一种糖基转移酶变体及其在AA-2G制备中的应用的制作方法

一种糖基转移酶变体及其在aa-2g制备中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种糖基转移酶变体及其在aa-2g制备中的应用，属于酶工程技术领域。


背景技术：

2.目前l-抗坏血酸-2-葡萄苷(aa-2g)生产几乎都是采用酶催化，所用的酶主要是环糊精葡萄糖基转移酶(cgtase)和蔗糖磷酸化酶，前者所用糖基供体主要有液化淀粉、麦芽糊精、环糊精等，后者所用供体为蔗糖，糖基受体均为维生素c。与蔗糖磷酸化酶不同的是，采用环糊精葡萄糖基转移酶催化生产aa-2g通常以β-环糊精、液化淀粉或麦芽糊精为糖基供体，以维生素c为受体，在一定的温度和ph条件下进行反应，此时反应过程中会有大量的aa-2gn以及aa-2g，需要在催化结束后通过加入糖化酶进一步糖化处理，将aa-2gn上多余的糖基切除得到aa-2g，完成催化反应。
3.然而现有技术中的cgtase催化效率较低，aa-2g酶催化制备周期普遍较长(需要24-72h)此外，反应还存在严重的平衡问题，aa-2g收率最高仅能达到40-60％左右。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶cgtase-tx突变体，所述突变体是在解木聚糖嗜热厌氧杆菌(thermoanaerobacterium xylanolyticum)来源的环糊精葡萄糖基转移酶的基础上，对第46位亮氨酸、第89位天冬氨酸、第152位酪氨酸、第190位甘氨酸、第269位天冬酰胺、第325位异亮氨酸中的一种或多种进行了突变。
5.在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，获得突变体l46f。
6.在一种实施方式中，所述突变体是将第89位天冬氨酸突变为缬氨酸，获得突变体d89v。
7.在一种实施方式中，所述突变体是将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，获得突变体y152g。
8.在一种实施方式中，所述突变体是将第190位甘氨酸突变为色氨酸，获得突变体g190w。
9.在一种实施方式中，所述突变体是将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸，获得突变体n269a。
10.在一种实施方式中，所述突变体是将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体i325k。
11.在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体l46f\y152g\n269a\i325k。
12.在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第89位
天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第190位甘氨酸突变为色氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体l46f\d89v\g190w\i325k。
13.在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第89位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体l46f\d89v\y152g\i325k。
14.在一种实施方式中，所述突变体以seq id no.1所示的氨基酸序列为出发序列。
15.本发明还提供了编码所述突变体的基因。
16.本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。
17.在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pet系列质粒。
18.本发明还提供了表达所述突变体的重组微生物细胞。
19.在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。
20.在一种实施方式中，所述微生物细胞是以大肠杆菌为宿主，以pet-28a(+)为表达载体，表达所述突变体。
21.本发明还提供含有所述微生物细胞的细胞催化剂。
22.在一种实施方式中，所述细胞催化剂是将所述重组微生物细胞在培养基中培养一段时间，收集具有环糊精葡萄糖基转移酶活性的细胞培养液。
