TLR2/4-IRF3信号通路在开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用

tlr2/4-irf3信号通路在开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医学生物学技术领域，具体涉及tlr2/4-irf3信号通路在开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，具体为药物促进tlr2/4-irf3信号通路高表达，使tlr2/4和irf3的蛋白表达上调，tlr2/4和irf3的mrna相对表达水平升高，促进胆固醇外流，减少胆固醇酯沉积。


背景技术：

2.动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是心血管疾病的主要病理基础，as形成是由于脂质代谢紊乱、炎症反应、氧化应激、内皮损伤等多种因素综合作用引起的血管退行性病变，其发生发展中伴随着血管内皮细胞功能的障碍、巨噬细胞的炎症反应聚集和吞噬脂质形成泡沫细胞、平滑肌细胞的增殖迁移、化学因子、细胞因子和生长因子等一系列病理变化,导致血管壁脂质的形成和纤维组织的损伤，胆固醇沉积并被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞是动脉粥样硬化形成的病理基础和关键。降低胆固醇沉积，促进其流出是防治as的重要方法，而胆固醇逆转运(reversech-olesteroltransport，rct)是机体清除内源性胆固醇的重要途径，也是机体预防as的关键。胆固醇逆转运(rct)是指胆固醇从泡沫细胞中流出，与载脂蛋白a-1(apolipoprotein a-1，apo 1)结合，形成高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，hdl)转运至肝脏，以胆汁形式排出的过程。
3.toll样受体(toll like receptors，tlrs)是最早于果蝇中发现的一类细胞膜蛋白，是一类进化高度保守的病原分子识别受体，是连接天然免疫和特异性免疫的跨膜信号转导受体家族，属于模式识别受体。迄今为止，已在哺乳动物中发现了13种tlrs分子，分别是tlr1-13，其中在人类表达有11种。tlrs属于ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区结构有富含亮氨酸的重复序列，负责识别不同的病原分子；胞内区与白介素-1(il-1)受体的胞内区相似，负责受体活化后的信号转导。tlrs分布广泛，在外周血白细胞中表达水平最高，单核巨噬细胞、b细胞、t细胞及树突细胞均表达tlrsmrna。tlrs最突出的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应；另一项功能是促进抗原提呈细胞的成熟，从而诱导机体的获得性免疫反应，因而tlrs是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁。toll受体4(toll like recept-ors4)作为人类发现的首个tlrs相关蛋白，几乎在所有细胞系都有表达,tlr4在as形成和发展过程中起着重要的信号转导作用。
4.沉默信息调节因子2(silentinformationregulator2，sirt2)相关酶类，是一种高度保守的nad+依赖的蛋白去乙酰化酶类,在基因沉默、基因组稳定性、细胞寿命以及代谢调节上具有重要的作用，sirt2家族中有7个同源基因，分别是sirt1-sirt7。研究发现sirt1能与多种信号传导通路中的蛋白相互作用，可以使生物体内的组蛋白、赖氨酸残基、转录因子发生去乙酰化，并参与神经保护、细胞衰老凋亡、糖脂类代谢、胰岛素分泌、炎症氧化应激反应、血管生成等过程，发挥其对基因的调控功能，比如头蛋白盒转录因子(forkhead-box transc ription factors，foxo)1/3/4、c-myc、nf-κb、igfbp1、p300和p53等蛋白。sirt1适
度过表达能预防与治疗高脂诱导的动脉粥样硬化。lyudmylakedenko等证实了sirt1和foxo1基因位点的遗传变异与颈动脉粥样硬化的相关性，提出了sirt1和foxo1上的基因多态性(snp)对颈动脉粥样硬化有重要影响。kong xiangyi等研究发现在病理生理情况下，活性氧(ros)和氧化剂过量产生在急慢性心脑血管疾病(ccvds)的发展中是至关重要的，sirt1可以通过抑制ros的影响保护内皮细胞免受氧化损伤。jaime等发现在慢性高氧化应激和炎症条件下，sirt1和abca1抑制调节炎症和代谢的功能被抑制，长期摄入高晚期糖基化终产物(dages)饮食可以消耗sirt1和abca1等抗体，易患慢性代谢性疾病。
