一种天然黄酮苷及在制备治疗糖脂代谢综合紊乱药物方面的应用的制作方法

1.本发明属于天然药物技术领域，尤其是一种天然黄酮苷及在制备治疗糖脂代谢综合紊乱药物方面的应用。


背景技术：

2.木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，英文名：luteolin-7-o-6
”‑
malonylglucoside(下文简称为lmg)，cas：98767-38-5。据报道，lmg曾经从毛茛(cynara cardunculus l.)、芹菜(celery)、菊花(chrysanthemum)、豆蔻树叶(cardoon leaves)、突尼斯全球洋蓟(tunisian globe artichoke)、羽扇豆(lupin)、桂花(osmanthus fragranslour)、毛细管苔藓(bryum capillare)等植物中分离获得。该化合物具有抗氧化、抗炎、抗疱疹、抗肿瘤细胞增殖、抗微生物等活性，可以用于治疗关节炎与自身免疫性疾病，也可作为黑燕尾蝶产卵兴奋剂。迄今为止，没有关于该化合物化学合成的研究报道，以及关于降血糖和/或降血脂活性方面的报道。
3.木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷的结构式如下：
[0004][0005]
通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的公开文献：
[0006]
1、期刊文献：identification ofmajor flavonoids inpetals ofedible chrysanthemum flowers and their suppressive effect on carbon tetrachloride-induced liver injury in mice.food science and technology research(2009),15(5),499-506.从日本一种菊花(chrysanthemum morifolium ramat.forma esculentum makino,c.v kotobuki)中分离提取出了该化合物，并发现具有抗氧化活性和缓解四氯化碳诱导的肝损伤活性。而四氯化碳诱导的肝损伤是一种应激性疾病，与高血脂症有本质不同，例如肝脏表型、脂肪变性、肝脏炎症以及对生物体血液脂肪含量相关的整体影响等。
[0007]
2、期刊文献：phenolic acids and flavonoids in leaf and floral stem of cultivated and wild cynara cardunculus l.genotypes.food chemistry(2011),126(2),417-422.该文献报道了天然提取分离的方法，以及该化合物具有抗氧化活性。该文献只是抗氧化活性的体外实验，并没有治疗相关疾病的报道。
[0008]
现有技术中，木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷具有抗氧化、抗炎、
抗疱疹、抗肿瘤细胞增殖、抗微生物等活性，可以用于治疗关节炎与自身免疫性疾病，也可作为黑燕尾蝶产卵兴奋剂，但没有关于降血脂和降血糖方面的活性报道。另外，芹菜素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷曾经从多种植物中分离获得，但尚无关于的化学合成报道。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种天然黄酮苷及在制备治疗糖脂代谢综合紊乱药物方面的应用。
[0010]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0011]
一种天然黄酮苷，所述天然黄酮苷的中文名称为：木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，英文名称为：luteolin-7-o-6
”‑
malonylglucoside，结构式为：
[0012][0013]
进一步地，所述木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷在体外能够抑制胰脂肪酶，降低细胞脂质积累，具有降血脂活性；该化合物能够促进细胞葡萄糖消耗，缓解细胞胰岛素抵抗，也具有降血糖功效；该化合物在小鼠体内也能够降低高血糖和高血脂症状。
[0014]
进一步地，所述天然黄酮苷是以木犀草素为起始原料，通过5步反应获得。
[0015]
进一步地，所述天然黄酮苷以木犀草素为原料进行化学合成，总收率为2.5％。
[0016]
进一步地，所述化学合成的合成路线为：
[0017][0018]
进一步地，所述化学合成的方法包括如下步骤：
[0019]
