一种具有信号蛋白标签的Ki-67生物融合酶抗体及应用的制作方法

一种具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体及应用
技术领域
1.本发明涉及免疫学疾病诊断技术领域，具体为一种具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体及应用。


背景技术：

2.ki-67蛋白作为肿瘤细胞增殖活性的可靠标记，被认为是较为理想的检测细胞增殖活性的指标之一，ki-67 的阳性率越高，说明处于生长期的肿瘤细胞比例越高，肿瘤生长越快。在临床应用上，ki-67表达还可以用于判断患者化疗是否敏感，通常对化疗敏感的都是处于细胞生长周期的细胞，所以，ki-67 阳性率高的肿瘤，往往对化疗更加敏感，化疗效果会好。ki-67这些临床上的应用都必须通过免疫组织化学或免疫细胞化学技术（ihc)来实现。
3.但是目前通用的的ki-67免疫组化试剂盒存在如下缺点：1、操作时间长，需要3-5h，甚至过夜才能给出检测报告，给临床应用带来了很多麻烦，给患者造成了更大的经济负担。2、信号检测都是通过在抗体上化学偶联hrp等信号酶来实现的，但是偶联效率不好控制，抗体批次间差异比较大；偶联得率很低，在50-60%左右，对抗体造成很大的浪费。因此临床上亟需一种快速、准确的针对ki-67靶标检测的免疫组化试剂盒。
4.随着分子生物学技术的发展，现在技术上可以允许将信号蛋白酶与抗体进行融合，得到生物酶融合抗体。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题为：ki67抗体化学偶联信号蛋白hrp存在异质性反应；偶联效率低信号差，批次间差异大，造成抗体浪费严重；需要借助二抗来放大信号导致检测时间长。本发明通过利用产生的igg抗体含信号蛋白hrp标签的转基因小鼠，制备一种含信号蛋白hrp标签的ki-67生物融合酶抗体，即hrp
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ki67抗体，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体，所述抗体的重链可变区为seq id no：1所示的氨基酸序列，轻链可变区为seq id no：2所示的氨基酸序列。
7.一种编码所述的具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体的dna分子。
8.优选的，所述dna分子的核苷酸序列中，编码所述抗体重链的核苷酸序列如seq id no ：3所示，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如seq id no：4所示。
9.一种表达载体，所述表达载体含有所述的dna分子。
10.优选的，所述表达载体包括质粒、病毒来源的载体。
11.优选的，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
12.一种细胞，所述细胞由所述的表达载体转化得到，所述细胞包括原核细胞、真核细
胞。
13.一种制备所述的具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体的方法，所述方法包括：a)提供一个表达载体，该表达载体含有所述的dna分子序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得所述的抗体。
14.所述的一种具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体应用于ki-67靶标检测的免疫组化试剂盒。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)与ki67抗体通过异质化学偶联hrp不同，hrp
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ki67抗体是一个完全随抗体一起分泌的分子，没有任何异质性反应；(2) hrp
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ki67抗体具有严格的信号/抗体计量学，可以很好的控制信号强度，大大降低了批次间差异且节约抗体的用量，缩减了成本；(3) hrp
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ki67抗体无需标记二抗，简化了免疫分析程序，提高了检测效率。
附图说明
16.图1为构建转基因动物插入的信号蛋白位置示意图；图2为实施例一中方案一构建质粒图谱；图3为实施例一中方案二构建质粒图谱；图4为mab001
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mab004的免疫组化实验结果；图5中a为优化方案
①
的sds-page图；b为优化方案
②③
