如下方法制得：1)取供试品加水溶解得到溶液，采用水饱和正丁醇萃取；2)取正丁醇液干燥后加入提取溶剂提取，得到提取液；3)将提取液固液分离，取液体，即得供试品溶液；采用高效液相
色谱法在下述色谱条件下检测上述供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以甲酸溶液为流动相b，在特定洗脱程序下得到11个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、特征成分显著、简便，为海金沙草及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对海金沙草及其制剂整体成分表征，重现性稳定。
26.2.本发明提供的海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法，以药材、饮片及其相关制剂为研究对象，确认了11个共有特征峰，指认了原儿茶酸、咖啡酸、4-香豆素、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和蒙花苷6个特征成分，图谱所展示的结果极易判定，为海金沙草药材的特征图谱鉴别提供一种快速、可靠的检测方法。弥补了仅以单个指标含量进行评价出现误判的情况，能够更加全面的对海金沙草配方颗粒进行质量监控。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为实施例1得到的海金沙草饮片标准汤剂冻干粉的特征图谱；
29.图2为实施例2色谱柱的考察实验中cosmosil-5c18-paq色谱柱色谱图；
30.图3为实施例2色谱柱的考察实验中capcell core c18色谱柱色谱图；
31.图4为实施例2色谱柱的考察实验中cosmosil-5c18-ar
‑ⅱ
色谱柱色谱图；
32.图5为实施例2萃取溶剂的考察实验中乙酸乙酯为萃取溶剂获得的色谱图；
33.图6为实施例2萃取溶剂的考察实验中正丁醇为萃取溶剂获得的考察色谱图；
34.图7为实施例2检测波长的考察实验中254nm波长下色谱图；
35.图8为实施例2检测波长的考察实验中320nm波长下色谱图；
36.图9为实施例2色谱仪的考察实验中agilent 1260仪器色谱图；
37.图10为实施例2色谱仪的考察实验中waters e2695仪器色谱图；
38.图11为实施例2色谱仪的考察实验中赛默飞u3000仪器色谱图；
39.图12为实施例2中15批海金沙草药材的特征图谱；
40.图13为实施例2中海金沙草药材对照特征图谱；
41.图14为实施例2中15批海金沙草饮片的特征图谱；
42.图15为实施例2中海金沙草饮片对照特征图谱；
43.图16为实施例2中15批海金沙草饮片标准汤剂冻干粉的特征图谱；
44.图17为实施例2中海金沙草饮片标准汤剂冻干粉对照特征图谱；
45.图18为实施例2中海金沙草药材、饮片、饮片标准汤剂对照特征图谱；s1：海金沙草药材对照图谱；s2：海金沙草饮片对照图谱；s3：海金沙草饮片标准汤剂对照图谱；
46.图19为实施例2中海金沙草特征图谱对照定位结果；自下到上依次为供试品、原儿茶酸、咖啡酸、4-香豆素、山柰酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、蒙花苷；
47.图20为实施例3中海金沙草饮片标准汤剂特征图谱；
48.图21为实施例3中阴性对照色谱图(70％甲醇)。
具体实施方式
49.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
50.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
51.本发明中，海金沙草标准汤剂冻干粉是以海金沙草饮片为原料按照本领域常规方法制得，例如本发明中，按如下煎煮方法进行样品制备：取海金沙草饮片，浸泡30分钟，煎煮两次，一煎加12重量倍量的水，沸腾提取30分钟，二煎加10重量倍量的水，沸腾提取20分钟，滤过，滤液减压浓缩成相对密度为1.00～1.04(60℃)的纯浸膏，置冻干机中进行冷冻至干，粉碎成粉末，即得。70％甲醇是指体积百分数为70％的甲醇水溶液。
52.实施例1
53.本实施例提供了一种海金沙草标准汤剂冻干粉的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
54.供试品溶液的制备：以海金沙草标准汤剂冻干粉为供试品，取供试品约0.1g，加水10ml使溶解，用水饱合的正丁醇萃取两次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，取续滤液，即得。
55.对照品溶液的制备：取咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含咖啡酸40μg的溶液，作为对照品溶液；
56.高效液相色谱法检测：取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；254nm(洗脱时间《14分钟)，320nm(洗脱时间≥14分钟)，柱温20℃，流速每分钟为0.7ml。理论板数按咖啡酸峰计算应不低于3000。
[0057][0058]
