L-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用

l-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及非酒精性脂肪肝病治疗，特别涉及l-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，nafld)是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance，ir)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，大多数nafld患者患有脂肪变性(non-alcoholic fatty liver,nafl)，一部分人患有非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)，并逐渐发展为肝纤维化，最终可进展为肝硬化和肝癌。目前，nafld是世界范围内最常见的慢性肝病，患病率从非洲的13.5％到中东的31.8％不等。由于nafld与代谢综合征密切相关，约有47.3
–
63.7％的2型糖尿病患者和高达80％的肥胖患者患有nafld。然而，一些体重指数健康的人仍可能患nafld，通常被称为非肥胖或瘦型nafld。
3.近几年，基于各种理论和靶点的治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物陆续进入临床研究。glp-1、acc、fxr、pparα、pparγ和loxl2等靶点是目前研究的热点，其中靶向pparα/pparγ的双重激动剂saroglitazar已被印度药品管理局批准用于非酒精性脂肪性肝炎的治疗。。奥贝胆酸(obeticholic acid)也在治疗非酒精性脂肪性肝炎ⅲ期临床试验中取得积极效果的药物，但由于会引发患者重度瘙痒和ldl水平的上升而被fda拒绝上市。除此以外，selonsertib、simtsuzumab、emricasan、firsocostst等都曾被认为是有希望治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，但是随着临床试验的开展，均由于治疗效果不明显相继宣布临床试验失败。由于非酒精性脂肪性肝炎发病机制复杂，在治疗上需要同时满足肝脏脂肪变性、炎症和纤维化的改善，目前很少有药物能够在临床上取得成功。
4.多巴胺(da)是中枢神经系统和外周神经系统合成的儿茶酚胺类神经递质。多巴胺在体内的生命活动中起着重要作用。da的生理效应由五种不同的g蛋白偶联受体(gpcr)介导。根据腺苷酸环化酶(ac)的激活或抑制，多巴胺受体分为两类：d1类(drd1和drd5)和d2类(drd2、drd3和drd4)多巴胺受体。其中多巴胺d2受体是当前的抗精神分裂症药物的主要靶点。多巴胺作用于drd2可弱化大脑皮质与纹状体的连接，而相应的抗精神病药，如舒必利、氟哌啶醇，可通过特异性拮抗drd2的方式抑制这种弱化，抗精神病药对drd2的拮抗作用是改善症状的重要机制。此外，竞争性drd2拮抗剂多潘立酮通过作用于外周系统，具有治疗由胃排空延缓、胃食道反流、食道炎引起的消化不良症的作用。目前尚没有文献报道d2多巴胺受体拮抗剂与非酒精性脂肪性肝炎之间存在有关联。
5.l-741626是一种选择性d2多巴胺受体拮抗剂，对人d2、d3和d4受体的ki值分别为2.4、100和220nm。l-741626在1996年由janusz j.kulagowski等人首次报道，用作高亲和力的d4受体拮抗剂。截止目前，未见有关于l-741626具有治疗非酒精性脂肪肝病疾病的报道。
6.

技术实现要素：

7.发明目的
8.本发明的目的是提供l-741626的新用途。本发明提供的是l-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病特别是非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
9.技术方案
10.l-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。特别是非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
11.在治疗非酒精性脂肪肝病特别是非酒精性脂肪性肝炎时，以l-751626为活性成分，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同靶的药物。如滴鼻剂，滴眼剂，及其它五官科药剂，散剂，丸剂，胶囊剂，片剂，微囊剂，软胶囊剂，膜剂，栓剂，注射剂，膏剂，散剂，冲剂，气雾剂以及各种外用制剂等。