的sds-page图；图6中a为hrp-ki67抗体检测乳腺癌组织石蜡切片x10；b为hrp-ki67抗体检测乳腺癌组织石蜡切片x20；c为不加hrp-ki67抗体检测乳腺癌组织石蜡切片x10；图7中a为hrp-ki67抗体检测肺癌组织冰冻切片x10；b为hrp-ki67抗体检测肺癌组织冰冻切片x20；c为不加hrp-ki67抗体检测肺癌组织冰冻切片x10；图8中a为hrp-ki67抗体检测肺癌组织石蜡切片x10；bhrp-ki67抗体检测肺癌组织石蜡切片x20；c为不加hrp-ki67抗体检测肺癌组织石蜡切片x10。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例1 ：构建并验证产生的抗体含有hrp标签的转基因小鼠平台。
19.（1）构建。
20.方案一：针对选定的辣根过氧化物酶hrp基因设计引物、构建质粒和donor vector，通过foki二聚体的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的辣根过氧化物酶hrp基因，并将信号蛋白插入轻链的n端，即在atg起始密码子之后，构建的靶向载体质粒图谱具体见图2。具体操作过程按照《分子克隆实验室手册第四版》进行操作，针对选定的辣根过氧
化物酶hrp基因核酸序列，并根据该蛋白结构特点进行了密码子优化，将优化后的序列合成并构建到真核表达载体pcdna3.1（+）中，将构建好的哺乳动物细胞表达载体通过微注射到受精卵的原核，然后将受精卵注射的囊胚植入小鼠的输卵管，以产生敲入转基因动物。
21.方案二：针对选定的辣根过氧化物酶hrp基因设计引物、构建质粒和donor vector，通过foki二聚体的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的辣根过氧化物酶hrp基因，并将信号蛋白插入到轻链的c端，即在终止密码子之前，构建的靶向载体质粒图谱具体见图3。具体操作过程按照《分子克隆实验室手册第四版》进行操作，针对选定的辣根过氧化物酶hrp基因核酸序列，并根据该蛋白结构特点进行了密码子优化，将优化后的序列合成并构建到真核表达载体pcdna3.1（+）中，将构建好的哺乳动物细胞表达载体通过微注射到受精卵的原核，然后将受精卵注射的囊胚植入小鼠的输卵管，以产生敲入转基因动物。
22.表1 构建使用的引物
23.（2）验证：设计如下实验进行验证，选取普通6-8周龄雌性balb/c小鼠做为对照组，选取将hrp标签插入轻链的n端，即在atg起始密码子之后的转基因小鼠做为实验组一，选取将hrp标签插入到轻链的c端，即在终止密码子之前的转基因小鼠做为实验组二，同时用卵清蛋白ova（购自lionexgmbh德国）做为免疫原，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化100μg ，共200μl/只。14天后进行第二次加强免疫，方法为取50μg卵清蛋白ova用弗氏不完全佐剂乳化，共200μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在7天后，方法与第二次加强免疫相同。一周后取小鼠尾血清进行elisa实验，实验方法为将三组实验取得小鼠血清直接按照1：500、1：1000、1：2000用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板，37℃孵育2小时后，加tmb显色液直接显色，终止显色后，用酶标仪测定od450读数，结果如表2所示。
24.表2 elisa检测结果（od450)
25.结果显示：实验组一获得的小鼠产生的igg抗体含有hrp标签，并且随着抗体稀释比例加大，仍然能检测出信号值，说明hrp有很强的信号显示作用；实验组二获得的小鼠产生的igg抗体也含有hrp标签，但是随着抗体稀释比例加大，检测出的信号值较微弱，不能满足后续应用；而对照组小鼠产生的igg抗体不带有hrp信号，用tmb显色液完全没有显色反
应，随着抗体稀释比例的变化信号值也没有有强弱体现。
26.实施例2：免疫原的筛选，hrp
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ki67抗体序列的获得。
27.设计四种不同片段的ki67蛋白序列做为免疫原进行实验，分别命名为序列一（seq id no：5），序列二（seq id no：6），序列三（seq id no：7），序列四（seq id no：8），将序列进行多肽合成并制备免疫抗原；以实施例1所搭建的方案1小鼠模型为例，进行免疫-细胞融合-杂交瘤筛选-建立稳株-测序，具体操作步骤如下。
28.a. 小鼠免疫及抗血清检测1)每组选择4只小鼠，对小鼠进行标记并编号，尾静脉采血30~50ul，凝血后离心收集免疫前血清；2) 首免：按每只小鼠免疫量100ug计算所需抗原体积，使用等体积弗氏完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫；3) 二免：两周后进行第二次免疫，按每只小鼠免疫量50ug计算所需抗原体积，使用等体积弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫；4) 三免：两周后进行第三次免疫，按每只小鼠免疫量50ug计算所需抗原体积，使用等体积弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫；5) 血清采集：三免后一周，尾静脉采血30~50ul，凝血后离心收集血清；6) elisa检测血清效价：cb分别包被抗原，终浓度为1ug/ml，100ul/孔，4℃过夜后用0.1%酪蛋白-pbs进行封闭，室温封闭1h后洗板，小鼠血清起始稀释度为1:2000，3倍比稀释，抗体稀释液为空白对照，elisa检测血清效价，酶标仪测定od450读数，效价达到1：54000后方可进行融合。
