调控马铃薯块茎的多肽基因StUCG5P及其应用的制作方法

调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术和马铃薯育种技术领域，具体涉及一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p及其应用。


背景技术：

2.马铃薯(solanum tuberosum l.)是我国仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物。全球有2/3以上的国家种植马铃薯，产量在32千万吨左右。据2021年联合国粮食及农业组织统计，我国马铃薯种植面积达4606千公顷，年均产量达到8000万吨，位于世界前列。
3.块茎作为马铃薯的主要收获器官，块茎的产量和品质影响了其经济价值。马铃薯块茎的形成和发育机制一直是科学家们关注的焦点。马铃薯块茎由地下匍匐茎亚顶端膨大形成，匍匐茎的发生、伸长及亚顶端的膨大都影响着块茎的形成。一般情况下，匍匍茎的成薯率为50％～70％，随着匍匍茎的增多，形成的块茎也相应的增多。马铃薯从匍匐茎到块茎的转变是一个重要的发育阶段，除了受自身遗传的影响外，还受许多外部条件(光照、光周期、水分、温度等)和内部因素(内源激素、碳水化合物等)的调控。研究表明，短日照、凉爽的温度、高光照强度、高蔗糖和低施氮量会促进马铃薯块茎的形成；而长日照、高温、低光照强度和高施氮量则延迟马铃薯的块茎形成。植物激素的变化在匍匐茎和块茎形成发育中起着重要调节作用。一般认为，赤霉素(ga)能刺激匍匐茎伸长，抑制块茎形成，而脱落酸(aba)抑制匍匐茎伸长，刺激块茎形成，细胞分裂素(ck)能够起始新的块茎，高浓度发挥抑制作用，低浓度则发挥促进作用，生长素(iaa)则是促进块茎的纵向伸长和横向扩展。相对于其它激素，ga和aba在匍匐茎和块茎形成发育中发挥着至关重要的功能。长日照(long-days,lds)下，匍匐茎中的ga水平含量保持在较高水平，aba含量较低，有利于其伸长；而在短日照(sds)下，ga水平在匍匐茎向块茎过渡开始时下降，aba含量升高，诱导块茎形成。其他研究报道也表明块茎的形成受到ga3的阻碍，而施用ga生物合成抑制剂则促进块茎的形成。
4.近年来，研究人员基于不同的影响因子，解析出了结薯的初步调控网络，但很少有关于小分子物质，特别是多肽在马铃薯生长发育方面的报道。因此，探索马铃薯自身多肽在匍匐茎发生、块茎起始和形成等方面的功能及分子作用机制，可为马铃薯块茎形成调控网络增加新的见解，也为马铃薯生产和良种繁育提供理论支持。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于提供一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
7.本发明提供了一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p，其cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明还提供了一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p在马铃薯块茎改良育种中的应用，所述多肽基因stucg5p的cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码
79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.进一步地，所述应用为在马铃薯中超量表达多肽基因stucg5p提高马铃薯块茎的数量。
10.本发明还提供了上述调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明还提供了上述调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p编码的蛋白在提高马铃薯块茎的数量中的应用。
12.本发明还提供了上述调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p的重组表达载体。
13.进一步地，所述重组表达载体为stucg5p超量表达载体。
14.进一步地，所述重组表达载体以pcambia1300-egfp载体为骨架。
15.本发明还提供了上述调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p的重组表达载体在马铃薯块茎改良育种中的应用。
16.进一步地，所述应用为将调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p的超量表达载体采用农杆菌转化法遗传转化到马铃薯中获得stucg5p超量表达转基因株系，所获得的stucg5p超量表达转基因株系的匍匐茎发生数量和长度以及块茎数量增加。
17.本发明还提供了一种提高马铃薯块茎数量的方法，所述方法为通过在马铃薯中超量表达stucg5p提高块茎的数量，其中，所述stucg5p的cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。
18.进一步地，所述方法为以pcambia1300-egfp为骨架，构建stucg5p超量表达载体，采用农杆菌转化法遗传转化到马铃薯中获得stucg5p超量表达的转基因株系，所获得的stucg5p超量表达转基因株系的匍匐茎发生数量和长度以及块茎数量增加。