结果见下表和图1所示，海金沙草标准汤剂冻干粉的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、特征成分显著，具有11个特征峰，峰4与咖啡酸对照品相对应，以咖啡酸对照品参照峰相对应的峰为s峰，峰1～3和峰5～峰11与s峰的相对保留时间依次为：0.48、0.77、0.94、1.06、1.45、1.93、2.17、2.31、2.52、3.15。
[0059]
表1海金沙草标准汤剂冻干粉各峰信息表
[0060][0061]
实施例2
[0062]
1、仪器与试药
[0063]
1.1仪器
[0064]
高效液相色谱仪1：thermo u3000色谱系统，包括四元溶剂管理器(pump)、自动进样器(autosampler)、原装进口色谱柱温箱(column compartment)、二极管阵列紫外检测器(detector)、chromeleon色谱管理系统；
[0065]
高效液相色谱仪2：waters e2695,包括g7104a型四元泵、132位自动进样器、g7116b型柱温箱、二极管阵列检测器；
[0066]
高效液相色谱仪3：agilent1260色谱系统，包括g1311b型四元泵、g1367e型自动进样器、g1316a型pda二极管阵列检测器、g1330b型柱温箱；
[0067]
mettler toledo(瑞士梅特勒)me36s、xs204、xse205(十万分之一)；sk5200h上海科导超声仪器有限公司；
[0068]
色谱柱：(1)cosmosil-5c18-ar
‑ⅱ
4.6
×
250mm 5μm
[0069]
(2)capcell core c18 4.6
×
150mm 2.7μm
[0070]
(3)cosmosil-5tc18-paq 4.6
×
250mm 5μm。
[0071]
1.2试剂
[0072]
乙腈为色谱纯，水为超纯水；冰乙酸、甲酸、三氟乙酸、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇等其他试剂均为分析纯。
[0073]
1.3试药
[0074]
咖啡酸对照品：购于中国食品药品检定研究院，批号110885-201703，纯度：99.7％。
[0075]
海金沙草对照药材：购于上海鸿永生物科技有限公司，批号280067-202103。
[0076]
海金沙草批次信息如下表：
[0077][0078][0079]
2、色谱条件和提取溶剂的考察
[0080]
(1)流动相系统的考察
[0081]
考察甲醇-水系统和乙腈-水系统对色谱峰分离及峰形等的影响。按照如下方法制备得到供试品溶液：取海金沙草标准汤剂冻干粉0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过制得供试品溶液。分别按下表中的规定对同一份供试品溶液进行梯度洗脱，色谱柱为cosmosil-5c18-ar
‑ⅱ
4.6
×
250mm 5μm；检测波长为320nm；柱温为30℃；进样量10μl。
[0082][0083]
表2流动相甲醇-乙腈考察系统适用性参数
[0084][0085]
注：“*”表示峰分离极差或峰出现交叉，仪器默认不计算分离度、对称因子或理论塔板数等参数；
[0086]
结果表明，海金沙草标准汤剂冻干粉的色谱峰个数比较少，特征图谱基线不平稳，且分离度较差，峰形较差，色谱峰峰高差异亦比较大；整体来看，乙腈-水系统优于甲醇-水系统，后续摸索采用乙腈-水系统。
[0087]
(2)酸种类的考察
[0088]
调整洗脱梯度，考察流动相中酸种类对色谱峰分离及峰形等的影响。按照如下方法制备得到供试品溶液：取海金沙草标准汤剂冻干粉0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，制得供试品溶液。对同一份供试品溶液进行检测，以乙腈为流动相a，分别以0.1％甲酸水溶液、0.1％冰乙酸水溶液或者0.1％三氟乙酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱，色谱柱为cosmosil-5c18-ar
‑ⅱ
4.6
×
250mm 5μm；检测波长为320nm；柱温为30℃；进样量10μl。
[0089][0090]
表3不同流动相考察系统适用性参数
[0091][0092][0093]
注：“*”表示峰分离极差或有交叉峰出现交叉，所以仪器无法默认不计算分离度、对称因子或理论塔板数等参数；
[0094]
结果表明，采用甲酸，相比较三氟乙酸和冰乙酸时相应峰的分离度以及响应值较好，分离效果明显提高，但从特征峰的保留时间来看，特征峰过多(仍有部分基线杂峰未积
分)，基线不平稳，出峰时间过于密集，反而不利于峰的整体定位与结果判定。
[0095]
(3)酸浓度的考察
[0096]
考察酸浓度对色谱峰分离及峰形等的影响。按照如下方法制备得到供试品溶液：取海金沙草标准汤剂冻干粉0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，制得供试品溶液。对同一份供试品溶液进行检测，以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水溶液、0.05％甲酸水溶液或者0.2％甲酸水溶液为流动相b，分别按下表中的规定进行梯度洗脱，色谱柱为cosmosil-5c18-ar
‑ⅱ
4.6
×
250mm 5μm，检测波长为320nm；柱温为30℃，进样量10μl。