5.熊果酸(ursolic acid，ua)又名乌索酸、乌苏酸，是一种存在于多科植物中的五环三萜类化合物，分子式为c30h48o3，相对分子质量456.68da，是从山楂、白花蛇舌草等叶和果实的植物中提取，ua具有广泛的生物学效应，课题组及国内外诸多研究结果表明熊果酸具有显著的抗动脉粥样硬化、降血脂等药理作用。he等2013年研究发现，熊果酸能够刺激成熟3t3-l1脂肪细胞中脂肪的分解，并能够通过lkb1/ampk信号通路上调sirt1，进而抑制前脂肪细胞分化及脂肪生成(抗肥胖)。stein等研究表明sirt1能抑制巨噬细胞中清道夫受体lox-1表达，减少oxldl的摄入和抑制巨噬细胞性泡沫细胞形成。myd88敲除的小鼠，lps仍可以激活tlr4，出现延迟的核转录因子-κb(nuclearfactorkappb，nf-κb)，jnk激活。
6.近年来熊果酸抗肿瘤的作用一直是国内外研究的热点，而对其在心血管系统作用的研究仅刚刚开始，对熊果酸通过干预tlr2/4－irf3信号通路调节胆固醇逆转运分子机制及sirt1在熊果酸干预中对信号通路的作用方面相关研究尚不清晰。该项目通过发现熊果酸抑制动脉粥样硬化的作用，进一步确定了熊果酸抗动脉粥样硬化作用机制提供理论依据和实践基础，有利于动脉粥样硬化的防治和熊果酸的研究开发且提供新的信号通路用于开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的在于提出新的信号通路用于开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物，以发现更多或更好的能够用于预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。
8.tlr2/4-irf3信号通路在开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
9.进一步地，所述药物促进tlr2/4-irf3信号通路高表达。
10.进一步地，所述药物能够使tlr2/4和irf3的蛋白表达上调，tlr2/4和irf3的mrna相对表达水平升高。
11.进一步地，所述药物通过基因表达上调，促进胆固醇外流，减少胆固醇酯沉积。
12.进一步地，所述促进tlr2/4-irf3信号通路高表达的药物为熊果酸ua,泡沫细胞胆固醇流出率随ua质量浓度增加而逐渐增加。
13.本发明的工作原理介绍：本发明通过熊果酸对tlr2/4－irf3信号通路调节胆固醇逆转运分子机制及sirt1对信号通路的作用表达的影响研究，确定了抗动脉粥样硬化药物能够促进tlr2/4-irf3信号通路高表达，使tlr2/4和irf3的蛋白表达上调，tlr2/4和irf3的mrna相对表达水平升高，促进胆固醇外流，减少胆固醇酯沉积。tlr2和tlr4的下游分子irf-3的激活可抑制lxrs的转录活性，使abca1、abcg1的基因表达下调，促进游离胆固醇的酯化，
抑制胆固醇逆转运的重要机制。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
15.(1)本发明提出tlr2/4-irf3信号通路作为动脉粥样硬化相关疾病的药物的筛选信号通路。以熊果酸为代表药物干预as小鼠的实验中显示，小鼠腹主动脉斑块厚度减低，泡沫细胞减少，血清和肝脏中的3h-胆固醇含量均下降，粪便中3h的含量增加，抑制胆固醇逆向转运，并促进胆固醇流出；观测到熊果酸可调控tlr2/4-irf3信号通路高表达，抑制胆固醇逆向转运，通过上调tlr2/4-irf3信号通路的tlr2/4和irf3的蛋白表达和tlr2/4和irf3的mrna相对表达水平，促进游离胆固醇的酯化外流，减少胆固醇酯沉积，从而缓解和/或治疗动脉粥样硬化。说明lr2/4-irf3信号通路可作为动脉粥样硬化相关疾病的药物的筛选信号通路，对今后该类疾病的药物开发、筛选和预防治疗具有重要意义。
16.(2)tlr2/4-irf3信号传导通路促进游离胆固醇的酯化和脂滴的形成，抑制胆固醇逆向转运。
附图说明
17.图1药物干预后小鼠血脂水平变化柱状图和腹主动脉he染色组织形态学观察电镜图；
18.图2药物干预后小鼠血清、肝组织、粪便中3h-胆固醇分布变化；
19.图3为sirt1mrna、lrxmrna、abca1mrna、tlr2mrna、tlr4mrna、irf3mrna和β-actinmrna表达电泳图；
20.图4为sirt1mrna、lrxmrna、abca1mrna、tlr2mrna、tlr4mrna、irf3mrna和β-actinmrna表达柱状图；