12.本发明实验研究发现l-741626对非酒精性脂肪肝病特别是非酒精性脂肪性肝炎有明显的治疗作用。在体内实验中，以3mg/kg l-741626每天进行腹腔注射，可明显改善由高脂饮食诱导产生的小鼠非酒精性脂肪肝病的各项指标尤其是肝脏脂堆积。在体外实验中，l-741626具有降低由游离脂肪酸诱导的l02脂肪变性细胞脂堆积的作用，也具有改善lps诱导炎症反应的作用。同时在tgfβ1诱导lx2细胞纤维化中，l-741626也具有显著抗纤维化的作用。本实验结果提示，l-741626具有显著的治疗非酒精性脂肪肝病的作用。
13.本发明的关键点
14.1、l-741626可以治疗非酒精性脂肪肝病特别是非酒精性脂肪性肝炎；
15.2、l-741626可以明显降低肝脏细胞脂质积累；
16.3、l-741626可以明显改善由lps诱导的炎症反应；
17.4、l-741626可以明显改善由tgfβ1诱导的肝星状细胞纤维化。
18.有益效果
19.本发明所述的l-741626可用作活性成分，应用于治疗非酒精性脂肪肝病特别是非酒精性脂肪性肝炎药物中，开拓了l-741626的新用途，为治疗非酒精性脂肪肝病药物提供了新选择。具体的说：
20.1、l-741626可以改善肝脏脂肪堆积，特别是由高脂饮食诱导的肝脏脂堆积；
21.2、l-741626可以改善肝脏纤维化，特别是由脂肪变性或tgfβ1诱导引起的肝脏纤维化；
22.3、l-741626可以具有抗炎的作用，特别是由lps诱导的炎症反应。
附图说明
23.图1为l-741626液相结果；
24.图2为l-741626质谱鉴定结果；
25.图3为l-741626对hfd饮食诱导nash小鼠治疗作用；其中a为实验方案示意图，b为各组小鼠肝脏外观对比，c为各组小鼠体重、肝重以及肝指数情况对比，d为各组小鼠肝脏h&e染色以及油红o染色，e为各组小鼠血液以及肝脏tc、tg含量，f为各组小鼠肝脏cd11b以及f4/80染色结果-；
26.图4为l-741626对脂肪变性l02细胞脂代谢的影响；其中a为实验方案示意图；b为油红o染色结果；c为cd36、fasn、accα、pparγ的qpcr检测结果；d、tnfα、ccl5和cxcl10的qpcr检测结果；e为cd36、srebp-1以及faswestern blot检测结果；
27.图5为l-741626对lps诱导的raw264.7细胞炎症的影响；其中a为实验方案示意图，b为光镜下细胞状态，c为cd86免疫荧光结果，d为il-1β、il-6、il-17、il-18以及tnfαwestern blot检测结果，e为elasa试剂盒检测tnfα含量结果；
28.图6为l-741626对纤维化lx2细胞纤维化指标的影响，其中a和b为实验方案示意图，c和d为α-sma免疫荧光结果，e和f为α-sma和ⅰ型胶原western blot检测结果结果。
具体实施方式
29.实施例1：l-741626的来源以及纯度
30.所述l-741626购买于南京百鑫德诺生物科技有限公司(adooqbioscience)，cas no.81226-60-0，纯度＞98％(如图1)，质谱鉴定结果如图2。
31.实施例2：l-741626对hfd饮食诱导nash小鼠治疗作用
32.选用清洁级24只c57bl-6小鼠(由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号:scxk(苏)2008-0005)。实验动物饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22
±
2℃，湿度为50％-60％，12h光照和黑夜循环。实验中小鼠自由饮食和饮水。
33.适应性饲养1周后，随机分为3组，分别是正常组，模型组以及l-741626给药组。正常组选用正常饮食饲料喂养，模型组以及l-741626给药组选用高脂hfd饲料喂养。实验共持续饲养小鼠24周，给药组在小鼠喂养hfd饲料16周后，开始给予l-741626药物腹腔注射3mg/kg(图3a)。每天下午14点-16点按时给药，避免外界环境的干扰。
34.实验结束前，小鼠禁食不禁水12h。称取每只小鼠体重，处死时摘取眼球取血，处死后开腹，分离肝脏组织，称取肝组织，同时取肝脏小叶放入组织固定液中。
35.收集血清，测定小鼠血清中tc、tg的含量。用无水乙醇提取肝组织中的tc和tg并进行测定。取组织固定液中的肝组织进行he染色和油红o染色。最后，取放置在液氮中备用的组织，提取肝组织中的rna，进行qpcr检测。
36.结果：
①
肝脏外观结果显示，hfd饮食24周后，对比对照组，小鼠肝脏外观明显变为土黄色，肝脏表明明显具有颗粒感，并且，肝脏更大。在给予l-741626后，小鼠肝脏外观明显更加红润有光泽，更趋近与正常小鼠肝脏外观(图3b)。
37.②
对小鼠体重、肝重以及肝指数的评估显示，相比于造模组，给予l-741626的小鼠体重更低、肝重也明显更低，肝指数也明显更低(图3c)。
38.③
对小鼠血液指标的评估显示，相比于造模组，给予l-741626的小鼠血液tc、tg的含量明显降低(图3d)。
39.④
对小鼠肝脏脂含量的评估显示，相比于造模组，给予l-741626的小鼠肝脏tc、tg
