脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于环境微生物和水产技术领域，具体涉及一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.在水产养殖中，氨氮是导致养殖水质恶化，危害养殖动物生长的重要因素之一；养殖过程中，养殖动物的排泄物、腐败残饵和动物残体等均会造成氨氮和亚硝酸盐等理化因子的不断累积，破坏水质，微生物在氮转化中具有重要的意义，可以通过硝化-反硝化作用有效调节水体中因死虾、残饵粪便等过量升高的氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐等，调节养殖水质，改善养殖环境，增量增产。
3.生物脱氮因其绿色、环保及高效备受关注，因此，筛选出具有脱氮效果的有益菌株对对水产养殖业的绿色可持续发展具有重要的推动作用，且生物脱氮对水产产业中养殖废水有同样的水质调节效果，可以降低水产养殖废水的污染，加快养殖废水符合国家排放标准，保护外部环境；由此说明，此类菌株在水质调节方面具有良好的应用价值和巨大的应用潜力。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明实施例提供一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌，该菌株已于2022年9月7日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no.62679。
7.上述方案中，所述赖氨酸芽孢杆菌命名为赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillussp.)xw1，从广东省对虾生物絮团养殖池塘中经过富集培养及分离纯化获得，结合16srrna高通量技术和传统细菌培养方法进行鉴定。
8.上述方案中，所述赖氨酸芽孢杆菌的16s rrna基因序列为：cgccagggcggggtgctatacatgcagtcgagcgaacagagaaggagcttgctcctttgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaatattgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactc
cgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaaggtggattaagtg。
9.上述方案中的脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌在养殖水体脱氮的应用。
10.上述方案中的脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌在提高养殖水体中的对虾存活率和生长率的应用。
11.与现有技术相比，本发明的脱氮菌株兼具异养硝化和好氧反硝化能力，能够有效降解养殖水体中的氨氮、亚硝态氮和硝态氮等有害的水体理化因子，适用于水产养殖中调节水质和增产增量的生物处理。
附图说明：
12.此处所说明的附图用来公开对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
13.图1为本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌的外部形态示意图。
14.图2为本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌的溶血实验结果示意图。
15.图3为本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌的系统发育进化树示意图。
16.图4为本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌对于养殖水体中氨氮的降解率示意图。
17.图5为本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌对于养殖水体中亚硝酸盐氮的降解率示意图。
18.图6为本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌对于养殖水体中硝酸盐氮的降解率示意图。
具体实施方式：
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.本发明实施例提供一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1，于2022年9月7日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：gdmcc no.62679。
21.所述赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1的16s rrna基因序列cgccagggcggggtgctatacatgcagtcgagcgaacagagaaggagcttgctcctttgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctca
tggtgaaatattgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaaggtggattaagtg。
22.所述赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1是在广东省对虾生物絮团养殖池塘中经过富集培养和分离纯化而来，结合16srrna高通量技术和传统细菌培养方法进行鉴定。
23.所述赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1是以氨氮、硝酸盐氮或亚硝酸盐氮作为唯一氮源生长。
24.本发明实施例提供的一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌用于养殖水体脱氮。
25.所述养殖水体指含氨氮、亚硝酸盐氮或硝酸盐氮的对虾养殖水体。
