一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法

1.本发明涉及医用材料制备的技术领域，具体涉及一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法。


背景技术：

2.聚醚醚酮(peek)材料是一种半结晶有机高分子材料，由于具有良好的耐腐蚀性、生物相容性、极少干扰影像学检查和接近天然骨组织的机械性能而越来越受到学者们的关注。自1992年以来，peek被应用于口腔领域，开始是基于其美学修复的优势，之后则更注重其在颌骨种植体植入的应用。而peek受到临床医生越来越多的青睐，主要还基于其以下的优势：
3.①
化学性质稳定：peek材料具有耐腐蚀，化学稳定性高等优点，体内环境下peek表现为生物惰性。其生物安全实验证实，peek材料不存在细胞、组织、遗传等毒性，同时体外及体内实验证实，peek材料与上皮、肌肉、骨、软骨等多种细胞及组织相容性良好。
4.②
机械性能适宜：peek材料的弹性模量(4gpa)及拉伸强度(93mpa)等生物力学参数较钛及钛合金(110gpa；897-1034mpa)更接近皮质骨(16-23gpa；80-150mpa)，可避免“应力屏蔽”效应并模拟体内细胞生物力学微环境。
5.③
不干扰影像学检查：peek材料在临床x线片上呈现透射影，可以避免x线及ct检查时出现的伪影，同时其也可以避免磁共振散射伪影以及植入体产热等现象，从而在关节外科、神经外科中的应用优势巨大。
6.④
色泽美观、易于调整：由于钛植入体会使上颌颊侧呈现不同程度的灰色，即使患者伴有轻度牙龈萎缩也会导致修复体颜色暴露影响美观。而peek材料呈白色，这使其非常适用于口腔前牙等医学美学区。此外，peek在与切削钻高速旋转接触中不会产生热量，这将有利于植入体在临床手术操作中的临时调整及术中成型，提高了植入体临床使用中的容错率及适用范围。由此，peek被认为是传统钛合金骨植入体的理想替代材料，近年来其临床应用推广逐渐增加，在国外特别是欧美发达地区成为骨折固定、骨缺损重建修复等的新兴手段之一。
7.然而在实际应用中我们发现，peek材料过于惰性，缺乏生物活性位点，无法与周围骨组织形成有效骨结合。植入后仅靠螺钉固位，局部应力较高，长期应用中螺钉脱落、局部断裂等力学风险较高，严重制约了该方法在颌骨缺损与畸形临床治疗中的应用与推广。因此对peek材料进行改性，提高其生物活性具有重要的临床价值与研究意义。
8.peek材料的改性方式主要包括共混改性、表面改性等。共混改性(blending modification)是利用生物活性组分与生物惰性的peek基体进行复合来提高peek的生物活性。然而，共混改性会对peek复合材料的机械性能产生严重影响，复合材料机械强度和延展性下降，同时也造成共混材料表面耐磨性降低，出现共混材料颗粒游离等风险，表面涂层改性可以在避免影响peek材料的基本力学性能的前提下，活化peek材料的表面，因此成为peek材料的主流改性方式。
9.骨传导性(osteoconduction)是指材料为新骨的形成及血管长入所提供适宜支架，这需要材料具有相应诱导血管新生功能与空间尺度以适宜细胞黏附生长、迁移的表面特征。骨诱导性(osteoinduction)是指材料直接诱导间充质干细胞分化为骨原细胞、成骨细胞，进而形成骨组织的性质，具有骨诱导性的材料即使在非骨环境中也具有一定的促新骨生成的能力。上述骨传导性和骨诱导性的定义和特点，提示我们可以从peek材料的界面物理结构和化学组成两方面进行仿生改性，从而赋予peek材料所需的骨传导和骨诱导性能，促进骨整合效果。
10.骨组织的微米级结构由胶原纤维及其上的矿物沉积构成，是力学承载的基本单元。微米级结构可以最大限度的增加种植体表面与周围矿化骨组织的嵌合，在润湿性良好的前提下也可以显著提高成骨细胞黏附及迁移能力。因此模拟天然骨组织胶原纤维束的结构以及其上的矿物质，可以有效提高peek材料的生物活性，促进其与骨组织的结合。
11.模仿天然骨组织的微/纳米结构是促进植入材料骨整合的有效手段。目前，已经进行了大量的研究来修饰材料表面的形貌。高度规则的形貌，如纳米线、纳米柱、纳米针、纳米锥、纳米吸管和纳米槽，是研究细胞和材料的响应机制的有效工具。然而，多数高度规则的纳米形貌受到结合强度低的限制，因此缺乏临床转化潜力，而且其不能完全模拟体内骨组织的微/纳米结构。骨组织的细胞外基质是由500nm～1μm的纤维束组成的不规则纤维网状结构，纤维束在细胞附着、干细胞分化和矿化组织形成等方面具有明显的成骨优势。因此构建具有高结合强度的无序3d类支架表面可以一定程度上解决高度规则纳米形貌的结合强度低、仿生不足的劣势。