23.在一种实施方式中，所述细胞催化剂按如下方法制备：将所述重组微生物在培养基中培养至菌液od达到0.6～0.8，加入iptg诱导酶的表达，诱导一段时间后收集菌体。
24.在一种实施方式中，所述细胞催化剂的酶活可达100000u/kg。
25.在一种实施方式中，所述培养基为lb培养基或tb培养基。
26.在一种实施方式中，所述诱导剂的添加量为0.05～0.15mmol/l。
27.在一种实施方式中，所述诱导是在20～25℃诱导20～28h。
28.本发明还提供所述突变体或所述细胞催化剂在催化生产l-抗坏血酸-2-葡萄苷中的应用。
29.在一种实施方式中，所述应用是将所述突变体或所述细胞催化剂在含β-环糊精和l-抗坏血酸的反应体系中催化合成l-抗坏血酸-2-葡萄苷。
30.在一种实施方式中，反应体系中的酶的添加量≥1000u/l。
31.在一种实施方式中，反应体系中的细胞催化剂的添加量≥10mg/ml。
32.在一种实施方式中，所述反应是在25～30℃反应至少3h。
33.有益效果：
34.1、本发明通过分子改造得到了新cgtase-tx突变体，该突变体酶催化活性明显提高，相对活性是野生酶的123％～298％，比酶活提高至6.76u/mg～16.2u/mg。
35.2、本发明将cgtase-tx突变体用于aa-2g的酶催化生产，使催化周期相比于野生型的24h显著缩短至10h甚至更短，aa-2g收率提高至50％以上，且其催化特异性更好，经液相检测，反应产物中无aa-5g、aa-6g及aa-3g等副产物存在。
附图说明
36.图1为cgtase催化生产aa-2g示意图。
37.图2为cgtase催化生产aa-2g液相图。
具体实施方式
38.以cgtase-tx为野生酶，对cgtase-tx催化口袋附近氨基酸残基进行分子改造突变。具体以来源于thermoanaerobacterium xylanolyticum的环糊精葡萄糖基转移酶(cgtase-tx)为亲本进行蛋白质工程改造。
39.本实施例涉及的实验材料、试剂和器材，如下表。
40.表1本技术一些实施方式中涉及的试剂
41.primestar max酶takara宝日医生物技术有限公司seamless cloning kit生工生物工程有限公司taq dna聚合酶takara宝日医生物技术有限公司ex taq buffertakara宝日医生物技术有限公司dntp mix(2.5mm)takara宝日医生物技术有限公司ncoⅰ、ecorⅰ、dpnⅰ限制性内切酶takara宝日医生物技术有限公司dl 10000marker/dl 10000markertakara宝日医生物技术有限公司t4 dnaligase生工生物工程有限公司酵母粉阿拉丁生化科技股份有限公司胰蛋白胨阿拉丁生化科技股份有限公司琼脂粉阿拉丁生化科技股份有限公司nacl阿拉丁生化科技股份有限公司β-环糊精阿拉丁生化科技股份有限公司l-抗坏血酸阿拉丁生化科技股份有限公司
42.表2本技术一些实施方式中涉及的试剂
[0043][0044][0045]
检测方法：
[0046]
aa-2g液相检测方法(hplc法)：催化反应结束后，将反应液进行离心处理
(10000rpm)，后取上清20μl，加入纯水稀释至2000μl，用0.22μm滤膜过滤后进样，并根据吸收峰面积代入外标计算公式，计算aa-2g收率。aa-2g收率计算方法如下：
[0047][0048]
其中a为aa-2g催化反应液样品测得的aa-2g峰面积，n为稀释倍数，k为aa-2g单位浓度的峰面积，w为底物抗坏血酸全部转化成aa-2g理论得到的aa-2g浓度。
[0049]
实施例1：携带cgtase-tx基因的重组表达载体的构建
[0050]
cgtase-tx是来源于thermoanaerobacterium xylanolyticum的环糊精葡萄糖基转移酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示(原始序列genbank登录号为wp_013787419.1)。cgtase-tx基因序列经密码子优化(如seq id no.2所示)并在其n端添加6
×
his纯化标签后，由通用生物公司进行基因合成，将合成的含纯化标签的cgtase-tx基因通过ncoⅰ和ecorⅰ限制酶以及t4连接酶，克隆至pet-28a(+)载体的多克隆位点中，得到重组载体pet-28a(+)-tx，后将其转化至大肠杆菌top10中，用于载体储存与后续克隆。
[0051]
实施例2：cgtase-tx饱和突变文库的构建
[0052]