29.b. 细胞融合1) 至少融合前一周准备小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，调整细胞状态至对数生长期，选择elisa效价最高的小鼠，融合前3天对小鼠进行加强免疫，50ug/只，腹腔注射；2) 融合：取小鼠脾脏，机械破碎后收集脾细胞，200目筛网过滤，pbs洗涤3次；收集sp2/0细胞，pbs洗涤3次；细胞计数后按sp2/0:脾细胞=1:5的比例进行混合，离心后弃去pbs，使用peg进行细胞融合，融合结束，细胞离心后加入含hat的完全培养基，重悬混匀细胞后铺板于96孔板中；3) 换液：融合后7天进行一次完全换液。
30.c. 杂交瘤筛选1）elisa检测：包被抗原，浓度为1ug/ml，融合后8天吸取细胞培养上清进行elisa检测，记录读数大于0.5的孔，做好标记并进行半换液；2）elisa复检及特异性阳性检测：次日对进行补液的阳性孔进行复检与特异性阳性检测，记录效价稳定的克隆号。
31.d. 稳定细胞株建立：1）首次亚克隆：根据特异性阳性检测结果，选择特异性阳性细胞孔进行亚克隆筛选，有限稀释法，完全培养基，按梯度稀释于96孔板中；2）7天后镜下观察，标记出单克隆孔，次日进行elisa检测，舍弃转为阴性的克隆号，对于阳性克隆，挑选生长旺盛的孔进行一次补液；3) 二次亚克隆：从步骤2）中的阳性克隆孔中选择特异性阳性细胞孔进行亚克隆
筛选，有限稀释法，完全培养基，按梯度稀释于96孔板中；4) 7天后镜下观察，标记出单克隆孔，次日进行elisa检测，挑选生长旺盛的单细胞团进行扩大培养，冻存保种。
32.序列一到四经过免疫、融合、筛选、建株得到四种抗体，命名为mab001-mab004，分别进行组织样本检测，实验方法为将不同组织样本提取的蛋白用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板，37℃孵育2小时后，将抗体mab001-mab004加入每孔100ul，37℃孵育1小时后洗板五次，加tmb显色液直接显色并终止显色后，酶标仪测定od450读数，结果如表3所示。
33.表3 ki67抗体mab001-mab004的亲和力测定
34.结论：序列一免疫原制备得到的ki67抗体mab001，亲和力效果最好，特异性高。而mab002-mab004亲和效果差，有非特异性反应。
35.为进一步验证mab001-mab004在免疫组化实验的效果，选择经北京中杉金桥的ki67抗体（产品编号：zm-0166）验证同一份乳腺癌病人石蜡组织的不同切片进行初步验证，北京中杉金桥的ki67抗体操作步骤按照说明书进行：按照标准方法修复抗原后，用ki67一抗孵育：加入最佳稀释浓度的一抗，37℃孵育60分钟，用1xpbs洗3次，每次5分钟；二抗孵育：加入最佳稀释浓度的二抗，37℃孵育 60分钟，用1xpbs洗3次，每次5分钟。本实施例中得到的抗体反应步骤为：用ki67抗体孵育：加入最佳稀释浓度的一抗，37℃孵育3分钟，用1xpbs洗3次，每次0.5分钟。后续显色复染步骤均相同：滴加适量新鲜配制的dab显色液，室温避光显色5-10分钟，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深，自来水冲洗切片终止显色；复染：把切片放入苏木素中复染，孵育1-5分钟左右，过水洗涤三次，用1%盐酸乙醇30秒钟进行快速褪色处理，去离子水冲洗30秒；脱水、透明、封片：将切片依次放入75%酒精浸泡2分钟、85%酒精浸泡2分钟、95%酒精浸泡2分钟(2次)、100%酒精浸泡2分钟、二甲苯浸泡2分钟（2次），中性树脂胶封片；镜检及拍片：用光学显微镜对切片进行成像，拍片，结果如图4所示。
36.通过图4可以看出，在同样的工作浓度及反应条件下，本发明实施例中得到的mab001在免疫组化实验中有比较好的亲和力和特异性。通过图片很清晰的看到mab001能很好的检测到该乳腺癌组织石蜡切片中ki67蛋白，而mab002、mab003检测信号都比较弱，尤其是mab004基本检测不到乳腺癌组织石蜡切片中ki67蛋白。
37.综上所述，最后通过筛选得到最优的抗体是通过序列一免疫得到的ki67抗体mab001，将该抗体细胞株进行测序处理，得到hrp
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ki67抗体序列。
38.实施例3：重组表达hrp
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ki67抗体，通过质粒的优化筛选，使得重组表达后的抗体成功融合表达，在轻链结构上展现hrp信号蛋白，具有hrp信号。