21.图5为sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达电泳图；
22.图6为熊果酸(ua)对动脉粥样硬化apoe-/-腹主动脉sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达柱状图；
23.图7为泡沫细胞油红o染色、细胞生存率、胆固醇流出率和泡沫细胞中胆固醇酯含量；
24.图8为低、中、高浓度熊果酸影响下sirt1mrna、lrxmrna、abca1mrna、tlr2mrna、tlr4mrna和irf3mrna表达电泳图；
25.图9为不同浓度熊果酸对巨噬细胞源性泡沫细胞中sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3基因表达影响柱状图；
26.图10为低、中、高浓度熊果酸影响下sirt1、abca1、lrx、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达的电泳图；
27.图11熊果酸对巨噬细胞源性泡沫细胞中sirt1、abca1、lrx、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达影响柱状图。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细发明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下发明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本
发明的概念。
29.实施例1：体内实验
30.(1)动物分组、造模和给药(高脂饲料喂养法复制动脉粥样硬化apoe-/-小鼠模型)
31.c57bl/6j小鼠为空白对照组，给予普通饲料喂养，apoe-/-小鼠随机分为四组：模型组、阿托伐他汀组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组和熊果酸高剂量组，每组10只。空白组饲喂普通饲料，其余组均采用饲喂高脂饲料联合腹腔注射维生素d3法造模[10]。高脂饲料喂养小鼠分别在实验开始的第1、4、10天注射腹腔注射维生素d3，总剂量70万iu/kg，同时空白组腹腔注射等体积的生理盐水。造模第3周开始，根据药理试验中小鼠与人体间的等效剂量换算系数约为1.0计算后
[11]
，空白组和模型组给予生理盐水10ml/(kg
·
d)灌胃，阿托伐他汀组给予阿托伐他汀加生理盐水混悬液1mg/(kg
·
d)；熊果酸低剂量组给果酸加生理盐水混悬液10mg/(kg
·
d)；熊果酸中剂量组给予熊果酸加生理盐水混悬液15mg/(kg
·
d)和熊果酸高剂量组给予熊果酸加生理盐水混悬液20mg/(kg
·
d)，每周称重一次，连续用药8周后，摘眼球法取小鼠血液并分离血清；处死小鼠，分离小鼠腹主动脉，分别保存于4％多聚甲醛和-80℃超低温冰箱中待测；对6组wistar大鼠取血测定血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl-c)和低密度脂蛋白(ldl-c)，并取股动脉行he染色制作病理切片，检测动物模型建立是否成功。
[0032]
(2)血脂水平检测
[0033]
在第8周末处死小鼠收集空白对照组、模型组、阿托伐他汀组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组和熊果酸高剂量组血清样本，采用全自动血生化分析仪检测血清甘油三酯(tg)、血清胆固醇(tc)、低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)。
[0034]
药物干预后小鼠血脂水平变化结果：
[0035]
药物干预8周后采用全自动血生化分析仪检测空白对照组、模型组、立普妥组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组和熊果酸高剂量组血清样本甘油三酯(tg)、血清胆固醇(tc)、低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)的变化，结果显示与空白对照组小鼠血清比较，模型组小鼠血清中ldl-c、tg、tc水平显著升高(p《0.05)，hdl-c水平显著降低(p《0.05)；与模型组比较，立普妥组ldl-c、tg、tc水平显著降低(p《0.05)，hdl-c水平显著升高(p《0.05)；与立普妥组比较，熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组和熊果酸高剂量组ldl-c、tg、tc水平显著逐渐降低(p《0.05)，hdl-c水平显著逐渐升高(p《0.05)，且呈剂量依赖性，见图1；