为提高cgtase-tx催化活性，初步选择所有参与cgtase-tx催化口袋组成的氨基酸作为潜在突变位点，相关残基主要包括v16、i17、q19、i20、v21、t22、d23、r24、l46、k47、w75、i76、s77、q78、l87、p88、d89、s95、t96、y98、h99、g100、y101、w102、d136、a138、n140、h141、t142、s143、p144、y152、t182、f184、s186、y187、d189、g190、i191、l195、f196、d197、l198、a199、d200、r228、d230、a231、v232、k233、h234、f256、e258、w259、f260、l261、t263、e265、d267、n269、l282、f284、f286、q288、r291、q292、d296、t298、v322、t323、f324、i325、d326、n327、h328、d329、m330、d331、a345、l346、t349、l350、p356、a357、i358、y359、y360、t362、d371、p372、r375、a387、v390以及i391。排除催化残基、依据文献资料推测可能严重影响酶催化活性的残基以及保守度较高其他残基，最终选择v16、q19、v21、t22、l46、k47、i76、s77、q78、l87、p88、d89、s95、t96、t142、s143、y152、t182、s186、y187、d189、g190、i191、d197、v232、f260、l261、t263、e265、d267、n269、q288、q292、d296、t298、i325、d331、l346、t349、l350以及v390为候选突变残基。设计相关突变引物如下：
[0053]
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[0054]
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[0056]
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[0057]
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[0060]
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[0126]
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[0127]
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[0129]
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[0132]
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[0133]
tx-v390-f：cctataatnnkattaagaaactggcaccgc；
[0134]
tx-v390-r：ttcttaatmnnattataggcggtggtactg；
[0135]
分别使用上述引物，以实施例1构建的pet-28a(+)-tx为模板，使用primestar max酶进行pcr扩增。pcr反应在50μl的体系中进行，其中primestar max酶25μl，上下游引物各2μl，模板dna 1μl，并加纯水补足至50μl。反应条件为98℃变性5min后开始循环，然后98℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸1min 10s，共30个循环后再于72℃延伸10min，反应结束后得到长度约7300bp的片段产物。上述产物经dpnⅰ酶消解后转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，并在孵育后涂布于lb平板(卡那霉素抗性)，37℃下培养过夜，将长出单克隆挑至96孔板，得到饱和突变文库。
[0136]
实施例3：饱和突变文库的筛选
[0137]
挑取饱和突变文库中的克隆到96孔板中，每孔加入200μl含有50mg/l卡那霉素的
lb液体培养基，并在37℃、250rpm下过夜培养，得到一级种子液。后吸取40μl一级种子液转接入同样含50mg/l卡那霉素tb液体培养基中，37℃下培养至od
600
＝0.6-0.8，使用终浓度为0.1mmol/l的iptg进行诱导，诱导温度调节至25℃，培养过夜，同时以cgtase-tx亲本酶菌株作为对照。诱导结束后，离心弃去上清发酵液，加入0.2mol/l亚硫酸钠溶液600μl重悬菌体，并放置在30℃、250rpm的摇床上处理2h，后离心弃去上清。向菌体中加入20mmol/l nah2po