26.所述赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1不具有溶血性，安全性评估中不会对对虾存活造成危害。
27.所述赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1可以提高养殖水体中的对虾存活率和生长率。
28.本发明提供该菌株在水产养殖脱氮中的应用，可以有效去除水体中氨氮和亚硝酸盐氮等有害的水体理化因子，实现增量增产。
29.为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
30.实施例1：菌株的分离纯化与鉴定
31.赖氨酸芽孢杆菌xw1的分离纯化
32.样品自广东省湛江市徐闻县湛江南部海岸渔业有限公司的生物絮团养殖池塘水中采集而来，使用有98ml灭菌的氨氮-硝化液体培养基和亚硝酸盐-反硝化液体培养基的250ml锥形瓶对养殖池塘的5ml水体样品分别进行富集培养，用于富集采集水体的每种液体培养基都设置三个重复实验组。
33.分别取1ml富集后的菌液到9ml的灭菌海水中混匀，再按照10-1
倍的梯度把菌液依
次稀释成10-3
至10-6
倍，之后取100μl稀释液分别涂布在配置倾倒好的固体氨氮-硝化和亚硝酸盐-反硝化培养基上，培养箱保持有氧，恒温28℃倒置培养，直至长出可视细菌群落，使用放大镜挑选培养基中群落形态(颜色，
34.形状，大小，表面状态)不相似的菌落，借助接种环在固体氨氮-硝化和亚硝酸盐-反硝化培养基上继续重复划线纯化，直至筛选出数个单个菌落，最后在筛选出的菌落中加入一定量的50％甘油，使菌液中甘油的最终浓度为10％，于-80℃超低温冰箱保存，由此纯化得到一株细菌菌株xw1。
35.以上所述培养基配方如下：
36.氨氮-硝化液体培养基：(nh4)2so4 0.1g(溶液采用0.22μm针式过滤器：天津津腾，过滤除菌待培养基冷却后加入)，c6h12o6 0.5g，k2hpo4 0.01g，kh2po4 0.01g，c4h4o4na2 0.5g，0.22μm过滤膜海水1000ml(盐度为30)，使用naoh或者hcl调节ph为7.5。氨氮-硝化固体培养基配方为液体培养基中添加20g的琼脂粉。
37.亚硝酸盐-反硝化液体培养基：nano2 0.1g，c6h12o6 0.5g，k2hpo4 0.01g，kh2po4 0.01g，c4h4o4na2 0.5g，0.22μm过滤膜海水1000ml，使用naoh或者hcl调节ph为7.5。亚硝酸盐-反硝化固体培养为液体培养基中添加20g琼脂粉。
38.2216e液体培养基：成品购于青岛海博。成分(g/l)：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g。
39.2216e固体培养基：成品购于青岛海博。
40.以上所述培养基在配置完成后，皆于高压灭菌锅115℃高温灭菌30min，固体培养基室温冷却至55℃倾注无菌平板使用。
41.赖氨酸芽孢杆菌xw1的鉴定与保藏
42.(1)形态鉴定
43.本发明经过上述的分离筛选得到一株以氨氮、硝酸盐氮或亚硝酸盐氮作为唯一氮源生长的菌株xw1，该菌株在固体2216e平板上24h的菌落，如图1所示：呈圆形，奶油色不透明，表面光滑，隆起，无晕环，无凸起，直径1mm，粘稠，湿润，易挑起。
44.(2)生理生化鉴定
45.将赖氨酸芽孢杆菌xw1活化后，每组设置三个平行，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对细菌进行生理生化测定，生理生化测定结果如表1所示。
46.表1
47.[0048][0049]
注：“+”为阳性，“－”为阴性
[0050]
(3)分子生物学鉴定
[0051]
使用细菌基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取菌株xw1的dna。随后将提取的dna样品当作模板进行pcr试验，对菌株xw1的16srdna序列进行扩增。
[0052]
正向引物为(27f)：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；
[0053]
反向引物为(1492r)：5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’。
[0054]
pcr反应体系(25l)中的成分：dna模板1l；正向引物27f 1l；反向引物1492r 1l；2mastermix 10l；最后加入12l ddh2o，将总体积补至25l；pcr反应条件：
①
94℃5min；
②
94℃30s；
③
55℃30s；
④
72℃1min；(其中
②‑④
35个循环)
⑤
72℃5min，pcr扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，送至生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在ncbi上进行blast比对分析，以确定菌株xw1为赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)。
[0055]
系统发育树的构建如图3所示。
[0056]
鉴定后的菌株保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmccno.62679。
[0057]
实施例2：菌株的安全性评估
[0058]
1.赖氨酸芽孢杆菌xw1安全性评估
[0059]
在安全性评估实验中，选取180尾健康的凡纳滨对虾，按照每桶20尾的数量将凡纳滨对虾随机分入9个60l的实验桶中暂养1周。实验桶设置两个实验组和一个空白对照组，每组设置3个平行；xw1菌液使用离心机10000rpm离心10min，去除上清液，用pbs漂洗吹打，去除2216e培养基对实验的干扰，将实验组的菌浓度分别调节为105cfu/ml及106cfu/ml，对照组不添加任何菌液，每隔2h观察记录对虾症状及存活情况，实验周期为14天，后计算成活率；每次更换新的海水后加入xw1菌液使其达到该实验组原本设置的浓度，按对虾体重5％的比例投喂饲料，投喂频率为2次/d。
[0060]
结果显示，菌株xw1不同菌液浓度对凡纳滨对虾成活率均达到90％以上，与空白对照组无显著性差异(p＞0.05)，对对虾存活不存在潜在的危害性。
[0061]
2.赖氨酸芽孢杆菌xw1的药敏实验