[0097][0098]
表4不同流动相酸浓度考察系统适用性参数
[0099]
[0100][0101]
结果表明，使用0.05-0.2％甲酸可实现多个特征峰的分离，尤其是0.2％甲酸的分离效果最好。
[0102]
(4)色谱柱的考察
[0103]
考察色谱柱对色谱峰分离及峰形等的影响。按照如下方法制备得到供试品溶液：取海金沙草标准汤剂冻干粉0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，制得供试品溶液。对同一份供试品溶液进行检测，检测波长为320nm；柱温为30℃；进样量10μl，以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸水溶液为流动相b，采用如下三个色谱柱进行检测：
[0104]
1、cosmosil-5c18-paq 4.6x250mm，5μm
[0105]
2、capcell core c18 4.6x150mm，2.7μm；
[0106]
3、cosmosil-5c18-ar
‑ⅱ
4.6
×
250mm 5μm；分别按下表中的规定进行梯度洗脱。
[0107][0108]
结果见图2-4，采用capcell core c18色谱柱下色谱峰分布更均匀，基线均匀，故暂定capcell core c184.6
×
150mm 2.7μm色谱柱。
[0109]
(5)萃取剂的考察
[0110]
经上述优化考察，分离度有所改善，但发现特征峰过多(仍有部分基线杂峰未积分)，出峰时间过于密集，不利于峰的整体定位与结果判定，因此考虑采用不同有机溶剂(正丁醇、乙酸乙酯)对样品进行萃取，以期去除样品中的水溶性杂峰，使基线更加平稳。
[0111]
具体方法如下：分别取海金沙草标准汤剂冻干粉约0.1g，加水10ml使溶解，用水饱合的正丁醇或者乙酸乙酯萃取两次，每次20ml，合并正丁醇或者乙酸乙酯液，蒸干，放冷，残渣加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0112]
结果见图5-6，表明不同有机试剂萃取所得特征图谱色谱峰相较萃取前峰整体分布更为均匀，但总峰面积有一定差异，正丁醇萃取过后检测得到的色谱峰响应值明显大于乙酸乙酯萃取检测的色谱峰，综合考虑确定供试品前处理方法使用萃取溶剂为正丁醇继续优化梯度。
[0113]
(6)梯度洗脱程序的进一步优化
[0114]
梯度优化由色谱图可知，部分特征峰分离较差，需进一步优化分离；在上述基础上以色谱峰的信息量、色谱峰的分离度、分析时间等为指标，对梯度进行优化。按照如下方法制备得到供试品溶液：分别取海金沙草标准汤剂冻干粉约0.1g，加水10ml使溶解，用水饱合的正丁醇萃取两次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对同一份供试品溶液进行检测，色谱柱为capcell core；检测波长为320nm；柱温为25℃；进样量10μl，以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸水溶液为流动相b，分别按下表中的规定进行梯度洗脱。
[0115]
表5梯度洗脱程序
[0116][0117]
表6梯度洗脱程序
[0118][0119]
表7不同梯度考察系统适用性参数
[0120]
[0121][0122]
通过上述考察后，梯度6分离效果最好，各峰分布比较均匀，峰个数多，基线平稳，因此，暂定特征图谱方法为梯度6。
[0123]
(7)检测波长的考察
[0124]
对上述梯度6下海金沙草标准汤剂冻干粉色谱图中主要的色谱峰在190-400nm下的吸收图谱进行提取，结果见图7-8，前14分钟色谱峰最大吸收主要集中在254nm，且咖啡酸、4-香豆酸成分在320nm波长下吸收最大，14分钟后的峰吸收比较均匀集中在320nm下。其在254nm下，14分钟前，原儿茶酸的吸收波长较好，咖啡酸响应较低；在320nm下，选择14分钟
后更换波长主要是选择了海金沙草专属性较强的物质成分。
[0125]
(8)色谱仪的考察
[0126]
取按照本实施例第(6)项下制得的供试品溶液分别在不同品牌的色谱仪下(agilent 1260和waters e2695、赛默飞u3000)上进样，考察不同仪器耐用性，其他色谱条件如下：
[0127]
色谱柱为capcell core洗脱时间《14min，检测波长为254nm，洗脱时间≥14min，检测波长为320nm；柱温为25℃；进样量10μl，以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸水溶液为流动相b，分别按上述梯度6进行梯度洗脱，结果见图9-11，表明不同仪器耐用性较好。
[0128]
(9)流速的考察
[0129]
取按照本实施例第(6)项下制得的供试品溶液，分别以0.5ml/min、0.7ml/min、0.9ml/min流速进行考察，其余色谱条件同本实施例第(8)项，结果显示，流速0.5ml/min-0.9ml/min各特征峰均可实现良好分离，其中以0.7ml/min的分离效果最佳。
[0130]
表8不同流速的峰结果
[0131][0132]
[0133][0134][0135]
(10)柱温的考察
[0136]
取按照本实施例第(6)项下制得的供试品溶液，分别以20℃、25℃、30℃柱温进行考察，其余色谱条件同本实施例第(8)项，结果显示，柱温20-30℃下各特征峰均可实现良好分离，其中以20℃的分离效果最佳。