4-na2hpo4缓冲液(ph7.0)重悬清洗细胞2遍，离心弃去上清，菌体用20mmol/l的kh2po4溶液300μl再次重悬。向重悬后的菌液(od
600
＝16)中加入1.2ml反应液配制成含有终浓度20g/lβ-环糊精、20g/l l-抗坏血酸，ph＝5.0的反应混合液，30℃反应24h后离心取上清加入14mg/ml的磷钼酸溶液进行显色反应，并在660nm处测定溶液吸光值。
[0138]
溶液吸光值与l-抗坏血酸含量呈正相关，建立l-抗坏血酸的磷钼酸显色反应标准曲线，根据标准曲线计算反应溶液中残留的l-抗坏血酸含量，并通过以下公式计算aa-2g收率(％)。cgtase-tx野生型的相对活性定义为100％。
[0139][0140]
其中，w0为初始反应液中l-抗坏血酸的含量，w为最终反应液中l-抗坏血酸的含量。
[0141]
对初筛获得活力提升的突变体再进行复筛，复筛的具体过程如下：24深孔板中加入1ml含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基，接入10μl菌种，并于37℃、250rpm过夜培养。然后取40μl菌液转接入1.5ml同样含50mg/l卡那霉素的tb液体培养基中，37℃下生长至od
600
＝0.6-0.8，使用终浓度为0.1mmol/l的iptg进行诱导，并降温至25℃过夜培养。产酶结束后，离心弃去上清发酵液，并使用20mmol/l nah2po
4-na2hpo4缓冲液(ph 7.0)重悬清洗细胞2遍，离心弃去上清，剩下的菌体用300μl的20mmol/l的kh2po4溶液重悬以用于催化反应。催化反应方法如下：向上述300μl菌液中(od
600
＝16)加入1.2ml反应液配制成含有终浓度20g/lβ-环糊精、20g/l l-抗坏血酸，ph＝5.0的反应混合液，后于30℃反应24h，反应结束后液相检测aa-2g含量。将复筛得到的有益突变体送往杭州擎科生物技术有限公司进行基因测序。
[0142]
此次筛选共计得到6株突变体，收率在25％～40％左右，分别命名为突变体1(l46f)、突变体2(d89v)、突变体3(y152g)、突变体4(g190w)、突变体5(n269a)和突变体6(i325k)，具体突变和活性结果详见表1。
[0143]
实施例4：有益突变随机组合文库构建
[0144]
有益单点突变催化活性通常不能满足活性要求，往往需要不同位点突变的叠加才能得到更好的突变体，但是简单的有益突变叠加可能存在严重的上位效应。为了避免以上情况，选择有益位点进行随机重组突变，寻找可能有益的突变组合，进一步提高cgtase-tx的催化活性。设计引物如下：
[0145]
tx-f：ttgttaattggcagcagtaatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgc
[0146]
tx-r：tggtgatgatgatgatgcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaa
[0147]
使用上述引物，以pet-28a(+)-tx、pet-28a(+)-tx-l46f、pet-28a(+)-tx-d89v、pet-28a(+)-tx-y152g、pet-28a(+)-tx-g190w、pet-28a(+)-tx-n269a、pet-28a(+)-tx-i325k为混合模板进行pcr扩增。pcr反应在50μl的体系中进行，使用taq dna聚合酶(takara)进行交错延伸pcr。pcr反应在50μl的体系中进行：taq dna聚合酶1μl，上下游引物
后各2μl，模板dna1μl，10
×
ex taq buffer 5μl，dntp mix(2.5mm)4μl，加纯水补足至50μl。反应条件为98℃变性30s，55℃复性延伸30s，如此循环80次。扩增结束后得到约2000bp的片段产物，使用dna片段回收试剂盒(爱思进)回收上述pcr片段。再以上述pcr片段为模板，使用primestar max酶进行pcr扩增。pcr反应在50μl的体系中进行，反应体系为primestar max酶25μl，上下游引物各2μl，模板dna1μl，加纯水补足至50μl。反应条件为98℃变性5min后开始循环，然后98℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环后，再于72℃延伸10min。扩增结束后得到约2000bp的片段产物，使用dna片段回收试剂盒(爱思进)回收上述pcr片段。回收的pcr产物与pet-28a(+)-cgtase-tx质粒经ncoⅰ和ecorⅰ酶切，t4连接酶酶连后，连接产物转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，并涂布后在37℃下培养过夜，后将长出的克隆挑至96孔板，得到组合突变文库。