12.模拟骨组织的组成是材料改性的另一种策略。羟基磷灰石(ha)由磷酸钙(ca-p)组成，它是骨组织的主要化学成分(约70wt％)，通常被认为是一种可以增加骨整合的生物活性涂层材料。然而，高结晶度ha基本不可生物降解，其促成骨生物活性较差。与此相反，无定形ha和离子取代ha具有更好的生物降解特性，因此更有利于细胞附着和成骨分化。此外，在体内形成骨的成骨细胞覆盖的表面主要由无定形ha和无定形磷酸钙组成，而骨吸收的破骨细胞覆盖的表面是高度结晶的ha。因此，在材料表面模拟无定形ha可能更有利于提高其成骨活性。
13.在天然骨骼中，胶原纤维等有机成分和钙、磷酸盐等无机成分交织在一起，形成微米级矿化纤维束结构。矿化胶原纤维束的复合结构为体内矿化和成骨提供初始位点，调节体内成骨微环境，最终赋予骨组织韧性和承载强度。有趣的是，peek表面磺化产生的网状纤维束结构类似于骨组织中胶原纤维束的结构，但在没有活性因子的情况下其生物活性可忽略不计。因此，更有效地负载矿物成分制备仿生矿化胶原纤维束表面可能是对peek表面进行仿生改性以提高其成骨性能的新研究方向。
14.磁控溅射(magnetron sputtering)在20世纪70年代迅速发展起来，是以高能粒子轰击靶材表面，使靶材原子脱离晶格转移到基体材料表面制备涂层，具有易于控制、成膜均匀一致、成膜速率高等特点，广泛应用于金属、高分子、陶瓷等多种材料表面涂层的制备。因此通过磁控溅射技术可以有效实现上述的仿生改性涂层的构建。


技术实现要素：

15.针对上述存在的技术问题，本发明提出了一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，
通过浓硫酸酸蚀(磺化)+磁控溅射羟基磷灰石，通过调整特定参数在peek表面构建出沿磺化纤维束均匀沉积的非晶态羟基磷灰石的仿生涂层。该涂层可以模拟天然骨组织矿化胶原纤维束的三维网状形貌以及纤维束之间的非晶态羟基磷灰石成分，有效促进体外细胞黏附以及成骨分化，并提高体内植入后的骨传导以及骨诱导性能，最终促进骨整合。
16.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
17.一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，包括以下步骤：
18.步骤1：将聚醚醚酮材料依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗；
19.步骤2：将步骤1超声清洗后的聚醚醚酮材料浸入98％浓硫酸中进行酸蚀，取出后在超纯水中清洗，完成后依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗；
20.步骤3：将步骤2酸蚀后的聚醚醚酮材料作为基体，将羟基磷灰石作为靶材，通过磁控溅射在聚醚醚酮材料表面溅射羟基磷灰石，进而实现在聚醚醚酮材料表面制备仿生矿化纤维束的生物活性涂层。
21.优选的，所述步骤1中丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗的时间均为15min。
22.优选的，所述步骤2浓硫酸中进行酸蚀的时间为3min。
23.优选的，所述步骤3中磁控溅射的主溅射室和进样室真空度为5
×
10-5-8
×
10-5
pa，功率200w，溅射时间为2h。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.首先，本发明使用浓硫酸磺化在peek表面形成网状交织的丝状纤维支架结构。然后，通过磁控溅射将其用非晶态羟基磷灰石封装，形成类似于矿化胶原纤维束结构的表面。这种新的仿生表面结合了非晶态羟基磷灰石(体内成骨区的核心成分)的成分和矿化胶原纤维束的物理微观结构刺激的双重优点。而且，矿物盐和纤维的复合设计也解决了矿物盐涂层固有的脆性问题。最后，该涂层提高了骨传导以及骨诱导性能，保证了成骨活性和骨整合，使peek种植体的骨整合效果达到甚至部分超过临床常用的钛种植体。
附图说明
26.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
27.在附图中：
28.图1为本发明的方法流程图；
29.图2为本发明的磺化参数筛选的扫描电镜图；
30.图3为最佳磺化参数处理后，进一步磁控溅射参数的筛选，扫描电镜观察；
