一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤作为人类微环境与外部环境之间的沟通媒介，在代谢调节和信息交换中起着重要的作用。然而，由于受伤、烧伤或身体创伤，它经常遭受不同程度的缺陷。在一些严重的病例中，如大的全层皮肤缺损，需要很长时间才能实现完整的伤口修复。一般来说，愈合过程的时间越长，得到的结果就越差。因此，包括但不限于橡胶、泡沫、膜和静电纺丝纳米纤维，用以加速伤口愈合、促进伤口愈合、减少疤痕形成。其中，水凝胶敷料因其具有保持潮湿的伤口床、提供气体交换和吸收伤口液体等优越的性能而引起了人们的广泛关注。
3.然而，目前的水凝胶敷料仍存在一些有待解决的问题，包括缺乏环境适应性、机械弹性和附着力不足等。因此，开发一种多功能水凝胶敷料具有重要意义。特别是，可注射原位形成水凝胶是伤口敷料和其他生物医学更理想的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服上述技术不足，提出一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶及其制备方法和应用，解决现有技术中水凝胶敷料缺乏环境适应性、机械弹性和附着力不足的技术问题。
5.第一方面，本发明提供一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其具有水凝胶互穿交联网络结构，该水凝胶互穿交联网络由甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵互相交联而成，且甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：(0.3～1)。
6.第二方面，本发明提供一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶的制备方法，包括以下步骤：以水为溶剂，使甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵交联得到可注射原位交联抗菌导电水凝胶。
7.第三方面，本发明提供上述可注射原位交联抗菌导电水凝胶在医疗创面修复材料的应用。
8.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
9.本发明以生物相容性好的明胶为基底材料，通过接枝改性成甲基丙烯酰化明胶，再与季铵态阳离子抗菌剂甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵混合制成原液，注射在不规则伤口部位快速原位光交联形成水凝胶，以适应不同伤口环境，添加的季铵态阳离子抗菌剂不仅能改善单纯甲基丙烯酰化明胶水凝胶的机械性能，还能使混合双组份水凝胶具有良好的导电性、抗菌性、生物粘附性、生物相容性和血液相容性，可以促进血管生成、伤口愈合和减少炎症反应。
附图说明
10.图1为本发明实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4细胞毒性实验结果示意图；
11.图2为本发明实施例1、实施例2、对比例1和对比例2粘附强度实验结果示意图；
12.图3为本发明实施例1、实施例2、对比例1和对比例2电导率实验结果示意图；
13.图4为本发明实施例1、实施例2、对比例1和对比例2在抗菌实验(检测用菌为金黄色葡萄球菌)中菌落照片；
14.图5本发明实施例1、实施例2、对比例1和对比例2在抗菌实验(检测用菌为大肠杆菌)中菌落照片；
15.图6为本发明实施例1、实施例2与对比例1在电刺激大鼠皮肤伤口模型的实验结果照片。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
17.第一方面，本发明提供一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶，它具有水凝胶互穿交联网络结构，该水凝胶互穿交联网络由甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵互相交联而成。
18.甲基丙烯酰化明胶(gelma)为双键改性明胶，可通过紫外及可见光在光引发剂作用下交联固化成胶。gelma兼具天然和合成生物材料的特征，具有适于细胞生长和分化的三维结构、优异的生物相容性和细胞反应特性，其可替代人工基底膜或其他天然胶原蛋白水凝胶。此外，gelma具备良好的温敏凝胶特性、生物相容性和可降解性，其机械性能可调，能够调控细胞的粘附、促进伤口愈合和血管化。
19.本实施方式中，甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：(0.3～1)。若甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的加入量过多，将导致材料毒性显著增大；若甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的加入量过少，将不利于提高导电性、杀菌率、粘附性，也不利于加快伤口愈合。甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比优选为1：(0.4～0.7)。在该质量比范围内，形成的可注射原位交联抗菌导电水凝胶具有最优的性能。
20.本实施方式中，上述甲基丙烯酰化明胶通过以下步骤制备得到：
21.将明胶与pbs缓冲液混合溶解，得到混合液a；
22.将上述混合液a与甲基丙烯酸酐混合反应，随后经过透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酰化明胶。
23.其中，明胶与pbs缓冲液的用量比为1g：(10～50)ml，进一步为1g：10ml。
24.在本发明的一些具体实施方式中，明胶的纯度为90～99％，pbs缓冲液的ph为7.2～7.6，进一步为7.4。
25.其中，明胶与pbs缓冲液混合溶解的温度为50～60℃，明胶与pbs缓冲液混合溶解的时间为30～90min。