[0148]
实施例5：组合突变文库筛选
[0149]
参照实施例3的方法对实施例4组合突变文库的突变体进行筛选。本轮突变筛选得到3个对aa2g催化效率有提升的组合突变体，aa-2g收率可达43％-50％，分别命名为cgtase-tx1(l46f\y152g\n269a\i325k)、cgtase-tx2(l46f\d89v\g190w\i325k)和cgtase-tx3(l46f\d89v\y152g\i325k)，具体突变和活性结果详见表1。
[0150]
表2cgtase-tx饱和突变及组合突变筛选结果
[0151][0152]
实施例6：cgtase-tx酶制剂的制备
[0153]
按1％接种量从保菌管中有益突变菌株接种至5ml含50mg/l卡那霉素的lb培养基中，在37℃、200rpm条件下培养15h，得到一级种子液。然后将一级种按4％接种量接入50ml含50mg/l卡那霉素的tb培养基中，在37℃、220rpm下培养，直至菌液od达到0.6～0.8时加入终浓度为0.1mm的iptg进行诱导表达，在25℃、220rpm下诱导24h后，离心去除发酵液，收集菌体，用于全细胞催化，比酶活可达100000u/kg。
[0154]
实施例7：cgtase-tx催化合成aa-2g应用
[0155]
按照实施例6方法制备表达cgtase-tx的菌体细胞。
[0156]
配制100ml酶催化反应体系，含有(按终浓度计)20g/lβ-环糊精(糖基供体)、20g/l l-抗坏血酸(糖基受体)；使用氢氧化钠调节反应体系的溶液ph为5.0，再加入5g的cgtase-tx湿菌体细胞进行催化反应；反应温度为30℃，反应时间为24小时。反应结束后，向反应体系中再加入终浓度为500000u/l
反应液
的糖化酶(金源生物)，并调节溶液ph为5.0，开始反应，持续时间为4小时。反应结束后液相检测，结果显示20g的l-抗坏血酸经过酶催化转化制得7.68g aa-2g，aa-2g收率仅为20％。
[0157]
实施例8：cgtase-tx1催化合成aa-2g应用
[0158]
按照实施例6方法制备表达cgtase-tx1的菌体细胞。
[0159]
配制100ml酶催化反应体系，含有(按终浓度计)20g/lβ-环糊精(糖基供体)、20g/l l-抗坏血酸(糖基受体)；使用氢氧化钠调节反应体系溶液ph为5.0，再加入5g的cgtase-tx1湿菌体细胞进行催化反应；反应温度为30℃，反应时间为3小时。反应结束后，向反应体系中再加入500000u/l
反应液
的糖化酶(金源生物)，并调节溶液ph为5.0，开始反应，持续时间为4小时。反应结束后液相检测，结果显示20g的l-抗坏血酸经过酶催化转化制得15.36g aa-2g，aa-2g收率达到40％，反应时间较野生型cgtase-tx(24h)远远缩短。
[0160]
实施例9：cgtase-tx1催化合成aa-2g应用
[0161]
按照实施例6方法制备表达cgtase-tx1的菌体细胞。
[0162]
配制100ml酶催化反应体系，含有(按终浓度计)20g/lβ-环糊精(糖基供体)、20g/l l-抗坏血酸(糖基受体)；使用氢氧化钠调节溶液ph为5.0，再加入5g的cgtase-tx1湿菌体细胞进行催化反应；反应温度为30℃，反应时间为10小时。反应结束后，向反应体系中再加入500000u/l
反应液
的糖化酶(金源生物)，并调节溶液ph为5.0，开始反应，持续时间为4小时。反应结束后液相检测，结果显示20g的l-抗坏血酸经过酶催化转化制得17.28g aa-2g，aa-2g收率达到45％，反应时间较野生型cgtase-tx(24h)显著缩短。
[0163]
实施例10：cgtase-tx2催化合成aa-2g应用
[0164]
按照实施例6方法制备表达cgtase-tx2的菌体细胞。
[0165]
配制100ml酶催化反应体系，含有(按终浓度计)20g/lβ-环糊精(糖基供体)、20g/l l-抗坏血酸(糖基受体)；使用氢氧化钠调节溶液ph为5.0，再加入5g的cgtase-tx2湿菌体细胞进行催化反应；反应温度为30℃，反应时间为10小时。反应结束后，向反应体系中再加入500000u/l
反应液