[0137]
表9不同柱温的峰结果
[0138][0139]
[0140][0141]
3、特征图谱和参数的建立
[0142]
采用药典委员会编制的特征图谱相似度评价软件“中药色谱特征图谱相似度评价系统2012版”，采用多批具有代表性海金沙草饮片标准汤剂冻干粉样品生成对照特征图谱；并通过查阅文献，对海金沙草饮片标准汤剂冻干粉各个特征峰的化学性质进行分析，选用咖啡酸对其进行定位指认。
[0143]
(1)15批海金沙草药材、饮片和标准汤剂冻干粉特征图谱的建立
[0144]
参照物溶液的制备：取咖啡酸，精密称定，加70％甲醇制成每1ml咖啡酸20μg的溶液，作为对照品溶液。取海金沙草对照药材0.6g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，滤过，滤液用水饱合的正丁醇振摇提取2次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取〔含量测定〕项下对照品溶液，作为对照品参照物溶液；
[0145]
供试品溶液的制备：分别以15批海金沙草药材、饮片和饮片标准汤剂冻干粉为供试品按照实施例1方法制备供试品溶液。
[0146]
高效液相色谱法：取供试品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱法检测，色谱条件同实施例1。
[0147]
如图12所示，通过15批海金沙药材供试品的特征图谱的检测结果进行了分析，采用药典委员会编制的特征图谱相似度评价软件“中药色谱特征图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征图谱，如图13；确认得到的海金沙草药材hplc特征图谱分离度较好的11个色谱峰，并根据色谱峰的顺序重新排列色谱峰序号1～11号。测定结果表明15批海金沙草药材特征图谱均呈现11个特征峰，与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，以咖啡酸参照物峰相应的峰为s峰，峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10和峰11与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内。峰1～3和峰5～峰11的规定值依次为：0.48、0.77、0.94、1.06、1.45、1.93、2.17、2.32、2.52、3.16。
[0148]
表10 15批海金沙草药材特征图谱测定相对保留时间结果
[0149][0150][0151]
表11 15批海金沙草药材特征图谱测定相对峰面积结果
[0152][0153]
如图14所示，通过对15批海金沙饮片供试品的特征图谱的检测结果进行分析，采用药典委员会编制的特征图谱相似度评价软件“中药色谱特征图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征图谱，如图15。测定结果表明15批海金沙草饮片特征图谱呈现11个特征峰，并根据色谱峰的顺序重新排列色谱峰序号1～11号。与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，以咖啡酸参照物峰相应的峰为s峰，峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10和峰11与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内。峰1～3和峰5～峰11的规定值依次为：0.48、0.77、0.94、1.06、1.45、1.93、2.17、2.32、2.52、3.16。
[0154]
表12 15批海金沙草饮片特征图谱测定相对保留时间结果
[0155]
[0156][0157]
表13 15批海金沙草饮片特征图谱测定相对峰面积结果
[0158][0159][0160]
如图16所示，通过对15批海金沙饮片标准汤剂冻干粉的特征图谱的检测结果进行
分析，采用药典委员会编制的特征图谱相似度评价软件“中药色谱特征图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征图谱，如图17。测定结果表明15批海金沙草饮片标准汤剂冻干粉特征图谱呈现11个特征峰，并根据色谱峰的顺序重新排列色谱峰序号1～11号。与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，以咖啡酸参照物峰相应的峰为s峰，峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10和峰11与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内。峰1～3和峰5～峰11的规定值依次为：0.48、0.77、0.94、1.06、1.45、1.93、2.17、2.32、2.52、3.16。
[0161]
表14 15批海金沙草饮片标准汤剂相对保留时间结果
[0162][0163]
表15 15批海金沙草饮片标准汤剂相对峰面积结果
[0164]
[0165][0166]
(2)药材、饮片和标准汤剂冻干粉特征图谱传递关系