(1)化合物1的合成：将木犀草素和二氯二苯甲烷溶解于的二苯醚中，将反应液置于180℃油浴中反应2h；反应完毕后，将反应液倒入水中，首先用石油醚进行萃取，萃取后的水相用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后使用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，柱层析纯化后得到化合物1，黄色固体，产率50.8％；
[0020]
其中，木犀草素：二氯二苯甲烷：二苯醚的比例g：g：ml为1：1.2：20；
[0021]
(2)化合物2的合成：将化合物1、碳酸钾和四丁基溴化铵溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入乙酰溴-α,d-葡萄糖，微波反应器50℃反应1h，薄层层析(tlc)监测反应完毕；将反应液倒入2m的稀盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，通过柱层析纯化得到化合物2，浅黄色固体，产率62.2％；
[0022]
其中，化合物1：碳酸钾：四丁基溴化铵：n,n-二甲基甲酰胺：乙酰溴-α,d-葡萄糖：稀盐酸溶液的比例g：mg：mg：ml：mg：ml为0.8：483：10：10：779：40；
[0023]
(3)化合物3的合成：将化合物2溶解于甲醇中，室温下加入甲醇钠，室温反应1h，tlc监测反应完毕；将反应液倒入2m的稀盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，使用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析纯化得到化合物3，浅黄色固体，产率88.2％；
[0024]
其中，化合物2：甲醇：甲醇钠：稀盐酸溶液的比例mg：ml：mg：ml为420：10：114：10；
[0025]
(4)化合物4的合成：将化合物3溶解于乙腈和n,n-二甲基甲酰胺中，向溶液中依次加入丙二酸和叔丁基异氰，80℃反应8h，tlc监测反应完毕；将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，使用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥后减压旋蒸，柱层析纯化后
得到化合物4，白色固体，产率35.7％；
[0026]
其中，化合物3：乙腈：n,n-二甲基甲酰胺：丙二酸：叔丁基异氰：水的比例mg：ml：ml：mg：mg：ml为270：5：5：76：175：10；
[0027]
(5)化合物木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷的合成：化合物4溶解在乙醇中，加入15％的钯碳，15psi压力下，氢气环境室温反应16h；反应液进行过滤，滤饼洗涤三次，将滤液进行减压浓缩得到粗品；粗品通过高效液相反向制备柱进行分离，得到化合物木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，黄色固体，产率25.0％，即得到天然黄酮苷；
[0028]
其中，化合物4：乙醇：钯碳的比例mg：ml：mg为110：10：10。
[0029]
如上所述的天然黄酮苷在制备治疗糖脂代谢综合紊乱药物方面中的应用。
[0030]
如上所述的天然黄酮苷在制备治疗高血脂症和/或高血脂的药品和/或功能食品方面中的应用。
[0031]
本发明取得的优点和积极效果为：
[0032]
1、本发明首次通过5步总产率为2.5％的合成工艺合成了该化合物，并首次发现该化合物具有体内外降低高血脂和高血糖方面的活性，因此，该化合物可以应用在制备治疗高血脂症和高血糖等相关疾病的产品方面中。
[0033]
2、本发明通过5步反应首次合成了天然产物lmg，并对该化合物进行了体外和体内的降血糖和降血脂活性评价。结果表明，该化合物在体外能够抑制胰脂肪酶，降低细胞脂质积累，说明该化合物具有降血脂活性；该化合物能够促进细胞葡萄糖消耗，缓解细胞胰岛素抵抗，说明该化合物也具有降血糖功效。此外，通过进一步的小鼠体内实验证实了该化合物能够降低高血糖和高血脂症状。因此，该天然产物既可以实现化学合成，又具备体内和体外降血糖和降血脂活性，说明该化合物具有良好的应用前景。
[0034]
3、本发明实现了首次化学合成，提供了一种新的制备方法，可以为后续药物或/和功能食品的深入研究提供足够质量的化合物。因此，木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷可以用作治疗高血脂和/或高血糖的功能性食品和/或药物，制备方法简单可行，具有食源性毒副作用小的特点，具有巨大市场潜力。
附图说明
[0035]
图1为本发明中合成中间体1的核磁共振氢谱图；
[0036]
图2为本发明中合成中间体2的核磁共振氢谱图；
[0037]