31.图4为本发明制备的涂层表征：原子力(afm)、粗糙度、xps、xrd、亲水性以及划痕检测；
32.图5为本发明体外细胞黏附检测：dapi染色及定量统计、电镜以及共聚焦观察细胞形态；
33.图6为本发明体外成骨分化检测：alp(碱性磷酸酶)检测、成骨相关基因(col-1、runx2、ocn、opn)的qrt-pcr检测；
34.图7为本发明植入micro-ct三维重建以及统计结果：松质骨段(骨传导+骨诱导)以及骨髓腔段(骨诱导)；
35.图8为本发明植入硬组织切片vg染色，定量统计骨种植体接触比例(bic％)以及双荧光标记及定量统计。
具体实施方式
36.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
37.实施例：
38.一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，包括以下步骤：
39.步骤1：将聚醚醚酮材料依次使用丙酮、乙醇、去离子水分别进行超声清洗15min；
40.步骤2：步骤2为磺化操作，具体是将步骤1超声清洗后的聚醚醚酮材料浸入98％浓硫酸中进行3min酸蚀，取出后在超纯水中清洗15min，清洗完成后依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗，最后置于烘干机中烘干备用。
41.利用sem进行观察，成功在98%浓硫酸处理3min的参数下，在peek表面制备出了最理想的立体疏松的三维多孔网状结构，孔洞间为细密束状纤维均匀连接的基底形貌(图2中a)，这与矿化胶原纤维束——人体骨组织基本结构单元，自然形成的三维网状松质骨结构极为相似。然而，如果降低硫酸浓度，则该三维网状结构将变得扁平，且孔洞间出现不均匀的连接(图2中b)；降低硫酸浓度和处理时间，材料表面则会出现较大的二维孔洞，并未能形成人体骨内的立体三维网状结构(图2中c)。同时，如果延长浓硫酸处理时间，peek材料表面虽然依旧可以看到细密的纤维束，但其最外层的纤维丝成卷曲状态(图2中d)。
42.步骤3：将步骤2酸蚀后的聚醚醚酮材料作为基体，将羟基磷灰石作为靶材，将靶材和基体放入主溅射室和进样室，并对主溅射室和进样室抽真空至5
×
10-5-8
×
10-5
pa，，在进样室对种植体基体进行预溅射清洗20-40分钟，通过磁控溅射技术沿聚醚醚酮材料的三维网状纤维束均匀沉积羟基磷灰石层，进而实现在聚醚醚酮材料表面制备仿生矿化纤维束的生物活性涂层，得到的仿生矿化胶原纤维束径约0.34
±
0.026μm，纤维束直径约1.83
±
0.351μm。
43.随后，我们进一步利用磁控溅射技术在其表面溅射羟基磷灰石（ha）来模拟人体骨中的钙-磷成分。利用sem可以看到，ha经过磁控溅射处理可均匀包裹于光滑peek表面，形成非晶态球状岛状的钙-磷薄膜(图3中a)。基于此，利用磁控溅射在上述所制备的最优三维多孔网状基底下进一步包裹该纤维支架。并成功在射频功率为200w、直流偏压为100v、沉积时间为2h的参数下制备出了孔洞以及纤维束清晰可见，ha沿纤维束均匀沉积的最理想基底形貌(图3中b)。然而，如果增强射频功率，该基底三维网状结构几乎被ha薄膜完全覆盖，其孔洞以及纤维束结构基本不可见；增强射频功率和沉积时间，可见该基底的多孔结构，但ha沿孔洞间沉积不均匀，其纤维束形态不可见(图3中c-d)。此外，从纤维束的宽度和间距上的定量结果来看，200w、2h的参数处理下，其矿化纤维束的形态更为明显，矿化纤维束的直径为0.34
±
0.026μm，与天然骨组织矿化胶原纤维束直径一致。而290w、3h的参数处理下，矿化纤维束被覆盖，形成薄膜形态(图3中e-f)。
44.综上，我们的研究采取两步法，通过特定磺化以及磁控溅射参数(图3中g)，我们在peek表面成功构建出了从结构和成分双重模拟矿化胶原纤维束（人体骨组织基本结构单元）的仿生矿化纤维束支架表面。
45.进一步材料表征，实验分组：将材料分为p组(pure peek,纯peek)、sp组(speek,表面经最佳磺化参数处理的peek)、spha组(speek+ha,表面经最佳磺化和最佳磁控溅射参数处理的peek)和ti组(纯钛)。