[0036]
表1药物干预后小鼠血脂水平变化(n＝60)
[0037]
[0038]
(3)腹主动脉he染色组织形态学观察
[0039]
分别取4％多聚甲醛溶液中固定的空白对照组、模型组、阿托伐他汀组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组和熊果酸高剂量组腹主动脉组织，按参考文献
[12]
进行he染色。
[0040]
结果：正常对照组小鼠动脉血管壁各层结构完整，内膜薄，无脂质斑块；模型组内膜明显增厚，脂质斑块弥漫，泡沫细胞大量聚集，管腔明显狭窄；立普妥组血管壁增厚，泡沫细胞减少；熊果酸低剂量组斑块厚度减低，泡沫细胞减少，与立普妥组比较无明显差异；熊果酸中剂量组泡沫细胞显著减少；熊果酸高剂量组泡沫细胞明显；与立普妥组比较，熊果酸中剂量组和高剂量组明显减少(p《0.01)，见图1。
[0041]
(4)检测胆固醇流出率
[0042]
胆固醇流出率按文献方法测定,以空白对照组、模型组、阿托伐他汀组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组和熊果酸高剂量组为动物模型，给予腹腔注射经乙酰化低密度脂蛋白(ac-ldl)荷脂与3h-胆固醇标记的raw264.7小鼠巨噬细胞悬液，用液闪计数仪测定血清、肝组织、粪便中3h-胆固醇占注射总量的百分比含量。
[0043]
结果：用液闪计数仪测定血清、肝组织、粪便中3h-胆固醇的含量，结果显示立普妥组小鼠血清和肝脏3h的含量较模型组逐渐减少(p《0.01)，降幅分别为27％和15.9％；粪便中3h的总含量显著增多(p《0.01)，增幅为21％；与空白对照组比较，小鼠血清、肝脏和粪便中3h的含量均增加，分别上升52％、48％和105％。ua低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠血清和肝脏3h的含量较模型组均逐渐减少(p《0.01)，血清中3h含量降幅分别为35％、52％和65％，肝脏3h的含量降幅分别为47％、42％和72％；粪便中3h的含量较模型组逐渐增加(p《0.01)；与对照组比较，ua低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠血清和肝脏中3h的含量均下降(p《0.01)，粪便中3h的含量升高(p《0.01),见表2以及图2。
[0044]
表2药物干预后小鼠血清、肝组织、粪便中3h-胆固醇分布变化(n＝60)
[0045]
组别血清(％)肝脏(％)粪便(％)空白对照组2.12
±
0.242.23
±
0.230.73
±
0.31模型组4.48
±
0.234.14
±
0.161.46
±
0.12阿托伐他汀组3.23
±
0.343.32
±
0.111.78
±
0.21熊果酸低剂量组2.89
±
0.233.12
±
0.182.23
±
0.15熊果酸中剂量组2.11
±
0.322.36
±
0.283.17
±
0.24熊果酸高剂量组1.56
±
0.241.12
±
0.283.68
±
0.34
[0046]
(5)定量rt-pcr检测腹主动脉sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3基因表达水平，按总rna试剂盒(dp419)说明书提取总rna，并按说明书将rna反转录合成cdna，取逆转录产物进行pcr循环。pcr扩增条件为：95℃10s，以后95℃15s，60℃60s循环40次。sirt1上游引物：5'-ccagatcctcaagccatgt-3'，下游引物：5'-ttggattcctgcaacctg-3'，扩增片段长度216bp；abca1上游引物：5
’‑
gattggcttcaggatgtccatgttggaa-3’，下游引物5
′‑
gtatttttgcaaggctaccagttaca tttgacaa-3
′
，扩增片段长度196bp；tlr2上游引物：5
’‑
tcaaaagtcgatcggcgacat-3，下游引物：5
’‑
tacccagctcgc tcatcacgt-3，扩增片段长度102bp；tlr4上游引物：5'-agacctgtccctgaaccctat3
′
，下游引物：5
′
cgatggacttctaaaccagcca3
′
，扩增片段长度144bp；β-actin内参序列如下：上游引5
′‑