图3为本发明中合成中间体3的核磁共振氢谱图；
[0038]
图4为本发明中合成中间体4的核磁共振氢谱图；
[0039]
图5为本发明中lmg核磁共振氢谱图；
[0040]
图6为本发明中lmg核磁共振碳谱图；
[0041]
图7为本发明中lmg对hepg2细胞中甘油三酯(tg)含量的影响图；其中，与模型组比较，***p《0.001；
[0042]
图8为本发明中lmg对hepg2细胞胰岛素抵抗的影响图；其中，与模型组比较，
[0043]
***p《0.01，**p《0.05；
[0044]
图9为本发明中lmg对小鼠餐后血糖的影响图；其中，与模型组比较，**p《0.05，*p《
0.01；
[0045]
图10为本发明中lmg对小鼠餐后血糖曲线下面积图；其中，与模型组比较，**p《0.05，*p《0.01。
具体实施方式
[0046]
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0047]
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
[0048]
一种天然黄酮苷，所述天然黄酮苷的中文名称为：木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，英文名称为：luteolin-7-o-6
”‑
malonylglucoside，结构式为：
[0049][0050]
较优地，所述木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷在体外能够抑制胰脂肪酶，降低细胞脂质积累，具有降血脂活性；该化合物能够促进细胞葡萄糖消耗，缓解细胞胰岛素抵抗，也具有降血糖功效；该化合物在小鼠体内也能够改善高血糖和高血脂症状。
[0051]
较优地，所述天然黄酮苷是以木犀草素为起始原料，通过5步反应获得。
[0052]
较优地，所述天然黄酮苷以木犀草素为原料进行化学合成，总收率为2.5％。
[0053]
较优地，所述化学合成的合成路线为：
[0054][0055]
较优地，所述化学合成的方法包括如下步骤：
[0056]
(1)化合物1的合成：将木犀草素和二氯二苯甲烷溶解于的二苯醚中，将反应液置于180℃油浴中反应2h；反应完毕后，将反应液倒入水中，首先用石油醚进行萃取，萃取后的水相用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后使用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，柱层析纯化后得到化合物1，黄色固体，产率50.8％；
[0057]
其中，木犀草素：二氯二苯甲烷：二苯醚的比例g：g：ml为1：1.2：20；
[0058]
(2)化合物2的合成：将化合物1、碳酸钾和四丁基溴化铵溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入乙酰溴-α,d-葡萄糖，微波反应器50℃反应1h，薄层层析(tlc)监测反应完毕；将反应液倒入2m的稀盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，通过柱层析纯化得到化合物2，浅黄色固体，产率62.2％；
[0059]
其中，化合物1：碳酸钾：四丁基溴化铵：n,n-二甲基甲酰胺：乙酰溴-α,d-葡萄糖：稀盐酸溶液的比例g：mg：mg：ml：mg：ml为0.8：483：10：10：779：40；
[0060]
(3)化合物3的合成：将化合物2溶解于甲醇中，室温下加入甲醇钠，室温反应1h，tlc监测反应完毕；将反应液倒入2m的稀盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，使用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析纯化得到化合物3，浅黄色固体，产率88.2％；
[0061]
其中，化合物2：甲醇：甲醇钠：稀盐酸溶液的比例mg：ml：mg：ml为420：10：114：10；
[0062]
(4)化合物4的合成：将化合物3溶解于乙腈和n,n-二甲基甲酰胺中，向溶液中依次加入丙二酸和叔丁基异氰，80℃反应8h，tlc监测反应完毕；将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，使用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥后减压旋蒸，柱层析纯化后
得到化合物4，白色固体，产率35.7％；
[0063]
其中，化合物3：乙腈：n,n-二甲基甲酰胺：丙二酸：叔丁基异氰：水的比例mg：ml：ml：mg：mg：ml为270：5：5：76：175：10；
[0064]