[0167]
如图18所示，根据研究选用的15批海金沙草药材和对应的15批海金沙草饮片、15批饮片标准汤剂，按实施例1特征图谱项下方法进行测定，得到的特征峰数量一致，均出现11个特征峰，说明采用本发明构建的特征图谱方法，海金沙草从药材经炮制加工为海金沙草饮片过程中，以及由海金沙草饮片按传统制备方法制得的标准汤剂冻干粉中，检测出的物质成分未发生改变，量值传递关系良好。各个特征峰规定的相对保留时间均在海金沙草饮片标准汤剂对照图谱规定值的
±
10％范围之内，与对照药材参照物色谱中的11个特征峰保留时间相对应。
[0168]
表16药材、饮片、标准汤剂对照图谱相对保留时间比较
[0169][0170]
(3)峰指认
[0171]
对照品溶液的制备：取原儿茶酸、咖啡酸、4-香豆素、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、蒙花苷适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml对照品溶液中含40μg原儿茶酸、40μg咖啡酸、15μg4-香豆素、40μg异槲皮苷、40μg山柰酚-3-o-芸香糖苷或者20μg蒙花苷的溶液，即得。
[0172]
取上述实施例1制得的海金沙草标准汤剂冻干粉的供试品溶液，将各对照品溶液及供试品溶液，按实施例1的方法高效液相色谱法进行检测后比对，结果如图19。
[0173]
小结：海金沙草标准汤剂冻干粉供试品色谱图中峰1为原儿茶酸、峰4为咖啡酸、峰6为4-香豆酸、峰7为异槲皮苷、峰8为山柰酚-3-o-芸香糖苷、峰11为蒙花苷。
[0174]
实施例3方法学验证
[0175]
1、仪器精密度试验
[0176]
以海金沙草药材为供试品按照实施例1的方法制备供试品溶液，取同一份海金沙草药材的供试品溶液，按实施例1下的色谱条件，重复进样6次，测定11个特征峰的相对保留时间、相对峰面积，并进行分析，结果见下表。
[0177]
表17仪器精密度相对保留时间试验结果
[0178][0179]
表18仪器精密度相对峰面积试验结果
[0180][0181]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2％，各特征峰与参照物s峰的相对峰面积的rsd小于4.5％，表明仪器精密度良好。
[0182]
分别以海金沙草标准汤剂冻干粉为供试品同法考察仪器精密度试验，结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2.0％；相对峰面积的rsd均小于4.0％。表明仪器精密度良好。
[0183]
2、方法重复性试验
[0184]
取同一批号海金沙草药材供试品6份，按实施例1的下方法分别测定11个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，并进行分析，结果见下表。
[0185]
表19方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
[0186][0187][0188]
表20方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
[0189][0190]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd小于2.0％，相对峰面积的rsd小于5.09％，表明本方法重复性良好。
[0191]
分别以海金沙草饮片标准汤剂冻干粉为供试品同法考察重复性试验，结果表明，11个共有峰的与参照峰(峰s)的相对保留时间rsd值小于2.0％，表明该方法重复性良好。
[0192]
3、中间精密度(不同操作人员)
[0193]
分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例1的下色谱条件测定同一批号的海金沙草药材，分别测定11个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，并进行分析，结果见下表。
[0194]
表21中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)
[0195][0196]
表22中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)
[0197][0198][0199]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2.0％，相对峰面积的rsd均小于2.0％，表明方法中间精密度(不同人员)良好。
[0200]
分别以海金沙草饮片标准汤剂冻干粉为供试品同法考察中间精密度试验，结果表明，11个共有峰的与参照峰(峰s)的相对保留时间rsd值小于2.0％，表明该方法中间精密度良好。
[0201]
4、耐用性考察
[0202]
(1)稳定性考察
[0203]
取同一海金沙草药材为供试品按实施例1供试品溶液的制备和高效液相色谱法检测，分别在制备后0、4、8、12、16、24小时进样，测定11个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，并进行分析，确定供试品溶液的稳定性，结果见下表。
[0204]
表23稳定性相对保留时间试验结果
[0205][0206]