19.本发明的过程为：发明人从马铃薯不同组织部位的转录组数据中筛选到一个在花、成熟果实和块茎芽中表达量较高的多肽基因，编号(soltu.dm.04g033200.1)，命名为stucg5p，该多肽基因在spud db中的注释为uncharacterized protein(2023年注释)或g5
20.domain-containing protein(2022年注释)，spud db中搜索结果显示stucg5p基因全长398bp，含2个外显子和1个内含子，cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。通过signalp-5.0和tmhmm-2.0在线网站分别对stucg5p基因的蛋白序列进行信号肽和跨膜结构域的预测，结果显示，该基因编码的蛋白无信号肽和跨膜结构域。通过亚细胞定位，结果显示目的多肽基因定位于细胞核和细胞质中。为了进一步研究其功能，利用农杆菌侵染的方法进行马铃薯遗传转化获得超量表达转基因株系，通过表型分析发现，stucg5p在匍匐茎发生数量和长度、块茎发生数量以及试管薯发生时间上有促进作用，相较于野生型而言，超量表达株系的匍匐茎发生数量和长度、块茎发生数量增加，短日照下试管薯发生时间提前。
21.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p及其应用，所述多肽基因stucg5p的cds序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，序列如seq id no.2所示，该基因编码蛋白定位于细胞核和细胞质中，通过增加匍匐茎发生数量和长度来增加块茎发生数量，并能够在短日照下促进试管薯发生时间提前。这为马铃薯块茎形成调控网络提供了新的见解，对解析马铃薯块茎形成的分子机制具有重要意义，也为马铃薯生产和良种繁育提供了理论支持和新的材料。
附图说明
22.图1为stucg5p基因结构展示。
23.图2为stucg5p及其同源基因进化分析；其中a为蛋白序列比对；b为进化树。
24.图3为stucg5p表达模式分析；其中a和b为stucg5p在dm和rh品种中不同组织部位的rna-seq数据；c为stucg5p在rh品种中不同组织部位的qrt-pcr数据。
25.图4为stucg5p亚细胞定位。
26.图5为stucg5p超量转基因株系鉴定；其中图a为stucg5p超量转基因株系pcr鉴定结果，泳道1为阳性对照，泳道2和3分别为水和野生型阴性对照；图b为野生型和stucg5p超量转基因株系qrt-pcr鉴定；图c为野生型和stucg5p超量转基因株系的western-blot结果。
27.图6为stucg5p超量转基因株系70d龄匍匐茎表型；其中a为马铃薯植株地下匍匐茎表型图；b为主匍匐茎数目统计；c为次级匍匐茎统计；d为主匍匐茎总长统计；e为主匍匐茎平均长度统计。
28.图7为stucg5p超量转基因株系70d龄结薯表型；其中a为10株马铃薯植株总结薯表型图；b为单株结薯数目统计；c为单株薯重统计；d为10株总产量统计。
29.图8为短日照下stucg5p超量转基因株系试管薯表型；其中a为90d时49株总共结试管薯表型；b为从55d-80d过程中49株试管苗总结薯变化；c为各株系90d时试管薯总产量。
具体实施方式
30.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。需要说明的是，本发明实施例中未注明实验材料来源的实验材料均能商业获得，本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验方法或按照实验材料厂商建议方法进行。另外，需要说明的是本发明中所述的马铃薯e3为鄂马铃薯3号。
31.实施例1stucg5p的序列特征和进化分析
32.发明人从马铃薯不同组织部位的转录组数据中筛选到一个在花、成熟果实和块茎芽中表达量较高的多肽，编号(soltu.dm.04g033200.1)，命名为stucg5p，通过spud db(http://spuddb.uga.edu/)搜索，结果显示stucg5p基因全长398bp，含2个外显子和1个内含子，cds序列长240bp，编码79个氨基酸(图1)。通过signalp-5.0和tmhmm-2.0在线网站分别对stucg5p基因的蛋白序列进行信号肽和跨膜结构域的预测，结果显示，该基因编码的蛋白无信号肽和跨膜结构域。
33.用该基因编码的蛋白序列为源序列，分别在ncbi和phytozome网站进行blast，共得到13个物种共18条序列。将这18条序列进行同源序列对比并用nj法构建进化树，结果显示这些序列在c端较保守(图2a)，18条蛋白序列分为两大分支，在第一大分支中，全部为茄科植物，stucg5p与番茄中序列同源性最高，其次为辣椒、烟草和曼陀罗，该基因在茄科中较为保守(图2b)。
34.实施例2stucg5p表达模式分析
35.pgsc中不同组织部位的rna-seq数据显示，stucg5p基因在花、成熟果实和块茎芽中表达较高(图3a和3b)，qrt-pcr结果也显示在花中表达最高，其次为叶片(图3c)。为了探
究stucg5p蛋白在细胞中的定位，构建了由camv35s启动的pcambia1300-stucg5p-egfp载体，通过农杆菌注射烟草进行亚细胞定位，结果显示stucg5p定位在细胞核和细胞质上(图4)。
36.实施例3马铃薯超量表达株系的获得
37.为了深入研究stucg5p在马铃薯中的功能，以pcambia1300-egfp为骨架构建了stucg5p的超量载体。以e3试管薯为受体，通过农杆菌介导进行遗传转化。经基因组pcr鉴定后共获得14个阳性超量株系(图5a)，采用qrt-pcr对超量株系表达水平进行鉴定，结果显示与对照(wt)相比，超量株系转录水平都在100倍以上，最高达到了4000多倍(图5b)。通过western-blot对超量株系中转入的带gfp标签的stucg5p蛋白表达水平进行检测，结果显示，超量株系中转入的stucg5p基因成功表达出了蛋白(图5c)。