atatcgctgcg2c10gtcgtc-3'，下游引物5
′‑
aggtggcgtgagggagagc-3'，扩增片段长度186bp；反应结束后，取反应产物10μl进行2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶图像分析系统摄图，并分析各组目的基因及内参基因的灰度值，以二者的比值代表基因mrna的表达。
[0047]
结果(见图3与图4)：ua对动脉粥样硬化apoe-/-小鼠腹主动脉sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3基因表达的影响
[0048]
采用按总rna试剂盒(dp419)说明书提取总rna，将rna反转录合成cdna，取逆转录产物进行pcr循环，结果显示空白对照组sirt1mrna、abca1mrna、lrxmrna、tlr2mrna和irf3mrna均表达下调；与空白对照组和模型组比较，ua低剂量、ua中剂量和ua高剂量组sirt1mrna、abca1mrna、lrxmrna、tlr2mrna和irf3mrna表达上调(p《0.01)，呈一定剂量依赖性；与立普妥组比较，低剂量、中剂量和高剂量组ua均上调；与ua低剂量和ua中剂量组比较，ua高剂量组lrxmrna、tlr2mrna和irf3mrna表达均上调。(6)westernblot检测腹主动脉sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达水平，将收集的细胞按常规方法提取总蛋白，采用bca蛋白浓度分析试剂盒测定蛋白浓度。取20μg蛋白质进行垂直电泳、转膜，5％脱脂牛奶封闭后分别加特异性一抗sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3(兔抗小鼠lrx抗体、兔抗小鼠tlr2单克隆抗体、兔抗小鼠sirt-1抗体、兔抗小鼠abca1抗体、兔抗小鼠tlr4抗体和兔抗小鼠irf3抗体)，稀释浓度为1：200和β-actin(1：200)，室温摇床孵育2h，分别加入相应的二抗(含辣根过氧化酶标记的羊抗兔ig)，室温孵育1h，ecl显影。结果用lab-work凝胶图像分析系统对胶片扫描，以对照组的面积灰度值为100与实验组进行比较和半定量分析。
[0049]
结果(见图5与图6)：熊果酸(ua)对动脉粥样硬化apoe-/-腹主动脉sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达的影响
[0050]
在37℃，5％co2的条件下，用含50mg/lox-ldl的培养液培养raw264.7巨噬细胞48h，诱导其成为泡沫细胞，加入不同浓度10mg/l、15mg/l和20mg/lua作用于raw264.7巨噬细胞源性泡沫细胞24h后，采用western blotting法检测sirt1、abca1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达，结果显示随着ua的浓度增加，sirt1、abca1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达逐渐增强。
[0051]
综上，在体内实验中，血脂水平ldl-c、tg、tc显著降低(p《0.05)而hdl-c水平显著增加ua低剂量，ua高剂量组(p《0.05)以剂量依赖的方式与空白对照组和模型组(p《0.01)，表明ua有降脂作用。腹主动脉he染色结果显示，ua可显著减少胆固醇的沉积，同时促进胆固醇的流出。与模型组相比，低、中、高剂量ua泡沫细胞组的胆固醇外排率显著降低(p《0.01)。此外，ua低剂量组、ua中剂量组、ua高剂量组血清和肝脏中的3h含量显著降低(p《0.01)。与模型组相比，粪便中3h含量逐渐增加(p《0.01)，而阿托伐他汀组增加12％，说明ua可加速胆固醇外排。通过rt-pcr检测腹主动脉标本中sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3，ua低剂量、ua中剂量、ua高剂量组中sirt1mrna、lrxmrna、irf3mrna、abca1mrna、tlr2mrna和tlr4mrna的表达呈剂量依赖性增加(p《0.01)。这些结果表明，与对照组和模型组相比，ua低剂量、ua中剂量、ua高剂量组中sirt1mrna、lrxmrna、irf3mrna、abca1mrna、tlr2mrna和tlr4mrna的表达显著上调(p《0.01)，且呈剂量依赖性。ua低剂量组与阿托伐他汀组无显著性差异。
[0052]
实施例2：体外实验
[0053]
(1)胆固醇的氧化修饰及鉴定
[0054]