46.通过atomic force microscopy（afm）、x-ray photoelectron spectroscopy (xps)、x-raydiffraction（xrd）、接触角(cas)和扫描电子显微镜(sem)对各组材料进行表征。afm数据显示(图4中a, b)，the average roughness (ra) of p vs. sp vs. sp-ha vs. ti was 0.028 vs. 0.15 vs. 0.12 vs. 0.049 (μm)。与p组相比，sp组的粗糙度有显著差异（p＜0.0001），提示sp组材料表面可以形成很好的支架结构；与sp组相比，spha组的粗糙度有一定的下降（p＜0.01），但依旧比p组和ti组高（均p＜0.0001），说明spha组材料表面依旧能够形成一个较好的支架结构。通过xps, xrd分析(图4中c, d)spha组表面元素及晶相，证明在其表面成功沉积有ha中的ca、p、o元素，且该沉积的ha为非晶态的。接触角(cas)检测结果发现(图4中e)， p、sp、sp-ha和ti组的接触角分别为91.83
±
3.10
°
、107.57
±
3.52
°
、21.40
±
3.22
°
和72.23
±
4.04
°
。与p相比，磺化处理后的sp接触角增大（p＜0.01）；与sp相比，磁控溅射ha后spha的接触角明显变小（p＜0.0001），说明其亲水性较sp好；且spha的亲水性更优于ti（p＜0.0001）。随后，我们在spha组材料表面做了划痕(图4中f)，sem结果显示，低倍下在材料表面可见均匀的三维网状基底，未见薄膜状涂层以及明显的边缘脆裂。高倍下观察划痕边缘，可见纤维网塌陷，而非涂层断裂脱落。
47.为了研究该支架材料的生物相容性，我们在各组材料表面接种等量的大鼠p3代bmmscs细胞，分别于接触30min、60min和120min后，利用共聚焦显微镜对材料表面粘附的细胞数量进行观察分析。结果显示(图5中a, b)，四组材料表面的细胞数量都随时间增加而增加。与p组、sp组相比，spha组bmmscs细胞粘附的数量在任何时间点上均明显增多，差异均具有统计学意义；与ti组相比，spha组bmmscs细胞粘附的数量在30min时略有减少（p＜0.05），在60min和120min时均无统计学意义。利用sem和免疫荧光染色观察bmmscs细胞的粘附状态可见(图5中c, d)，与p组、sp组相比，spha组bmmscs细胞有更多的丝状伪足，细胞形态更加伸展；与ti组相比，两组bmmscs细胞均可很好的伸展，但spha组基于磺化后的三维网状结构，使黏附细胞有了更多的锚点可与材料接触更加紧密。
48.为了评估所制备的仿生支架材料对bmmscs成骨分化能力的影响，我们在各组材料表面接种等量的大鼠p3代bmmscs细胞，通过成骨分化诱导培养基培养7天后，采用alp染色及定量分析检测bmmscs细胞在各组材料上培养的alp表达变化。alp检测结果显示(图6中a, b)，与p组、sp组相比，spha组的alp染色深度增强、分布面积增大，定量分析alp的活力均明显增高（均p＜0.01）；与ti组相比，spha组alp的alp染色深度与分布面积差异不明显，其活力变化无统计学意义。说明spha组对bmmscs具有早期成骨分化具有一定的影响作用。为了进一步验证该支架材料成骨相关基因的表达变化，我们在条件培养基诱导成骨分化的第7天通过实时定量聚合酶链反应(qrt-pcr)检测i型胶原（col
‑ⅰ
）、编码特异性转录因子（runx2）、骨钙素（ocn）和骨桥蛋白（opn）的表达水平发现(图6中c-f)，与p组、sp组相比，spha组的col
‑ⅰ
、runx2、ocn和opn表达均显著上调（均p＜0.05）；与ti组相比，spha组col
‑ⅰ
、runx2、ocn和opn的表达均不具有统计学意义。
49.为了进一步探究所制备的仿生支架材料对种植体骨整合的影响，我们利用sd大鼠构建了股骨缺损动物模型，在大鼠的两侧股骨植入各组种植体材料。术后8周处死大鼠，取
股骨通过micro-ct评估种植体周围骨结合效果；利用硬组织切片vg染色检测种植体周围骨生成与骨结合的情况；此外，于处死前10天，利用连续荧光标记法检测种植体周围的新骨形成过程。
50.micro-ct检测观察分为松质骨段和骨髓腔段两部分(图 7)。首先，松质骨段是选择了干骺端下方2mm处松质骨段，并选取2mm范围感兴趣区，进行micro-ct分析。可见(图7中a)，横断面二维影像显示，spha组新生骨连续，沿种植体周围均匀环状分布，p组和sp组为不连续的环状分布，而ti组的环状分布存在明显的间断缺损。三维重建图像进一步验证，spha组具有更高的新生骨量。进一步的定量统计学分析表示(图7中b-e)，spha组具有最高的新生骨量，优于阳性对照组ti，显著优于p组以及sp组。同时，spha组具有最高的tbth，tbn以及较低的tbsp，说明spha组的骨改建较为成熟，种植体周围新生骨质良好，以板层骨为主，具有良好的骨传导性和骨诱导性。而p组和sp组尚处于编织骨向板层骨过渡期。