39.a. 重组抗体基因的获得将得到的hrp
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ki67抗体序列的重链可变区基因vh，构建重组hrp
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ki67抗体的重链序列vh-ki67fx，将得到的轻链可变区基因vl，构建重组hrp
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ki67抗体的轻链序列vl-ki67fx。合成基因片段的两端设计ecori与bamhi酶切位点，以ptt5为载体，获得携带有重组基因的质粒分别为ptt5-vl（轻链） 和ptt5-vh（重链）。重链序列vh-ki67fx与轻链序列vl-ki67fx均由安徽通用生物科技有限公司合成，在具体构建靶向载体质粒过程中设计了几种优化选择方案：
①
linker序列为 seq id no：13；
②
linker序列为 seq id no：14；
③
linker序列为seq id no：15。
40.具体的操作步骤如下：1)将含有重链序列、轻链序列原核质粒用化学转化的方法转化至感受态细胞中，在含有100μg/ml ampicillin抗生素的低盐lb固体培养基上培养14h。挑取几个单菌落于100μg/ml ampicillin抗生素的低盐lb液体培养基中培养过夜，同时利用测序引物进行菌落pcr鉴定，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，证明目的基因成功插入真核表达载体；2）将纯化后的质粒经ecori与bamhi双酶切，酶切完成后在反应体系中加入1μl dpni，于37℃反应30min，消化掉模板dna；3）酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，切取目的片段，经pcr产物试剂盒（fastpure gel dna dc301-01 vazyme）提取回收目的片段与ptt5载体片段；4）进行连接反应。
41.连接反应体系为：约0.1pmol 目的片段，约0.01pmol ptt5载体dna片段，1μl t4 dna ligase缓冲液（neb），1μl t4 dna ligase（neb），加去离子水补足到10μl体系，16℃连接过夜。取3μl反应产物转化至100μl感受态细胞dh5a（vazyme）中。
42.b. 筛选获得重组质粒挑取阳性克隆，经37℃培养12h后，用质粒小提试剂盒（qigen）提取质粒，并对提取的质粒送到上海生工，进行测序鉴定。
43.c. 制备重组hrp
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ki67抗体将测序正确的阳性克隆大量摇菌，按照(天根dp117)说明书中提质粒，共转染至状态良好的cho细胞中，30μg的目的质粒通过转染试剂共转染到30ml的1
×
106cell/ml的cho细胞后表达抗体，2天后更换新鲜培养基继续培养5天，将培养组分经4000rpm，22℃离心10分钟，收集培养上清。利用0.45um孔径的过滤管(millipore)过滤，再用protein a agarose(常州天地人和生物有限公司)凝胶进行纯化，得到方案
①‑③
的hrp
‑ꢀ
ki67抗体，经过计算方案
①‑③
的hrp-ki67抗体的表达量依次分别为20mg/l，3mg/l，1.9mg/l，说明方案
①
优化构建质粒得到的抗体表达量最高。
44.d. hrp
‑ꢀ
ki67抗体的sds-page电泳检测电泳条件：5％浓缩胶80v电压，12％分离胶120v电压。方案
①
优化构建质粒得到抗体重链大小50kda，轻链大小70kda，如图5a所示，说明hrp
‑ꢀ
ki67抗体被成功制备，在抗体轻链部分有hrp蛋白结构。方案
②
（泳道1、2）和方案
③
（泳道3、4）优化构建质粒得到抗体重链大小50kda，轻链大小25kda，如图5b所示，说明hrp
‑ꢀ
ki67抗体没有被成功融合表达，在轻链
结构上没有展现hrp信号蛋白。
45.e.进一步验证，设计如下实验进行验证方案
①②③
优化构建质粒获得的重组抗体是否具有hrp信号，实验方法为将方案
①②③
优化构建质粒获得的重组抗体按照终浓度为1ug/ml用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板，37℃孵育2小时后，加tmb显色液直接显色，终止显色后，用酶标仪测定od450读数，结果如表4所示。
46.表4 方案
①②③
获得的重组抗体elisa检测结果（od450)
47.通过以上结果可以看出，优化方案
①
得到的抗体具有hrp信号，与sds-page电泳检测结果吻合。
48.实施例4：将乳腺癌组织石蜡切片通过常规方式脱蜡、水化、修复后，加入封闭液（pbs含5%山羊血清）封闭1分钟，冲洗后，直接加入方案
①
得到的hrp
‑ꢀ
ki67抗体，37
°