26.其中，明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为1g：(1～3)ml，进一步为1g：2ml。
27.在本发明的一些具体实施方式中，甲基丙烯酸酐的纯度为84～99wt％。
28.其中，甲基丙烯酸酐与混合液a混合反应的温度为50～55℃，时间为3～5h。
29.本实施方式中，上述可注射原位交联抗菌导电水凝胶的含水量为10～99％，本发明对此不作限制，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。在本发明的一些具体实施方式中，上述可注射原位交联抗菌导电水凝胶的含水量为50～90％，更进一步为60～80％。
30.本实施方式中，交联在光引发剂存在的条件下进行。本发明对光引发剂的具体种类不作限制，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。例如，光引发剂可以为光引发剂i2959。
31.在本发明的一些具体实施方式中，光引发剂i2959的纯度为90～99％，甲基丙烯酰化明胶与光引发剂的质量比为1：(0.01～1)，优选为1：(0.1～0.5)，更优选为1：(0.1～0.2)。
32.本实施方式中，交联在紫外光下进行。
33.在本发明的一些具体实施方式中，使甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵在365nm紫外灯下、距离光源5～10cm处交联30～60s得到可注射原位交联抗菌导电水凝胶。
34.第二方面，本发明提供一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶的制备方法，包括以下步骤：以水为溶剂，使甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵交联得到可注射原位交联抗菌导电水凝胶。
35.本发明首先将明胶与甲基丙烯酸酐反应，在明胶上面引入可光交联基团，保障了原位交联的可行性；随后加入季铵态阳离子抗菌剂单体形成混合溶液，通过注射器注射到不规则伤口区域，在紫外光作用下快速原位交联，即可得到抗菌性导电性好的水凝胶网络结构。加入的阳离子抗菌剂在提高水凝胶抗菌性能的同时配合电刺激治疗增强细胞间的电信号传导，从而促进血管生成及细胞增殖，加快伤口愈合的过程。
36.在本发明的一些具体实施方式中，上述可注射原位交联抗菌导电水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
37.将光引发剂避光超声溶解至水中，得到混合液ⅰ；
38.将甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液避光溶解至混合液ⅰ中，得到混合液ⅱ；
39.使混合液ⅱ交联得到可注射原位交联抗菌导电水凝胶。
40.其中，超声溶解的温度为40～50℃，超声溶解的时间为30～60min。
41.其中，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液中，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的含量为75～80％。
42.第三方面，本发明提供上述可注射原位交联抗菌导电水凝胶在医疗创面修复材料的应用。
43.为避免赘述，本发明以下各实施例和对比例中，部分原料总结如下：
44.明胶的纯度为99％；甲基丙烯酸酐的纯度为95％；pbs缓冲液的ph为7.4；光引发剂i2959的纯度为99％；甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵为75％的水溶液；透析袋购自赛默飞，截留分子量为14kd。
45.实施例1
46.(1)称取5g明胶加入到50ml pbs缓冲液中，在60℃水浴锅中加热溶解30min，然后在55℃水浴锅中以0.5ml/min的速度滴加10ml甲基丙烯酸酐，待完全加入后，55℃反应3h，然后在室温条件下透析7天，将溶液冷冻干燥72h，即制得甲基丙烯酰化明胶。
47.(2)称取0.05g光引发剂i2959加入到1ml超纯水中，50℃避光超声1h溶解。
48.(3)称取0.3g甲基丙烯酰化明胶加入到(2)中的溶液中，避光溶解。
49.(4)量取150μl的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵到(3)中的溶液中，避光混匀后，转移到1ml的注射器中，即得到可原位注射的混合溶液。
50.(5)在365nm的紫外灯下，距离光源8cm处进行光交联45s，最终得到抗菌导电水凝胶。
51.实施例2
52.实施例2与实施例1中的步骤相同，不同的在于步骤(4)中加入250μl甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。
53.对比例1
54.对比例1与实施例1中的步骤相同，不同的在于步骤(4)中不加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。
55.对比例2
56.对比例2与实施例1中的步骤相同，不同的在于步骤(4)中加入30μl甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。
57.对比例3
58.对比例3与实施例1中的步骤相同，不同的在于步骤(4)中加入500μl甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。
59.对比例4
60.对比例4与实施例1中的步骤相同，不同的在于步骤(4)中加入1000μl甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。
61.试验组