的含量明显降低(图3e)。
40.⑤
小鼠肝脏h&e染色以及油红o染色的结果显示，相比于造模组，给予l-741626以后小鼠肝脏脂堆积明显减少，肝脏组织中脂肪空泡明显减少，h&e染色结果更趋于正常组小鼠(图4e)。。
41.⑥
小鼠肝脏cd11b免疫组化染色和f4/80免疫荧光染色结果显示，相比于造模组，给予l-741626以后小鼠肝脏炎性细胞浸润明显较少(图3f)。
42.实施例3：l-741626对脂肪变性l02细胞脂代谢的影响
43.1、l-741626对脂肪变性l02细胞脂堆积的影响
44.培养l02细胞接种于12孔板，在含有10％新生牛血清的1640培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、1mm po造模组、10μm l-741626组以及20μm l-741626组)加入培养基孵育24h。孵育完成后，每孔用pbs清洗两遍，然后将油红o储液以3：2(油红o:h2o)的比例稀释。将稀释好的油红o每孔200μl加入24孔板中，在37℃的环境中染色30min。染色完成后，每孔加入200μl60％的异丙醇漂洗2min。在荧光显微镜下拍取照片。
45.结果：1mm po造模组细胞内出现了明显的脂堆积，但在给予10μm或20μml-741626后，细胞内脂堆积明显改善，并呈现剂量依懒性(如图4a或4b)。
46.2、l-741626对脂肪变性l02细胞基因标志物的影响
47.将人l02细胞接种于6孔板，在含有10％新生牛血清的1640培养基中，37℃5％co2培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、1mm po造模组、1mm po+10μm l-741626组以及1mm po+20μm l-741626组)加入培养基孵育24h。孵育完成后，弃去培养液，pbs洗涤两遍。
48.①
每孔加入1ml trizol，提取rna，进行qpcr验证。
49.②
每孔加入200μl ripa裂解液，在冰上用枪头吹打贴壁细胞。然后将ripa裂解液转移至新的离心管中，在冰上孵育20min，使细胞充分裂解。孵育完成后，14000g，离心10min，转移上清液到新管中。加入sds上样缓冲液，在金属浴上95℃煮沸10min，后进行western blot检测。
50.结果：
①
qpcr结果显示，与1mm po造模组相比，1mm po+10μm l-741626组以及1mm po+20μm l-741626组脂肪合成和吸收的标志基因cd36、fasn、accα和pparγ明显降低，炎症标志基因tnfα、ccl5和cxcl10明显降低(如图4c和4d)。
51.②
western blot检测结果显示，与1mm po造模组相比，1mm po+20μm l-741626组cd36、srebp-1以及fas在给予l-741626刺激后，蛋白水平表达量明显降低(如图4e)。
52.实施例4：l-741626对lps诱导的raw264.7细胞炎症的影响
53.1、l-741626对lps诱导的raw264.7细胞形态以及膜表面标志物的影响
54.培养raw264.7细胞接种于96孔板，在含有10％胎牛血清的dmem培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、200ng/ml lps造模组、200ng/ml lps+5μm l-741626组)加入培养基孵育24h。孵育完成后，每孔用pbs清洗两遍，观察细胞形态，在荧光显微镜下拍取照片。拍照完成后，进行m1型巨噬细胞膜表面标志物cd86免疫荧光染色。染色完成后，荧光显微镜下拍取照片。
55.结果：
①
光镜结果显示，200ng/ml lps造模组raw264.7细胞明显分化，长出触角，
细胞形态变为梭形并且细胞贴壁更加牢固(如图5b)。
56.②
膜表面标志物cd86免疫荧光染色结果显示，200ng/ml lps造模组cd86膜表面标志物更多，而给予5μm l-741626后，cd86膜表面标志物染色明显减弱(如图5c)。
57.2、l-741626对lps诱导的raw264.7细胞促炎因子表达的影响
58.培养raw264.7细胞接种于6孔板，在含有10％胎牛血清的dmem培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、200ng/ml lps造模组、200ng/ml lps+5μm l-741626组)加入培养基孵育3h、6h、9h。孵育完成后，收集细胞，提取胞内蛋白进行westernblot检测。
59.结果：western blot检测显示，促炎因子il-1β、il-6、il-17、il-18以及tnfα在200ng/ml lps造模组中6h时有一定的积累，但是在200ng/ml lps+5μm l-741626组中积累并不明显(图5d)。