反应5分钟，冲洗后加入dab显色液，室温避光显色2-3min，光学显微镜下观察染色结果，避免显色过深；自来水冲洗切片终止显色，用苏木素复染3min，自来水冲洗3次，用分化液处理15s，自来水冲洗3次，氨水返蓝30s，自来水冲洗3次，脱水、封片，拍照留存，实验结果见图6。在实验过程中，加入阴性对照（不加任何抗体）。
49.实验结果显示用本发明制备的hrp
‑ꢀ
ki67抗体做免疫组化实验，大大缩短了反应时间并且没有影响实验结果，使得在30分钟左右完成石蜡切片免疫组化实验成为可能。
50.实施例5：为了进一步验证发明制备的hrp
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ki67抗体的临床应用性能，选择肺癌组织冷冻切片进行验证，将冷冻切片酒精固定1分钟后，加入封闭液（pbs含5%山羊血清）封闭1分钟，冲洗后，直接加入方案
①
得到的hrp
‑ꢀ
ki67抗体，37
°
反应3分钟，冲洗后加入dab显色液，室温避光显色2min，光学显微镜下观察染色结果，后续复染、返蓝、脱水、封片、拍照留存，实验结果见图7。在实验过程中，加入阴性对照（不加任何抗体）。
51.实验结果显示用本发明制备的含hrp标签的ki67抗体做免疫组化实验，大大缩短反应时间并且没有影响实验结果，使得在10分钟左右完成冰冻免疫组化实验成为可能。
52.实施例6：将肺癌组织石蜡切片通过常规方式脱蜡、水化、修复后，加入封闭液（pbs含5%山羊血清）封闭1分钟，冲洗后，直接加入方案
①
得到的hrp
‑ꢀ
ki67抗体，37
°
反应5分钟，冲洗后加入dab显色液，室温避光显色2-3min，光学显微镜下观察染色结果，避免显色过深；自来水冲洗切片终止显色，用苏木素复染3min，自来水冲洗3次，用分化液处理15s，自来水冲洗3次，氨水返蓝30s，自来水冲洗3次，脱水、封片，拍照留存，实验结果见图8。在实验过程中，加入阴性对照（不加任何抗体）。
53.再次证明了用本发明制备的hrp
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ki67抗体做免疫组化实验，大大缩短了反应时间并且没有影响实验结果，使得在30分钟左右完成石蜡切片免疫组化实验成为可能。
54.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.一种具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区为seq id no：1所示的氨基酸序列，轻链可变区为seq id no：2所示的氨基酸序列。2.一种编码如权利要求1所述的具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体的dna分子。3.根据权利要求2所述的dna分子，其特征在于，所述dna分子的核苷酸序列中，编码所述抗体重链的核苷酸序列如seq id no：3所示，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如seq id no：4所示。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2或3所述的dna分子。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括质粒、病毒来源的载体。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。7.一种细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求4所述的表达载体转化得到，所述细胞包括原核细胞、真核细胞。8.一种制备权利要求1所述的具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：a)提供一个表达载体，该表达载体含有权利要求2或3所述的dna分子序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得所述的抗体。9.权利要求1所述的一种具有信号蛋白标签的ki-67生物融合酶抗体应用于ki-67靶标检测免疫组化试剂盒。

技术总结
本发明涉及免疫学疾病诊断技术领域，具体为一种具有信号蛋白标签的Ki-67生物融合酶抗体及应用，本发明通过利用产生的IgG抗体含信号蛋白HRP标签的转基因小鼠，制备一种含信号蛋白HRP标签的Ki-67生物融合酶抗体，即HRP-Ki67抗体，来解决化学偶联存在异质性反应；偶联效率低信号差，抗体浪费严重；借助二抗来放大信号导致检测时间长的问题。HRP-Ki67抗体是一个完全随抗体一起分泌的分子，没有任何异质性反应；它具有严格的信号/抗体计量学，可以很好的控制信号强度，大大降低了批次间差异且节约抗体的用量，缩减了成本；检测时无需标记二抗，简化了免疫分析程序，提高了检测效率。提高了检测效率。提高了检测效率。


技术研发人员：贾凤芹
受保护的技术使用者：南京拂晓生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.05
技术公布日：2023/10/15