(5)化合物木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷的合成：化合物4溶解在乙醇中，加入15％的钯碳，15psi压力下，氢气环境室温反应16h；反应液进行过滤，滤饼洗涤三次，将滤液进行减压浓缩得到粗品；粗品通过高效液相反向制备柱进行分离，得到化合物木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，黄色固体，产率25.0％，即得到天然黄酮苷；
[0065]
其中，化合物4：乙醇：钯碳的比例mg：ml：mg为110：10：10。
[0066]
如上所述的天然黄酮苷在制备治疗糖脂代谢综合紊乱药物方面中的应用。
[0067]
如上所述的天然黄酮苷在制备治疗高血脂症和/或高血脂的药品和/或功能食品方面中的应用。
[0068]
具体地，相关的制备及检测如下：
[0069]
实施例1化合物lmg的合成工艺研究
[0070]
本发明首次全合成了lmg，以木犀草素为起始原料，通过5步反应，总收率2.5％，该合成是通过以下路线得到的：
[0071][0072]
具体包括下述步骤：
[0073]
(1)化合物1的合成：将木犀草素(1g,3.5mmol,1.0当量)和二氯二苯甲烷(1.2g,5.2mmol,1.5当量)溶解于20ml的二苯醚中，将反应液置于180℃油浴中反应2h。反应完毕后，将反应液倒入水中，首先用200ml石油醚进行萃取，萃取后的水相用40ml乙酸乙酯萃取
三次，有机相合并后使用饱和食盐水(100ml)洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，柱层析纯化后得到0.8g的化合物1，黄色固体，产率50.8％。
[0074]
化合物1的谱图数据如下：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.86(s,1h),10.92(br s,1h),7.79(d,j＝1.8hz,1h),7.71(dd,j＝1.8,8.3hz,1h),7.59-7.53(m,4h),7.51-7.44(m,6h),7.23(d,j＝8.4hz,1h),6.89(s,1h),6.52(d,j＝2.1hz,1h),6.20(d,j＝2.1hz,1h)。核磁共振氢谱图见图1。
[0075]
(2)化合物2的合成：将化合物1(0.8g,1.7mmol,1.0当量)、碳酸钾(483mg,3.5mmol,2.0当量)和四丁基溴化铵(10mg)溶解于10mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入乙酰溴-α,d-葡萄糖(779mg,1.9mmol,1.1当量)，微波反应器50℃反应1h，薄层层析(tlc)监测反应完毕。将反应液倒入2m的稀盐酸溶液(40ml)中，用乙酸乙酯(20ml
×
2)萃取，有机相合并，并用饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，通过柱层析纯化得到420mg的化合物2，浅黄色固体，产率62.2％。
[0076]
化合物2的谱图数据如下：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ12.79(s,1h),7.61-7.57(m,3h),7.46(dd,j＝1.8,8.3hz,1h),7.43-7.37(m,6h),7.00(d,j＝8.3hz,1h),6.59-6.53(m,2h),6.45(d,j＝2.1hz,1h),5.41-5.27(m,3h),5.23-5.09(m,2h),4.33-4.26(m,1h),4.24-4.18(m,1h),3.95(ddd,j＝2.4,5.9,10.0hz,1h),2.13-2.10(m,3h),2.09-2.05(m,9h),2.03(br d,j＝4.5hz,1h)。核磁共振氢谱图见图2。
[0077]
(3)化合物3的合成：将化合物2(420mg,0.5mmol,1.0当量)溶解于10ml甲醇中，室温下分批次加入甲醇钠(114mg,2.1mmol,4.0当量)，室温反应1h，tlc监测反应完毕。将反应液倒入2m的稀盐酸溶液(10ml)中，用乙酸乙酯(5ml
×
2)萃取，有机相合并，使用饱和食盐水(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析纯化得到270mg的化合物3，浅黄色固体，产率88.2％。
[0078]
化合物3的谱图数据如下：1h nmr(400mhz,meod)δ＝7.65-7.55(m,6h),7.42(br d,j＝5.3hz,6h),7.06(d,j＝8.1hz,1h),6.82(s,1h),6.68(s,1h),6.49(s,1h),5.12-5.02(m,1h),3.94(br d,j＝10.6hz,1h),3.72(dd,j＝5.8,12.1hz,1h),3.61-3.47(m,3h),3.45-3.37(m,1h)。核磁共振氢谱图见图3。