[0062]
药敏实验使用纸片扩散法进行，将xw1菌株在恒温培养箱中28-30℃培养6-7h活化。用移液枪吸取1ml菌液，均匀滴于mha平板上，使用涂布棒均匀在培养基中涂布，用镊子分别取药敏试纸均匀贴于培养基表面。将平板于恒温培养箱中倒置培养16-18h，保持30
±
1℃培养，取出平板后用尺子测量，判断出菌株xw1对所测试的药敏纸片的敏感性。
[0063]
菌株xw1药敏实验结果显示如表2。
[0064]
表2
[0065][0066][0067]
3.赖氨酸芽孢杆菌xw1的溶血实验
[0068]
溶血实验采用陆桥(北京)血琼脂培养基进行，将菌株xw1点种于血琼脂培养基上，放在培养箱中28℃恒温条件培养48h，结果显示如图2所示，溶血抑菌圈没有出现在血琼脂培养基上，说明菌株xw1不具有溶血性，不是潜在的致病菌。
[0069]
实施例3：菌株在水产养殖中的应用
[0070]
养殖管理：
[0071]
养殖实验密度：将50尾凡纳滨对虾放入0.3m3的养殖桶中暂养2d。
[0072]
分组设置：菌株xw1拌料组(xwa)，菌株xw1泼洒组(xwb)，空白对照组(dz)，每组设三个平行。
[0073]
投喂对虾配合饲料3次/d，日投喂量达到体质量的5％；对养殖桶进行按时排污，每天7:00am排出死虾和残饵；养殖周期为28d，每天测定水质氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的
浓度。
[0074]
实验结束后测定凡纳滨对虾的存活率、体长增长率和体质量增长率，菌株xw1在水产养殖应用中的水质调控结果如图4-6所示，养殖实验周期28d，测定每个处理方式的水体氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度，根据28d的浓度变化趋势可以看出，对照组水体的氨氮和硝酸盐氮的浓度一直处于不断上升的趋势，亚硝酸盐氮的浓度也是居高不下，而添加了菌株xw1的实验组氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮分别在第10-14天左右均有下降的趋势。从亚硝酸盐氮浓度变化趋势的图看出，对照组和实验组均有下降趋势，实验组的下降趋势相对对照组的更为迅速和明显。说明脱氮菌株xw1不管是拌料投喂还是直接泼洒，都对养殖水体的水质调控具有一定的作用。
[0075]
两株高效脱氮菌作为微生态制剂应用于凡纳滨对虾养殖实验对凡纳滨对虾生长情况的影响结果如表3所示。
[0076]
表3
[0077][0078]
各个不同处理方式的实验组的平均体长增长率、平均体质量增长率和成活率均高于对照组；xwb的平均体质量增长率最高，达到156.04％，显著高于空白对照组和xwa组；空白对照组的平均体长增长率、平均体质量增长率和平均成活率均低于其他组，说明菌株xw1对对虾生长的效果有明显的促进作用。
[0079]
综上，本发明提供的赖氨酸芽孢杆菌xw1菌株可有效的降解氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，将赖氨酸芽孢杆菌xw1应用于对虾养殖等氨氮和亚硝酸盐氮持续升高且较难降解的各类养殖水体中，可以促进生物处理在养殖水体中的有利作用，并达到增量增产的目的，这对于水产养殖中水质调节和发展水产养殖业具有重要的实际意义。
[0080]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，该菌株已于2022年9月7日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no.62679。2.根据权利要求1所述的脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述赖氨酸芽孢杆菌命名为赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)xw1，从广东省对虾生物絮团养殖池塘中经过富集培养及分离纯化获得，结合16srrna高通量技术和传统细菌培养方法进行鉴定。3.根据权利要求1或2所述的一种脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述赖氨酸芽孢杆菌的16s rrna基因序列为：cgccagggcggggtgctatacatgcagtcgagcgaacagagaaggagcttgctcctttgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaatattgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaaggtggattaagtg。4.根据权利要求3所述的脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌在养殖水体脱氮的应用。5.根据权利要求3所述的脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌在提高养殖水体中的对虾存活率和生长率的应用。

技术总结
本发明公开了脱氮菌-赖氨酸芽孢杆菌及其应用所述菌株为赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)XW1，其保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.62679。本发明提供的赖氨酸芽孢杆菌XW1的脱氮效果研究结果表明，该菌株具有环境适应性较强、繁殖速度较快及在液体培养基中培养便利的特点，该菌株不仅能够实现在好氧条件下氨氮、亚硝酸盐以及硝酸盐氮的同步去除，且去除效率高，具有良好的异养硝化-好氧反硝化能力，可以有效解决水产养殖等水体氮含量过高的问题，还对养殖的凡纳滨对虾的生存和生长有积极作用，从而达到水质调节和增量增产的目的。从而达到水质调节和增量增产的目的。从而达到水质调节和增量增产的目的。


技术研发人员：孙成波 周佳宁 薛媛 侯丹清 代霖欣 陈国良 杨文杰 于建渤 宋宏斌 周腾 罗国玲
受保护的技术使用者：海茂种业科技集团有限公司 遂溪新海茂水产种业科技有限公司
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/7/11