38.实施例4表型鉴定
39.(1)超量表达stucg5p促进马铃薯匍匐茎发生和长度
40.为了研究超量表达stucg5p后对马铃薯结薯方面的影响，使用收获的小薯发芽后移栽于大盆中，于生长室(16h光/8h暗，22℃/18℃)进行正常生长。70d时进行收获，统计地下匍匐茎发生数量、长度以及块茎数目和重量。结果显示，超量株系的主匍匐茎(图6a和6b)和次级匍匐茎发生数量(图6a和6c)都极显著高于wt株系。并且，超量株系的主匍匐茎总长度也极显著高于wt株系(图6a和6d)，平均长度显著或极显著高于wt株系(图6e)，说明stucg5p在马铃薯匍匐茎发生数量、长度上有促进作用，超量表达stucg5p将促使匍匐茎发生数量和长度增加。
41.(2)超量表达stucg5p提高马铃薯结薯率
42.对(1)中收获的70d大小的地下块茎进行统计，结果显示，超量表达stucg5p株系的单株结薯数高于或显著高于wt株系(图7a和7b)，但单株薯重极显著低于wt株系(图7c)。对10株块茎总重进行统计，发现超量株系总产量也低于wt株系(图7d)。表明stucg5p在马铃薯块茎发生上有促进作用，超量表达stucg5p将促使马铃薯块茎数量的增加。
43.(3)超量表达stucg5p促进马铃薯试管薯的发生
44.为了探索超量表达stucg5p对马铃薯试管薯发生的影响，通过8％蔗糖的ms固体培养基在短日照下(8h光/16h暗，22℃/18℃)进行试管薯诱导结薯，各株系7瓶，每瓶7株茎段，共49株试管苗，从55d开始统计每瓶结薯数目。两超量株系结薯起始时间早于wt株系，试管薯达到30个时，wt所需时间(70d左右)远高于oe-6(63d左右)和oe-84(57d左右)株系；80d时，oe-6和oe-84株系结薯数远高于wt株系(图8b)。90d时，收获试管薯后统计每瓶总产量，结果显示，超量株系每瓶薯重也显著和极显著高于wt株系(图8a和8c)。表明stucg5p在短日照下马铃薯试管薯发生中发挥促进作用，超量表达stucg5p在短日照下将促使马铃薯试管薯的结薯时间提前。
45.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p，其cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。2.一种调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p在马铃薯块茎改良育种中的应用，其特征在于，所述多肽基因stucg5p的cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为在马铃薯中超量表达多肽基因stucg5p提高马铃薯块茎的数量。4.权利要求1所述的调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。5.权利要求4所述的蛋白在提高马铃薯块茎的数量中的应用。6.权利要求1所述的调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p的重组表达载体。7.权利要求6所述的调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p的重组表达载体在马铃薯块茎改良育种中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为将调控马铃薯块茎的多肽基因stucg5p的超量表达载体采用农杆菌转化法遗传转化到马铃薯中获得stucg5p超量表达转基因株系，所获得的stucg5p超量表达转基因株系的匍匐茎发生数量和长度以及块茎数量增加。9.一种提高马铃薯块茎数量的方法，其特征在于，所述方法为通过在马铃薯中超量表达stucg5p提高块茎的数量，其中，所述stucg5p的cds序列长240bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码79个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法为以pcambia1300-egfp为骨架，构建stucg5p超量表达载体，采用农杆菌转化法遗传转化到马铃薯中获得stucg5p超量表达的转基因株系，所获得的stucg5p超量表达转基因株系的匍匐茎发生数量和长度以及块茎数量增加。

技术总结
本发明公开了一种调控马铃薯块茎的多肽基因StUCG5P及其应用，所述多肽基因StUCG5P的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码79个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示，该基因编码蛋白定位于细胞核和细胞质中，通过增加匍匐茎发生数量和长度来增加块茎发生数量，并能够在短日照下促进试管薯发生时间提前，这为马铃薯块茎形成调控网络提供了新的见解，对解析马铃薯块茎形成的分子机制具有重要意义，也为马铃薯生产和良种繁育提供了理论支持和新的遗传材料。良种繁育提供了理论支持和新的遗传材料。良种繁育提供了理论支持和新的遗传材料。


技术研发人员：荐红举 刘溶荣 吕典秋 李燕 吴林 黎茵
受保护的技术使用者：西部（重庆）科学城种质创制大科学中心
技术研发日：2023.08.25
技术公布日：2023/10/20