[0079]
(4)化合物4的合成：将化合物3(270mg,0.4mmol,1.0当量)溶解于5ml的乙腈和5ml的n,n-二甲基甲酰胺中，向溶液中依次加入丙二酸(76mg,0.8mmol,2.0当量)和叔丁基异氰(175mg,2.4mmol,3.0当量)，80℃反应8h，tlc监测反应完毕。将反应液倒入10ml水中，用乙酸乙酯(10ml
×
2)萃取，有机相合并，使用饱和食盐水(10ml)洗涤三次，无水硫酸钠干燥后减压旋蒸，柱层析纯化后得到110mg的化合物4，白色固体，产率35.7％。
[0080]
化合物4的谱图数据如下：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ＝7.80(d,j＝1.6hz,1h),7.73(br dd,j＝1.8,8.3hz,1h),7.58-7.53(m,5h),7.50-7.42(m,7h),7.28(d,j＝8.4hz,1h),6.93-6.89(m,1h),6.79(d,j＝2.0hz,1h),6.48(d,j＝2.0hz,1h),5.62-5.42(m,1h),5.40-5.23(m,1h),5.02(d,j＝7.1hz,1h),4.29(br d,j＝11.1hz,1h),4.07(br dd,j＝6.8,12.0hz,1h),3.73-3.65(m,1h),3.30-3.25(m,2h),3.23-3.14(m,2h),3.03-2.95(m,2h)。核磁共振氢谱图见图4。
[0081]
(5)化合物lmg的合成：化合物4(110mg,0.2mmol,1.0当量)溶解在10ml乙醇中，加入10mg 15％的钯碳，15psi压力下，氢气环境室温反应16h。反应液进行过滤，滤饼洗涤三
次，将滤液进行减压浓缩得到粗品。粗品通过高效液相反向制备柱进行分离，得到21mg的化合物lmg，黄色固体，产率25.0％。
[0082]
lmg核磁共振氢谱、碳谱和质谱数据如下：1h nmr(400mhz,meod)δ7.46-7.37(m,2h),7.12-7.04(m,1h),6.92(d,j＝8.9hz,1h),6.77(d,j＝2.1hz,1h),6.61(s,1h),6.51(d,j＝2.1hz,1h),5.09-5.04(m,1h),4.54(br dd,j＝1.6,11.9hz,1h),4.31(dd,j＝6.8,11.8hz,1h),3.84-3.74(m,1h),3.54-3.48(m,2h),3.44-3.38(m,2h)。
13
c nmr(400mhz,meod)δ184.1(c-4),168.9(cooh),167.0(coor),164.5(c-2),162.8(c-7),158.9(c-5),151.1(c-4’),147.0(c-9),123.5(c-2’,6’),120.6(c-1’),116.9(c-3’),114.4(c-5’),107.1(c-l0),104.2(c-3),101.4/101.1(c-6,g-l),96.3(c-8),77.7(g-3),75.5(g-5),74.7(g-2),71.4(g-4),65.4(g-6),48.4(ch2)。ms(esi):m/z[m+h
+
]＝535.1。核磁共振氢谱图见图5，核磁共振碳谱图见图6。
[0083]
实施例2lmg胰脂肪酶抑制活性评价
[0084]
脂肪酶为胃肠道分解脂肪所必需的酶，它可与胃、胰脂肪酶的丝氨酸残基结合，使脂肪酶失活，使其不能将食物中的脂肪分解为游离脂肪酸，从而抑制脂肪的利用和吸收。因此，脂肪酶抑制剂可以促进脂肪的利用与吸收。
[0085]
本发明采用微孔板法检测不同浓度lmg对胰脂肪酶的抑制活性，以奥利司他为阳性对照，以4-甲基伞形酮油酸酯为底物，方法如下：
[0086]
(1)缓冲液的配制：将tris粉末于超纯水中充分溶解，定容后调节溶液ph＝8.0，得到体系浓度为13mm的tris-hcl缓冲液。
[0087]
(2)化合物的配制：称取待测化合物溶解于dmso试剂中，得到终浓度20mm的待测溶液。
[0088]
(3)胰脂肪酶测试液的配制：反应体系使用1mg/ml胰脂肪酶工作液，即称量胰脂肪酶粉末后，加入tris-hcl缓冲液，放冰上待用。
[0089]
(4)底物的配制：4-甲基伞形酮油酸酯用dmso溶解成5mm的溶液，再用tris-hcl稀释成0.1mm的底物溶液。
[0090]
(5)终止液的配制：称取柠檬酸和柠檬酸钠，分别加入蒸馏水进行溶解，将两溶液混合配制成ph值为4.2，浓度为0.1mm的反应终止液。
[0091]
(6)胰脂肪酶抑制活性测试体系：化合物测试组(a)：50μl底物溶液+10μl待测溶液+25μl酶溶液+100μl柠檬酸钠+15μl tris-hcl；化合物空白组(b)：50μl底物溶液+10μl待测溶液+100μl柠檬酸钠+40μl tris-hcl；对照组(c)：50μl底物溶液+25μl酶溶液+100μl柠檬酸钠+25μl tris-hcl；空白组(d)：50μl底物溶液+100μl柠檬酸钠+50μl tris-hcl。