51.随后，采用相同的参数分析骨髓腔段2mm范围的感兴趣区，可见(图7中f)spha组的横断面以及三维重建影像均提示其种植体周围新生骨连续且骨量最多，而p组和sp组种植体周围新生骨分布存在更多缺损且骨量较少，ti组新生骨最不连续且骨量最少。定量统计学分析显示(图7中g-j)，spha组具有较高的tbth、tbn以及最低的tbsp，说明其在保证骨量的前提下，实现了良好的骨质改建具有良好的骨诱导性。而p组较高的tbth，tbsp以及最低的tbn证明其仅存在散在的骨改建。sp 组的骨量与p组无明显差异，但其较低的tbth和tbsp以及较高的tbn提示骨改建相比于p组更加活跃。ti组骨量最低，最低的tbth以及最高的tbn和较高的tbsp证明其骨改建尚不完善，骨诱导性差。
52.vg染色结果及其定量分析显示(图8中a-b)，四组种植体材料周围均有新骨生成。p组以及sp组骨-种植体接触界面之间存在明显的纤维组织，未见连续的直接骨接触。spha组骨种植体界面存在连续的直接骨接触，纤维组织基本不可见；与其他三组相比，spha组的骨种植体接触比例均明显增高（均p＜0.05）。ti组的种植体与骨组织之间存在纤维组织，但直接骨接触程度明显优于p组以及sp组，且差异均具有统计学意义（均p＜0.01）。连续荧光标记中绿色代表钙黄绿素，红色代表四环素，可见(图8中c-d)，两种荧光间距分别为p组0.51
±
0.14单位、sp组0.24
±
0.08单位、spha组1.91
±
0.28单位、ti组1.26
±
0.10单位。与其他三组相比，spha组的荧光间距最大，新骨形成速率最快，差异均具有统计学意义（均p＜0.05），说明spha组对骨沉积和骨重塑的促进作用更强。
53.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：将聚醚醚酮材料依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗；步骤2：将步骤1超声清洗后的聚醚醚酮材料浸入98％浓硫酸中进行酸蚀，取出后在超纯水中清洗，完成后依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗；步骤3：将步骤2酸蚀后的聚醚醚酮材料作为基体，将羟基磷灰石作为靶材，通过磁控溅射在聚醚醚酮材料表面溅射羟基磷灰石，进而实现在聚醚醚酮材料表面制备仿生矿化纤维束的生物活性涂层。2.根据权利要求1所述的一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，其特征在于：所述步骤1中丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗的时间均为15min。3.根据权利要求2所述的一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，其特征在于：所述步骤2浓硫酸中进行酸蚀的时间为3min。4.根据权利要求3所述的一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法，其特征在于：所述步骤3中磁控溅射的主溅射室和进样室真空度为5
×
10-5-8
×
10-5
pa，功率200w，溅射时间为2h。

技术总结
本发明涉及医用材料制备的技术领域，具体涉及一种对聚醚醚酮表面仿生改性的方法。包括步骤1：将聚醚醚酮材料依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗；步骤2：将超声清洗后的聚醚醚酮材料浸入98％浓硫酸中进行酸蚀，取出后在超纯水中清洗，完成后依次使用丙酮、乙醇、去离子水进行超声清洗；步骤3：将酸蚀后的聚醚醚酮材料作为基体，将羟基磷灰石作为靶材，通过磁控溅射在聚醚醚酮材料表面溅射羟基磷灰石，进而实现在聚醚醚酮材料表面制备仿生矿化纤维束的生物活性涂层。本发明制备的涂层可以模拟天然骨组织矿化胶原纤维束的三维网状形貌以及纤维束之间的羟基磷灰石成分，有效促进体外细胞黏附以及成骨分化，并促进体内骨整合。并促进体内骨整合。并促进体内骨整合。


技术研发人员：孔亮 辛河 刘富伟 贾雪连 张周阳 李云鹏 蔡卜磊 史茜雯 陈怡成 朱思敏 田磊 丁明超 戴太强 王乐 高晔 侯燕 吕前欣
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2023.02.10
技术公布日：2023/7/11