用ph7.2，0.01mol
·
l-1
磷酸盐缓冲液(pbs)将ldl浓度调整为1.6g
·
l-1
，加入cuso4使ldl溶液终浓度为10μmol
·
l-1
，37℃氧化12h，将溶液装入透析袋，将终浓度为0.5mmol
·
l-1
的乙二胺四乙酸(edta)加入pbs溶液中，4℃条件下透析24h以终止氧化。用0.45m滤膜过滤除菌，bca试剂定量蛋白。调整蛋白浓度至1g
·
l-1
，4℃保存备用。
[0055]
(2)细胞培养及实验分组
[0056]
在37℃，5％co2的条件下，将raw264.7小鼠巨噬细胞株放置在含10％胎牛血清的dmem培养基中，待细胞进入对数生长期时，接种至9孔培养板，4ml/孔(即细胞密度为4
×
l05个/孔)，用含20mg
·
l-1
低密度脂蛋白(ox-ldl)的培养液培养48h，诱导其成为泡沫细胞。实验组分为空白对照组、模型组、阿托伐他汀组、熊果酸低剂量组10mg
·
l-1
、熊果酸中剂量组15mg
·
l-1
和熊果酸高剂量组20mg
·
l-1
，ua组用10，15，20mg
·
l-1
的ua孵育细胞24h；阿托伐他汀组用1mg/(kg
·
d)的阿托伐他汀孵育细胞24h，其余均不做处理。
[0057]
(3)油红o染色
[0058]
raw264.7小鼠巨噬细胞株诱导其成为泡沫细胞后，将培养基中的培养液吸收，用pbs液冲洗3遍，加50％甲醛固定30min，稀释油红储存液，染色10min左右，6孔加1.5ml，用75％乙醇/60％异丙醇漂洗，除去多余的染料，苏木染色5min，pbs漂洗，水性封片剂封片。显微镜下观察并拍照收集图像。
[0059]
结果：油红o染色a.油红o染色法显示熊果酸对泡沫细胞形成的影响。结果显示，与对照组和模型组相比，细胞内脂滴颗粒降低了ua低剂量组、ua中剂量组和ua高剂量组(p《0.05)
[0060]
(4)细胞生存率检测
[0061]
raw264.7细胞接种于6孔培养板，接种密度为4
×
l05/孔，细胞生存率检测采用mtt法。各实验组处理后，加入mtt使其终浓度为0.5g
·
l-1
，37℃培养箱内孵育4h，加入助溶剂dmso，使甲瓒颗粒完全溶解，酶标仪波长570nm测定吸光度od值。
[0062]
(5)胆固醇流出率的测定
[0063]
胆固醇流出率按文献方法测定，raw264.7细胞用含50mg
·
l-1
ox-ldl的培养液诱导48h，经过实验处理24h后收集培养液，800r
·
min-1
离心5min，去除细胞碎片，于-80℃冻存，为培养液放射强度的检测样品。细胞用pbs液洗3遍，加入0.1mol
·
l-1
naoh200μl，反复冻融3次裂解细胞，为细胞裂解物放射强度的检测样品。各样品经bca试剂定量蛋白后，加入7.2％三氯乙酸沉淀蛋白，正己烷和无水乙醇抽提，真空干燥，闪烁液溶解，液体闪烁计数仪检测培养液和细胞裂解物的放射强度。胆固醇流出率＝培养液放射强度/(培养液放射强度+细胞裂解物放射强度)
×
100％
[0064]
泡沫细胞生存率结果显示10、15、20mg
·
l
－
3个剂量组ua的生存率与空白组比较差异无统计学意义，对raw264.7巨噬细胞生存率无明显影响，说明在10，15，20mg
·
l
－1
质量浓度下熊果酸对raw264.7巨噬细胞无显著的毒性，因此后续实验选取10，15，20mg
·
l
－1
这3个剂量的ua，以保证细胞处于完好状态；胆固醇流出率检测结果显示泡沫细胞胆固醇流出率随ua质量浓度增加而逐渐增加，与空白组比较差异有统计学意义(p＜0.01)。见图7
[0065]
表3熊果酸对泡沫细胞生存率、胆固醇流出率(n＝4)
[0066]
组别剂量/mg
·
l
－1
a胆固醇流出率/％
空白－1.10
±
0.076.12
±
0.07模型组－1.13
±
0.046.34
±
0.06阿托伐他汀1mg/(kg
·
d)1.09
±
0.128.09
±
0.121)熊果酸低剂量组151.11
±
0.099.11
±
0.241，2)熊果酸中剂量组201.13
±
0.0712.13
±
0.271，2，3)熊果酸高剂量组251.12
±
0.0612.67
±
0.321，2，3，4)
[0067]
注:与空白组比较1)p＜0.01；与10mg
·
l－1组比较2)p＜0.01；与15mg
·
l－1组比较3)p＜0.01；与20mg
·
l－1组比较4)p＜0.01；与25mg
·
l－1组比较5)p＜0.01。
[0068]
(6)熊果酸(ua)对raw264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇酯含量的影响1200r
·
min-1