[0092]
依次加入tris-hcl缓冲液、底物溶液和不同浓度的待测溶液，将其置于96孔酶标板中充分混合后加入酶溶液引发反应，25℃培育30min后，每孔加入100μl柠檬酸钠终止反应，随后立即于340nm和460nm发射光波波长下用酶标仪测定吸光值(od)。tris-hcl缓冲液ph值8.0，实验结果为3次独立实验，每次为2个平行。
[0093]
按下式计算出胰脂肪酶活性的抑制率：抑制率/％＝1-(od
a-odb)/(od
c-odd)]
×
100％。
[0094]
表1lmg对胰脂肪酶活性抑制的影响
[0095][0096]
注：a数据为三次独立实验的平均值，b奥利司他为阳性对照，测试浓度为0.08μm。
[0097]
由表1可以看出，lmg具有一定的胰脂肪酶抑制活性，在250μm时抑制率能达到78.3％。
[0098]
实施例3lmg对hepg2细胞脂含量的影响
[0099]
首先评价250μm和50μm的lmg对hepg2细胞的细胞毒性，该测试浓度下无明显细胞毒性，然后用油红o染色实验评价不同浓度的lmg的细胞水平降低脂肪含量的活性。以洛伐他汀为阳性对照，具体方法如下：
[0100]
取对数生长期的hepg2细胞，用dmem低糖培养基以细胞密度为1
×
105个/ml接种于6孔板中，每孔2ml，置于37℃培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用1
×
pbs洗1次，用无血清的dmem高糖培养基饥饿24h，用1
×
pbs洗1次，用配制好的长链脂肪酸(ffas)诱导剂诱导hepg2细胞建立脂肪蓄积模型24h，并设立药物对照组(诱导剂+待测物+细胞)，阴性对照组(诱导剂+dmso+细胞)和空白对照组(仅含1％bsa的dmem低糖培养基溶液)+阳性对照组(诱导剂+洛伐他汀+细胞)。每一浓度均设置3个复孔，每孔加入10μl含有不同浓度受试物的稀释液，将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养24h后用1
×
pbs清洗3次，用4％多聚甲醛每孔2ml固定细胞30min，用1
×
pbs清洗3次，60％异丙醇每孔2ml作用细胞5min增加细胞的通透性，在黑暗室温条件下用油红o每孔2ml染色1h，蒸馏水清洗细胞4次后每孔加入1ml异丙醇结合10min，震荡洗出，用酶标仪在492nm处测定吸光度。
[0101]
表2lmg对hepg2细胞脂含量的影响
[0102][0103]
注：a数据为三次独立实验的平均值，b洛伐他汀为阳性对照。与模型组比较形成显著性差异***p《0.001。
[0104]
由表2得知，lmg能够显著降低由油酸钠与棕榈酸钠诱导的细胞脂肪含量积累的能力，且与阳性对照洛伐他汀相比，测试浓度下降低脂肪含量的效果更加明显。
[0105]
实施例4lmg对hepg2细胞中甘油三酯(tg)含量的影响
[0106]
细胞培养和诱导方法与实施例3相同，但实施例3中油红o方法测定脂质总量，而实施例4用试剂盒方法测定的是甘油三酯的含量。细胞诱导24h后，加药处理24h，然后将hepg2细胞消化、离心，留取下方沉淀。细胞与裂解液混合均匀室温裂解35min，用甘油三酯检测试剂盒直接测定细胞内tg含量。由图7可知，与正常组相比，模型组由油酸钠与棕榈酸钠混合
的诱导剂作用于细胞24h后，细胞内tg水平上升非常明显，给药24h后，tg含量在药物给药浓度50、5、1、0.2μm下均有明显降低，在0.2μm下的活性仍能与10μm的洛伐他丁相当。
[0107]
实施例5lmg对hepg2胰岛素抵抗的影响
[0108]
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时具有促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素，胰岛素抵抗会造成体内糖脂代谢的紊乱。对hepg2胰岛素抵抗实验，以二甲双胍为阳性对照，具体方法如下：
[0109]
将hepg2细胞均匀地接种于96孔细胞培养板中，每孔给予100μl细胞液，设置正常组、模型组与给药组，放置在恒温培养箱中培养24h，适量pbs溶液多次清洗后，用不含血清的培养基饥饿细胞，过夜培养后，分别在模型组与给药组中加入浓度为0.5μm胰岛素与培养基的混合物100μl，诱导为高胰岛素血症，再加入不同浓度梯度的待测提取物并设置三个复孔，阳性对照为二甲双胍，在给药作用24h后，用葡萄糖测定试剂盒(氧化酶法)测定细胞葡萄糖消耗量，葡萄糖的消耗量可间接反应胰岛素抵抗。如图8所示，在模型组与给药组中加入了高浓度的胰岛素与培养基混合物，24h后使其诱导为高胰岛素血症，使其对胰岛素的敏感度降低，说明模型组对胰岛素产生了抵抗的效果。经不同浓度给药处理后，发现细胞葡萄糖的消耗量显著增多，说明能缓解胰岛素抵抗现象，值得注意的是，lmg在0.2μm浓度下也具有显著性，并且5μm的lmg与阳性对照二甲双胍在浓度为1mm时产生效果相当。因此，该化合物在体外能够缓解胰岛素抵抗现象，具有降血糖和降血脂活性的潜力。