表24稳定性相对峰面积试验结果
[0207][0208]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2％，相对峰面积的rsd小于6％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
[0209]
(2)不同流速的考察
[0210]
取同一海金沙草药材为供试品按实施例1供试品溶液的制备供试品溶液，取同一批供试品溶液，按实施例1的测定方法，分别用0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min的流速进行测定，考察本品在流速发生微小变化时各特征峰与参照物s峰的相对保留时间及相对峰面积，并进行分析，结果见下表。
[0211]
表25不同流速相对保留时间结果
[0212][0213]
表26不同流速相对峰面积结果
[0214][0215]
考察本方法在流速发生微小变化时各特征峰与参照物s峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示相对保留时间rsd％小于8％，各个峰的相对峰面积rsd％较大，表明流速对各个峰的相对保留时间稍有影响，对峰面积影响较大，故流速优选为0.7ml/min。
[0216]
分别以海金沙草饮片标准汤剂冻干粉为供试品同法考察流速，结果表明，11个共有峰的与参照峰(峰s)的相对保留时间rsd值小于等于8.0％，结果表明不同流速对峰2、峰10与峰11的特征峰相对保留时间有一定的影响，流速在发生微小变化时，各特征色谱峰保留时间发生微小变化。故流速优选为0.7ml/min。
[0217]
(3)不同柱温的考察
[0218]
取海金沙草药材为供试品按实施例1供试品溶液的制备和高效液相色谱法检测，分别设置柱温为19℃、20℃、22℃，并进样测定，记录色谱图，对其中的特征峰相对保留时间及相对峰面积进行分析，结果见下表。
[0219]
表27不同柱温考察相对保留时间结果
[0220][0221]
表28不同柱温考察相对峰面积结果
[0222][0223]
结果分析：考察在柱温发生变化时各特征峰与参照物s峰的相对保留时间、相对峰面积，结果相对保留时间rsd％小于4％，不同柱温下的耐用性良好。
[0224]
综合考虑，本方法柱温优选为20℃。
[0225]
分别以海金沙草饮片标准汤剂冻干粉为供试品同法考察柱温，结果表明，11个共有峰的相对保留时间小于2％，说明柱温的微小变动对特征峰的相对保留时间影响较小，不同柱温下的耐用性良好。
[0226]
(4)不同色谱柱考察
[0227]
按照方法考察里确定的色谱条件，考察不同批号色谱柱对海金沙草药材特征图谱的影响。取供试品按实施例1供试品溶液的制备和高效液相色谱法检测，进样测定，记录色谱图，对其中的特征峰相对保留时间及相对峰面积进行分析，结果见下表。
[0228]
表29不同批号色谱柱考察相对保留时间结果
[0229][0230]
表30不同批号色谱柱考察相对峰面积结果
[0231][0232]
考察在不同色谱柱批号，结果相对保留时间rsd％均小于2％，相对峰面积rsd％小于2％。表明不同色谱柱批号对特征图谱相对保留时间影响较小。
[0233]
(5)不同液相考察
[0234]
取同一份实施例1方法制得的海金沙草药材供试品溶液，按实施例1的测定方法，分别在安捷伦、赛默飞、waters色谱仪进行测定，记录色谱图，对其中的特征峰的相对保留时间及相对峰面积进行分析，结果见下表。
[0235]
表31不同液相考察相对保留时间结果
[0236][0237][0238]
表32不同液相考察相对峰面积结果
[0239][0240]
考察在液相发生变化时各特征峰与参照物s峰的相对保留时间，结果相对保留时间rsd％均小于4％。结果显示不同品牌液相色谱仪(安捷伦、赛默飞、waters)对特征图谱相对保留时间影响较小，表明不同品牌液相色谱仪对方法的耐用性良好。
[0241]
分别以海金沙草饮片标准汤剂冻干粉为供试品同法考察不同仪器的影响，结果表明，11个共有峰的相对保留时间小于4％，说明仪器对特征峰的相对保留时间和相对峰面积影响较小，不同仪器下的耐用性良好。
[0242]
5、专属性
[0243]
供试品采用提取溶剂为甲醇，精密吸取实施例1制得的供试品溶液、阴性对照溶液(70％甲醇)各10μl，分别注入液相色谱仪，按实施例1的方法试验，如图20和21所示，结果阴性无干扰。
[0244]
上述方法学考察结果，建立的海金沙草药材或者标准汤剂冻干粉特征图谱的11个特征峰中，各色谱峰受不同液相仪器、色谱柱、柱温与流速因素均稍有影响，但相对保留时间值处在-10％～10％范围，因此，建议将规定值范围控制在
±
10％以内。