离心5min，弃上清收集细胞，加入80μl无水乙醇，超声10s，工作10次，功率160w，总胆固醇超声提取完毕后，1万r
·
min-1
离心5min，将上清液转移至新的ep管中，细胞内脂质含量按照脂质测定试剂盒说明书分别测定总胆固醇(tc)及游离胆固醇(fc)的含量，胆固醇酯(ce)含量即为tc和fc之差值。
[0069]
20mg
·
l-1
ox-ldl诱导raw264.7细胞后，细胞内胆固醇酯和总胆固醇显著增加了胆固醇酯，总胆固醇比值达到47.62％。经ua干预后，总胆固醇(tc)和胆固醇酯与总胆固醇(ce)的比值下降，并存在一定的剂量效应关系。与空白对照组和模型组相比，ua组的tc与ce组相比明显下降，如图7所示。
[0070]
(7)rt—pcr检测腹主动脉sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3基因表达
[0071]
按总rna试剂盒(dp419)说明书提取总rna，并按说明书将rna反转录合成cdna，取逆转录产物进行pcr循环。pcr扩增条件为：95℃10s，以后95℃15s，60℃60s循环40次。sirt1上游引物：5'-ccagatcc tcaagccatgt-3'，下游引物：5'-ttggattcctgcaacctg-3'，扩增片段长度216bp；abca1上游引物：5
’‑
gattg gcttcaggatgtccatgttggaa-3’，下游引物5
′‑
gtatttttgcaa ggctaccagttaca tttgacaa-3，扩增片段长度196bp；tlr2上游引物：5
’‑
tcaaaagtcgatcggcgacat-3’，下游引物：5
’‑
taccca gctcgctcatcacgt-3’，扩增片段长度102bp；tlr4上游引物：5'-agacctgt ccctgaaccctat3
′
，下游引物：5
′‑
cgatggacttctaaaccagcca3
′
，扩增片段长度144bp；β-actin内参序列如下：上游引5
′‑
atatcgctgcgct ggtc gtc-3'，下游引物5
′‑
agg tggcgtgagggagagc-3'，扩增片段长度186bp；反应结束后，取反应产物10μl进行2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶图像分析(图8),并分析各组目的基因及内参基因。
[0072]
如图8-9所示的熊果酸对巨噬细胞源性泡沫细胞中sirt1、abca1、lrx、tlr2、tlr4和irf3基因表达的影响
[0073]
使用总rna试剂盒(dp419)说明书，从raw 264.7巨噬细胞源性的泡沫细胞中提取总rna，持续24h。结果显示，与空白对照组和模型相比，随着ua浓度的增加，sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3基因的表达量显著增加。空白对照组和模型组中sirt1mrna、lrxmrna、abca1mrna、tlr2mrna、tlr4mrna和irf3mrna的基因表达均明显(p《0.01)。见图9。
[0074]
(8)western blot法检测腹主动脉sirt1、lxr、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达
[0075]
收集到的细胞采用常规方法提取总蛋白，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。采取20μg蛋白质垂直电泳，转染，5％脱脂牛奶被阻止与特定抗sirt1，lxr、abca1、tlr2、tlr4和irf3稀释1：200和β-actin(1：200)在室温下2小时。相应的二抗(包括辣根过氧化物
酶标记的山羊抗兔ig)，在室温下孵育1h，形成ecl。结果表明，采用实验室工作的凝胶图像分析系统对薄膜进行了扫描。对照组的面积灰度值为100，并采用半定量分析。
[0076]
如图10-11，熊果酸对巨噬细胞源性泡沫细胞中sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白表达的影响
[0077]
westernblot检测sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3蛋白的表达。随着ua浓度的增加，sirt1、pparγ、ncor和smrt的蛋白表达量逐渐增加。与对照组和模型组相比，sirt1、lrx、abca1和irf3蛋白表达γ显著升高(*p《0.05)。各组数据均显示，随着ua浓度的增加，tlr4和irf3的蛋白表达均表达上调(p《0.05)。与对照组和模型组相比，sir t1和abac1蛋白的表达随着ua浓度的增加而上调(*p《0.05)，如图11。