62.1、体外细胞毒性测试：先将实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制得的水凝胶灭菌后以0.1g/ml的浓度浸泡在完全培养基24h，然后将成纤维细胞接种在96孔板中，接种密度为5000个/孔。将孔板放在37℃培养箱中培养24h后吸走培养基，将浸泡过水凝胶的培养基转移到96孔板中，继续在培养箱中培养。24h后弃去培养基，用pbs缓冲液洗两遍后每孔避光加入含有mtt(噻唑蓝)和培养基的混合液，mtt和培养基的混合比例为1:9，37℃孵育4h后小心吸走上清液，每孔加入200μl的二甲基亚砜(dmso)溶解孔板底部蓝紫色结晶，用酶标仪在490nm处检测吸光度。其中培养基为阴性对照组，含有10％苯酚培养基混合液为阳性对照组。
63.结果如图1所示，可以看出实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的细胞存活率分别为98.86％、98.08％、95.86％和97.32％，材料毒性等级为1级；对比例3和对比例4的细胞存活率分别为58.12％和20.08％，材料毒性等级为2级和4级，高毒性。
64.2、血液相容性测试：取抗凝血用生理盐水稀释，稀释比例为4:5，将实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制得的水凝胶分别浸泡在生理盐水中，37℃水浴
半小时，然后添加稀释后的血样(0.2ml稀释血样/10ml生理盐水)，接着在37℃的水浴锅中孵育1h，离心5min，取上清液用紫外分光光度计在545nm处测量吸光度。其中超纯水为阳性对照组，生理盐水为阴性对照组。结果如表1所示。
65.表1实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的水凝胶的溶血实验结果
[0066][0067]
3、粘附拉伸试验：通过粘附-拉伸试验测定了不同含量的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵-甲基丙烯酰化明胶水凝胶的组织粘附强度。简单地说，首先将对比例1、对比例2、实施例1和实施例2应用于猪皮，粘合面积为25mm
×
25mm。然后用100n载荷的仪器以2mm/min的速度拉动样品，直到样品在37℃下分离。粘附强度由最大载荷除以初始粘合面积计算。
[0068]
结果如图2所示，对比例1粘附强度为1.9kpa，对比例2粘附强度为3.1kpa，实施例1粘附强度为8.6kpa，实施例2粘附强度为10.3kpa。
[0069]
4、电导率测试：试验通过电化学阻抗法测量对比例1、对比例2、实施例1和实施例2水凝胶的电导率，将水凝胶制成尺寸为10mm
×
10mm
×
0.2mm块状，将其夹在两个铂片电极中，连接电化学工作站，得到eis曲线图后拟合半径，得到阻抗值，利用以下公式计算电导率σ。
[0070][0071]
结果如图3所示，对比例1电导率为0s/cm，对比例2电导率为0.8
×
10-3
s/cm，实施例1电导率为3.2
×
10-3
s/cm，实施例2电导率为4.1
×
10-3
s/cm，说明单纯的甲基丙烯酰化明胶不具有导电性，而加入的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵在水凝胶网络中形成了连续的导电网络结构。
[0072]
5、抗菌测试：试验通过涂布平板法将菌液稀释涂布后计算菌落个数来表征材料的抗菌性能。
[0073]
杀菌率％＝(对照组cfu数-实验组cfu数)/(对照组cfu数)
×
100％检测用菌：金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus atcc6538)，大肠杆菌(escherichia coli atcc25922)。
[0074]
分别将厚度1mm的圆片状实施例1、实施例2、对比例1和对比例2制得的水凝胶灭菌后加入到含有1
×
108cfu/ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液的试管中，在37℃摇床里混合6h，之后用磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)稀释500倍，取100μl稀释液涂布到琼脂板上，置于37℃培养箱中培养24h，观察结果并计数菌落数。另设置一空白对照组，将含有1
×
108cfu/ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液的试管中，在37℃摇床里混合6h，之后用磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)稀释500倍，取100μl稀释液涂布到琼脂板上，置于37℃培养箱中培养24h，观察结果并计数菌落数。
[0075]
结果如图4-5所示，对比例1的菌落数和空白组菌落数相比无明显变化，对比例2的菌落数略有减少，实施例1和实施例2的菌落数明显减少。说明制备的水凝胶具有抑菌效果。杀菌率整理如表2所示。
[0076]
表2实施例1、实施例2、对比例1和对比例2所得水凝胶的杀菌率
[0077]
项目对比例1对比例2实施例1实施例2大肠杆菌抗菌率/％0.1912.7699.9999.99金黄色葡萄球菌抗菌率/％1.5539.8799.9999.99
[0078]
6、电刺激细胞实验：将实施例1、实施例2、对比例1和对比例2制得的水凝胶固定于24孔板底部，加入75％乙醇浸泡4h后，除去75％乙醇并晾干，用pbs缓冲液充分清洗，加入培养基浸润24h，然后弃去培养基。将成纤维细胞接种在24孔板内的水凝胶上，接种密度为5000个/孔，待细胞贴壁生长在水凝胶上后，在100mv电压下进行1小时电刺激，以培养基为对照组。48h后弃去培养基，每孔用pbs洗两遍后避光加入200μlcck-8(细胞活力检测试剂盒)和培养基的混合液，cck-8和培养基的混合比例为1:9，37℃孵育1h后取100μl于96孔板中，用酶标仪在450nm处检测吸光度，并计算细胞增殖率。结果如表3所示，说明在电刺激的情况下，实施例1和实施例2水凝胶可增强细胞间的电信号传导，加快伤口愈合的过程。
[0079]
表3实施例1和对比例1的水凝胶的电刺激细胞实验结果