[0245]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备，包括如下步骤：1)取供试品加水溶解得到溶液，采用水饱和正丁醇萃取；2)取正丁醇液干燥后加入提取溶剂提取，得到提取液；3)将提取液固液分离，取液体，即得供试品溶液；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱：2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，检测波长为250-330nm，优选的，洗脱时间<13-15min，检测波长为250-260nm，洗脱时间≥13-15min，检测波长为310-330nm。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)满足如下a-e中的任意一项或者多项：a、步骤1)中，水饱和正丁醇萃取的次数为1～3次，供试品的质量与水的体积以及每次使用的水饱和正丁醇的体积之比为0.1-0.6:10-20:20；质量与体积的配比关系为g/ml；b、步骤2)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.1-0.6:20；质量与体积的配比关系为g/ml；c、所述提取溶剂选自体积百分数为30-90％的甲醇水溶液或者乙醇水溶液，优选为体积百分数为70％的甲醇水溶液；d、步骤2)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-60min；e、步骤3)中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤。4.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，采用capcell core c18柱为色谱柱；和/或，采用柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm的色谱柱；和/或，所述海金沙草及其制剂选自海金沙草药材、海金沙草饮片、海金沙草水提物或者海金沙草药物制剂；和/或，所述甲酸溶液的体积百分数为0.05-0.2％；和/或，流速为0.5-0.9ml/min；和/或，柱温为19-30℃。5.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用原儿茶酸、咖啡酸、4-香豆素、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、蒙花苷中的一种或者多种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；优选的，溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶液；优选的，每1ml对照品溶液中含各对照品15-100μg。6.根据权利要求1-5中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用海金沙草对照药材加水提取、滤过后得到的滤液采用水饱和正丁醇萃取；取正丁醇液干燥后加入提取溶剂提取，得到提取液；将提取液固液分离，取液体，即得对照药材参照物溶液，
以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照药材参照图谱的步骤。7.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，所述海金沙草及其制剂的特征图谱具有11个特征峰，以咖啡酸参照物峰相应的峰为s峰，峰4为s峰，峰1～峰3和峰5～峰11与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内，峰1～峰3和峰5～峰11的规定值依次为：0.48、0.77、0.94、1.06、1.45、1.93、2.17、2.32、2.52、3.16。8.根据权利要求1-7中任一所述的构建方法，其特征在于，所述海金沙草及其制剂的特征图谱具有11个特征峰，峰1为原儿茶酸、峰4为咖啡酸、峰6为4-香豆酸、峰7为异槲皮苷、峰8为山柰酚-3-o-芸香糖苷、峰11为蒙花苷。9.权利要求1-8中任一所述的海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法在海金沙草及其制剂的质量检测中的应用。10.一种海金沙草及其制剂产品的质量检测方法，其特征在于，包括将待测产品按照权利要求1-8中任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤。

技术总结
本发明涉及中药制剂质量检测领域，具体提供了一种海金沙草及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法，其中在特征图谱构建方法中，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，洗脱时间<13-15min，检测波长为250-260nm，洗脱时间≥13-15min，检测波长为310-330nm，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸溶液为流动相B，在特定洗脱程序下得到11个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、特征成分显著、简便，为海金沙草及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对海金沙草及其制剂整体成分表征，重现性稳定。重现性稳定。重现性稳定。


技术研发人员：唐双燕 魏家保 张辉 谭沛 黄凯伟
受保护的技术使用者：华润三九现代中药制药有限公司
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/10/15