[0078]
综上，在体外实验中，用20mg
·
l-1
ox-ldl诱导raw264.7细胞成为泡沫细胞，细胞内胆固醇酯和总胆固醇显著升高，胆固醇酯与总胆固醇的比值达到47.62％。经ua干预后，细胞内总胆固醇(tc)、胆固醇酯和总胆固醇(ce)呈剂量依赖性下降。与空白对照组相比，模型组、阿托伐他汀组、ua低剂量组、ua中剂量组、ua高剂量组的tc和ce比值显著降低。细胞用10、15或20mg
·
l-1
ua24 h后，结果显示，与空白对照组和模型组相比，sirt1、lrx、abca1、tlr2、tlr4和irf3基因表达显著增加，表明ua通过基因表达上调促进胆固醇外流和减少胆固醇酯沉积。ua低剂量组、ua中剂量组、ua高剂量组中sirt1mrna、lrxmrna、irf3mrna、abca1mrna、tlr2mrna和tlr4mrna的蛋白表达量随ua浓度的增加而逐渐增加(p《0.01)。
[0079]
总之，虽然药物数据分析显示ua在预防动脉粥样硬化方面更有效，ua减少主动脉弓动脉粥样硬化斑块形成，减少53％的动脉损伤，但它也与ua介导的动脉粥样硬化抵抗有关。我们用不同浓度的ua在体外干预处理raw264.7巨噬细胞来源的泡沫细胞，并用实时荧光定量pcr和蛋白印迹法证实了sirt1mrna、lrxmrna、abca1mrna、tlr2mrna、tlr4mrna和irf3mrna对动脉粥样硬化的调控机制。发现它们的调节机制在ua抗动脉粥样硬化中作用。过多胆固醇可使巨噬细胞变成泡沫细胞(促进动脉粥样硬化发生),在被巨噬细胞吞噬掉的游离胆固醇有两种命运：一是通过三磷酸腺苷结合盒转运体超家族的abca1和abcg1等介导的胆固醇流出，由hdl逆向转运至肝脏以胆汁的形式排出体外。二是在逆向转运受限的情况下多余的游离胆固醇在胆固醇酰基转移酶a1(acat1)的催化作用下合成胆固醇酯，进而形成脂滴储存下来。在人单核细胞和巨噬细胞上的tlr2或tlr下游肿瘤坏死因子(tnf-a)的激活可上调acat1的表达，从而促进游离胆固醇的酯化增加胆固醇酯的蓄积。此外，tlrs以及它的配体可能对胆固醇的流出也有所影响。实验证明介导胆固醇流出的abca1和abcg1基因受转录因子lxr调控。tlr2和tlr4的下游分子irf-3的激活可抑制lxrs的转录活性，使abca1、abcg1的基因表达下调，促进游离胆固醇的酯化，抑制胆固醇逆转运。
[0080]
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性发明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

技术特征：
1.tlr2/4-irf3信号通路在开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物促进tlr2/4-irf3信号通路高表达。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物能够使tlr2/4和irf3的蛋白表达上调，tlr2/4和irf3的mrna相对表达水平升高。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过基因表达上调，促进胆固醇外流，减少胆固醇酯沉积。5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述促进tlr2/4-irf3信号通路高表达的药物为熊果酸ua,泡沫细胞胆固醇流出率随ua质量浓度增加而逐渐增加。

技术总结
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及TLR2/4-IRF3信号通路在开发或筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，提出TLR2/4-IRF3信号通路在开发或筛选用于预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物，该药物能够使TLR2/4和IRF3的蛋白表达上调，TLR2/4和IRF3的mRNA相对表达水平升高，进而促进胆固醇外流，减少胆固醇酯沉积，从而能够进行有效的治疗动脉粥样硬化同时降低副作用、改善患者生存质量。存质量。存质量。


技术研发人员：王波 贾静 张维明 俞华 余珊
受保护的技术使用者：昆明学院
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/10/15