[0110]
实施例6lmg对hepg2细胞葡萄糖消耗的影响
[0111]
用葡萄糖消耗实验来评价不同浓度的lmg促进葡萄糖消耗量，从而反应细胞水平降血糖活性。以二甲双胍为阳性对照，具体方法如下：
[0112]
取对数生长期的hepg2细胞常规消化，用dmem低糖培养基培养，接种细胞密度为5
×
104个/ml于96孔培养板中，每孔100μl，置于培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用1
×
pbs洗1次，用无血清的dmem高糖培养基饥饿24h，用1
×
pbs洗1次，换用dmem高糖培养基培养并设立药物对照组(培养基+待测物+细胞)，阴性对照组(培养基+dmso+细胞)和空白对照组(单纯培养基+待测物)，阳性对照组(培养基+二甲双胍+细胞)。每一浓度均设置3个复孔，每孔加入0.5μl含有不同浓度受试物的稀释液，将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养。24h后用葡萄糖测定试剂盒检测相对葡萄糖消耗量。
[0113]
表3lmg对hepg2细胞相对葡萄糖消耗量的影响
[0114][0115]
注：a数据为三次独立实验的平均值，b为阳性对照。
[0116]
在测试对hepg2细胞葡萄糖消耗量的影响前，先测定了其对hepg2细胞的毒性，结果表明lmg在大浓度500μm时细胞存活率仍大于75％。由表3得知，lmg在500μm浓度时，能够抑制细胞葡萄糖消耗活性，说明该化合物具有体外降血糖活性。
[0117]
实施例7小鼠体内降血糖和降血脂活性的影响
[0118]
高血糖和高血脂小鼠模型评价方法如下：
[0119]
(1)小鼠模型的建立
[0120]
雄性c57bl/6j小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。其中6只作为正常组用低脂饲料喂养，剩下40只小鼠作为模型组和给药组喂养60％高脂饲料(tp23300)，连续喂养27天，血糖高于11mm的算造模成功。
[0121]
(2)药物溶解及给药方式
[0122]
用生理盐水对lmg粉末和阳性对照进行溶解或分散，并对小鼠进行15天连续灌胃给药。
[0123]
(3)动物分组
[0124]
除正常组外，造模成功的小鼠再随机分为5组，每组6只，共计6组。第一组：正常小鼠组(低脂饲料)；第二组：模型小鼠组(高脂饲料)；第三组：给药高剂量组(高脂饲料+lmg 400mg/kg)；第四组：给药低剂量组(高脂饲料+lmg 200mg/kg)；第五组：阿卡波糖高血糖阳性对照组(高脂饲料+阿卡波糖100mg/kg)；第六组：非诺贝特高血脂阳性对照组(高脂饲料+非诺贝特100mg/kg)。
[0125]
(4)小鼠实验过程
[0126]
灌胃给药15天后，对小鼠进行眼眶取血，用血糖仪测试血糖，然后摘眼球取血，离心收集血清，测血脂指标。
[0127]
如图9所示，给予高脂饲料喂养4周后，模型组的血糖明显升高，给予15天lmg后血糖出现显著下降，高剂量和低剂量都呈现出显著性差异(见图10)，该结果说明该化合物具有降低高血糖小鼠的血糖。
[0128]
如表4所示，给予高脂饲料喂养4周后，模型组的血脂也明显升高，给予lmg后，甘油三酯(tg)和胆固醇(tc)明显降低，说明lmg除了能够缓解小鼠高血糖的同时也能降低小鼠的血脂水平。
[0129]
表4lmg对小鼠血清甘油三酯(tg)和胆固醇(tc)的影响(n＝6)
[0130]
组别tc(mmol/l)tg(mmol/l)正常组2.44
±
0.18
***
5.69
±
0.61
***
模型组13.37
±
0.4242.20
±
9.41lmg高剂量组3.34
±
0.40
***
14.20
±
9.08
***
lmg低剂量组6.55
±
1.52
*
19.82
±
12.13
***
非诺贝特4.90
±
2.52
***
13.00
±
5.31
***
[0131]
注：数据为平均值
±
sem。与模型组比较形成显著性差异***p《0.001，*p《0.01。
[0132]
综上所述，本发明通过5步反应首次合成了天然产物lmg，并对该化合物进行了体外和体内的降血糖和降血脂活性评价。结果表明，该化合物在体外能够抑制胰脂肪酶，降低细胞脂质积累，说明该化合物具有降血脂活性；该化合物能够促进细胞葡萄糖消耗，缓解细胞胰岛素抵抗，说明该化合物也具有降血糖功效。此外，通过进一步的小鼠体内实验证实了该化合物能够降低高血糖和高血脂症状。因此，该天然产物既可以实现化学合成，又具备体内和体外降血糖和降血脂活性，说明该化合物具有良好的应用前景。