60.3、l-741626对lps诱导的raw264.7细胞tnfα分泌的影响
61.培养raw264.7细胞接种于6孔板，在含有10％胎牛血清的dmem培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、200ng/ml lps造模组、200ng/ml lps+5μm l-741626组)加入培养基孵育24h。孵育完成后，取培养基用elasa试剂盒进行培养上清tnfα含量测定。
62.结果：200ng/ml lps+5μm l-741626组中培养基tnfα含量相比于200ng/ml lps造模组明显减少(图5e)。
63.实施例5：l-741626对纤维化lx2细胞纤维化指标的影响
64.1、l-741626对po诱导的lx2细胞纤维化标志物的影响
65.培养lx2细胞接种于96孔板，在含有10％胎牛血清的1640培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、1mm po造模组、1mm po+10μm l-741626组)加入培养基孵育24h。孵育完成后，每孔用pbs清洗两遍，进行细胞纤维化标志物α-sma免疫荧光染色。染色完成后，荧光显微镜下拍取照片。
66.同样，培养lx2细胞接种于6孔板，在含有10％胎牛血清的1640培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、1mm po造模组、1mm po+10μm l-741626组)加入培养基孵育24h。收集细胞，提取胞内蛋白进行western blot检测。
67.结果：
①
α-sma免疫荧光染色显示，1mm po造模组lx2细胞α-sma标志物表达量明显升高，但是给予10μm l-741626组，相比于造模组α-sma标志物表达量明显降低(如图6c)。
68.②
western blot检测结果显示，1mm po造模组纤维化标志物α-sma和ⅰ型胶原表达量相比于对照组明显升高。但是，在1mm po+10μm l-741626组α-sma和ⅰ型胶原表达量相比于1mm po造模组明显下降(如图6e)。
69.2、l-741626对tgfβ1诱导的lx2细胞纤维化标志物的影响
70.培养lx2细胞接种于96孔板，在含有10％胎牛血清的1640培养基中，37℃5％co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(正常组、10ng/ml tgfβ1造模组、10ng/ml tgfβ1+10μm l-741626组)加入培养基孵育24h。孵育完成后，每孔用pbs清洗两遍，进行细胞纤维化标志物α-sma免疫荧光染色。染色完成后，荧光显微镜下拍取照片。
71.同样，培养lx2细胞接种于6孔板，在含有10％胎牛血清的1640培养基中，37℃5％
co2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，按照组别(10ng/ml tgfβ1造模组、10ng/ml tgfβ1+10μm l-741626组)加入培养基孵育24h。收集细胞，提取胞内蛋白进行western blot检测。
72.结果显示：
①
α-sma免疫荧光染色显示，10ng/ml tgfβ1造模组lx2细胞α-sma标志物表达量明显升高，但是给予10μm l-741626组，相比于造模组α-sma标志物表达量明显降低(如图6d)。
73.②
western blot检测结果显示，10ng/ml tgfβ1造模组纤维化标志物α-sma和ⅰ型胶原表达量相比于对照组明显升高。但是，在10ng/ml tgfβ1+10μm l-741626组α-sma和ⅰ型胶原表达量相比于1mm po造模组明显下降(如图6f)。
74.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

技术特征：
1.l-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

技术总结
本发明涉及非酒精性脂肪肝病治疗，特别涉及L-741626在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。L-741626显著改善肝脏脂肪堆积，特别是由高脂饮食诱导的肝脏脂堆积；L-741626显著改善肝脏纤维化，特别是由脂肪变性或TGFβ1诱导引起的肝脏纤维化；L-741626具有显著的抗炎作用，特别是由LPS诱导的炎症反应；本发明所述的L-741626可用作活性成分，应用于治疗非酒精性脂肪肝病特别是非酒精性脂肪性肝炎药物中，开拓了L-741626的新用途，为治疗非酒精性脂肪肝病药物提供了新选择。脂肪肝病药物提供了新选择。脂肪肝病药物提供了新选择。


技术研发人员：欧瑜 马鹏
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/7/11