[0080]
项目对比例1对比例2实施例1实施例2细胞增殖率/％(n＝3)107.19111.54131.78130.53
[0081]
7、电刺激大鼠皮肤伤口模型的实验过程：大鼠麻醉后，对背部进行脱毛处理并用75％乙醇消毒，之后在背部创建四个直径6mm伤口，并在每个伤口接种10μl 108cfu/ml金黄色葡萄球菌感染伤口半小时。第一个伤口不进行处理作为空白对照组，第二个、第三个和第四个伤口分别用对比例1、实施例1和实施例2制得的水凝胶处理，在100mv电压下进行1小时伤口电刺激愈合。结果如图6所示，实施例1和实施例2水凝胶处理的伤口愈合效果相当，比空白组和对比例1愈合效果好，说明实施例1和实施例2水凝胶可增强细胞间的电信号传导，加快伤口愈合的过程。
[0082]
综上，与现有技术相比，本发明的有益效果还包括：
[0083]
1、本发明选用的原材料生物相容性好，来源广泛，价格低廉；甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵安全无毒。
[0084]
2、本发明的制备过程简单，通过将甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵阳离子抗菌剂与甲基丙烯酰化明胶一步交联反应即可得到，既有了季铵态化合物的抗菌性，又形成了连续、均匀的导电网络结构。
[0085]
3、本发明可通过注射器应用到不规则伤口区域，原位交联成水凝胶，扩大了水凝胶的应用范围。
[0086]
4、本发明制备的抗菌导电水凝胶，在外接电源的作用下通过电刺激治疗时能增强细胞间的电信号传导，促进伤口愈合。
[0087]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据
本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶具有水凝胶互穿交联网络结构；其中，所述水凝胶互穿交联网络由甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵互相交联而成，且所述甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：(0.3～1)。2.根据权利要求1所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：(0.4～0.7)。3.根据权利要求1所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶通过以下步骤制备得到：将明胶与pbs缓冲液混合溶解，得到混合液a；将上述混合液a与甲基丙烯酸酐混合反应，随后经过透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酰化明胶；其中，所述明胶与pbs缓冲液的用量比为1g：(10～50)ml；所述明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为1g：(1～3)ml；所述甲基丙烯酸酐与混合液a混合反应的温度为50～55℃，时间为3～5h。4.根据权利要求1所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶的含水量为10～99％。5.根据权利要求1所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述交联在光引发剂存在的条件下进行。6.根据权利要求5所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述光引发剂为光引发剂i2959，所述光引发剂的纯度为90～99％，所述甲基丙烯酰化明胶与光引发剂的质量比为1：(0.01～1)。7.根据权利要求1所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶，其特征在于，所述交联在紫外光下进行。8.一种如权利要求1～7中任一项所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以水为溶剂，使甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵交联得到可注射原位交联抗菌导电水凝胶。9.根据权利要求8所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将光引发剂避光超声溶解至水中，得到混合液ⅰ；将甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液避光溶解至混合液ⅰ中，得到混合液ⅱ；使混合液ⅱ交联得到可注射原位交联抗菌导电水凝胶；其中，所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液中，所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的含量为75～80％。10.如权利要求1～7中任一项所述可注射原位交联抗菌导电水凝胶在医疗创面修复材料的应用。

技术总结
本发明公开了一种可注射原位交联抗菌导电水凝胶及其制备方法和应用。该可注射原位交联抗菌导电水凝胶具有水凝胶互穿交联网络结构，水凝胶互穿交联网络由甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵互相交联而成，且甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：(0.3～1)。本发明所得混合双组份水凝胶具有良好的导电性、抗菌性、生物粘附性、生物相容性和血液相容性，可以促进血管生成、伤口愈合和减少炎症反应。伤口愈合和减少炎症反应。伤口愈合和减少炎症反应。


技术研发人员：张甜 韦文龙 刘子儒 郑雯 皮埃尔
受保护的技术使用者：武汉理工大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/11