[0133]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本
发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种天然黄酮苷，其特征在于：所述天然黄酮苷的中文名称为：木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，英文名称为：luteolin-7-o-6
”‑
malonylglucoside，结构式为：2.根据权利要求1所述的天然黄酮苷，其特征在于：所述木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷在体外能够抑制胰脂肪酶，降低细胞脂质积累，具有降血脂活性；该化合物能够促进细胞葡萄糖消耗，缓解细胞胰岛素抵抗，也具有降血糖功效；该化合物在小鼠体内也能够改善高血糖和高血脂症状。3.根据权利要求1所述的天然黄酮苷，其特征在于：所述天然黄酮苷是以木犀草素为起始原料，通过5步反应获得。4.根据权利要求3所述的天然黄酮苷，其特征在于：所述天然黄酮苷以木犀草素为原料进行化学合成，总收率为2.5％。5.根据权利要求4所述的天然黄酮苷，其特征在于：所述化学合成的合成路线为：6.根据权利要求5所述的天然黄酮苷，其特征在于：所述化学合成的方法包括如下步骤：
(1)化合物1的合成：将木犀草素和二氯二苯甲烷溶解于的二苯醚中，将反应液置于180℃油浴中反应2h；反应完毕后，将反应液倒入水中，首先用石油醚进行萃取，萃取后的水相用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后使用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，柱层析纯化后得到化合物1，黄色固体，产率50.8％；其中，木犀草素：二氯二苯甲烷：二苯醚的比例g：g：ml为1：1.2：20；(2)化合物2的合成：将化合物1、碳酸钾和四丁基溴化铵溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，加入乙酰溴-α,d-葡萄糖，微波反应器50℃反应1h，薄层层析监测反应完毕；将反应液倒入2m的稀盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，通过柱层析纯化得到化合物2，浅黄色固体，产率62.2％；其中，化合物1：碳酸钾：四丁基溴化铵：n,n-二甲基甲酰胺：乙酰溴-α,d-葡萄糖：稀盐酸溶液的比例g：mg：mg：ml：mg：ml为0.8：483：10：10：779：40；(3)化合物3的合成：将化合物2溶解于甲醇中，室温下加入甲醇钠，室温反应1h，tlc监测反应完毕；将反应液倒入2m的稀盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，使用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析纯化得到化合物3，浅黄色固体，产率88.2％；其中，化合物2：甲醇：甲醇钠：稀盐酸溶液的比例mg：ml：mg：ml为420：10：114：10；(4)化合物4的合成：将化合物3溶解于乙腈和n,n-二甲基甲酰胺中，向溶液中依次加入丙二酸和叔丁基异氰，80℃反应8h，tlc监测反应完毕；将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，有机相合并，使用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥后减压旋蒸，柱层析纯化后得到化合物4，白色固体，产率35.7％；其中，化合物3：乙腈：n,n-二甲基甲酰胺：丙二酸：叔丁基异氰：水的比例mg：ml：ml：mg：mg：ml为270：5：5：76：175：10；(5)化合物木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷的合成：化合物4溶解在乙醇中，加入15％的钯碳，15psi压力下，氢气环境室温反应16h；反应液进行过滤，滤饼洗涤三次，将滤液进行减压浓缩得到粗品；粗品通过高效液相反向制备柱进行分离，得到化合物木犀草素7-o-(6
”‑
o-丙二酸单酰)-β-d-葡萄糖苷，黄色固体，产率25.0％，即得到天然黄酮苷；其中，化合物4：乙醇：钯碳的比例mg：ml：mg为110：10：10。7.如权利要求1至6任一项所述的天然黄酮苷在制备治疗糖脂代谢综合紊乱药物方面中的应用。8.如权利要求1至6任一项所述的天然黄酮苷在制备治疗高血脂症和/或高血脂的药品和/或功能食品方面中的应用。

技术总结
本发明公开了一种天然黄酮苷，所述天然黄酮苷的中文名称为：木犀草素7-O-(6


技术研发人员：孙华 张欣颖 胡晴
受保护的技术使用者：江苏灵源沂岸科技股份有限公司
技术研发日：2023.02.22
技术公布日：2023/7/11