的糖化酶(金源生物)，并调节溶液ph为5.0，开始反应，持续时间为4小时。反应结束后液相检测，结果显示20g的l-抗坏血酸经过酶催化转化制得18.82g aa-2g，aa-2g收率达到49％，反应时间较野生型cgtase-tx(24h)显著缩短。
[0166]
实施例11：cgtase-tx3催化合成aa-2g应用
[0167]
按照实施例6方法制备表达cgtase-tx3的菌体细胞。
[0168]
配制100ml酶催化反应体系，含有(按终浓度计)20g/lβ-环糊精(糖基供体)、20g/l l-抗坏血酸(糖基受体)；使用氢氧化钠调节反应体系溶液ph为5.0，再加入5g的cgtase-tx3湿菌体细胞进行催化反应；反应温度为30℃，反应时间为10小时。反应结束后，向反应体系中再加入500000u/l
反应液
的糖化酶(金源生物)，并调节溶液ph为5.0，开始反应，持续时间为4小时。反应结束后液相检测，结果显示20g的l-抗坏血酸经过酶催化转化制得16.51g aa-2g，aa-2g收率达到43％，反应时间较野生型cgtase-tx(24h)显著缩短。
[0169]
实施例12：cgtase-tx两步酶催化工艺
[0170]
采用β-环糊精(200g/l)为糖基供体，l-抗坏血酸(200g/l)为受体，初始体系中β-环糊精和vc的添加量比为1：1。反应ph为5.0(通过氢氧化钠调节)，第一步酶催化采用细胞催化，细胞在反应体系中的浓度为50g/l湿菌体，反应温度为30℃，催化反应时间为3～10小时，第一步反应结束后，将反应体系升温至50℃进行第二步酶催化反应，第二步酶催化的酶为糖化酶，添加量为500000u/l
反应液
，调节反应ph为5.0，反应时间为4小时，反应结束后制得aa-2g，aa-2g收率达到50％以上，反应时间较野生型cgtase-tx的反应时间(24h)显著缩短。
[0171]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，在解木聚糖嗜热厌氧杆菌(thermoanaerobacterium xylanolyticum)来源的环糊精葡萄糖基转移酶的基础上，对第46位亮氨酸、第89位天冬氨酸、第152位酪氨酸、第190位甘氨酸、第269位天冬酰胺、第325位异亮氨酸中的一个或多个氨基酸进行了突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸；或将第89位天冬氨酸突变为缬氨酸；或将第152位酪氨酸突变为甘氨酸；或将第190位甘氨酸突变为色氨酸；或将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸；或第325位异亮氨酸突变为赖氨酸；或将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸；或将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第89位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第190位甘氨酸突变为色氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸；或将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第89位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸。3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。5.表达权利要求1或2所述突变体的重组微生物细胞。6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以pet-28a(+)为表达载体，表达权利要求1或2所述的突变体。7.含有权利要求5所述微生物细胞，或含有权利要求6所述重组大肠杆菌的细胞催化剂。8.根据权利要求7所述细胞催化剂，其特征在于，按如下方法制备：将所述重组大肠杆菌在培养基中培养至菌液od达到0.6～0.8，加入iptg诱导酶的表达，收集菌体。9.权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5所述的重组微生物细胞，或权利要求6所述的重组大肠杆菌，或权利要求7或8所述的细胞催化剂在催化生产l-抗坏血酸-2-葡萄苷中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述突变体或表达所述突变体的菌体细胞在含β-环糊精和l-抗坏血酸的反应体系中反应至少3小时；所述突变体的添加量≥1000u/l；所述重组微生物细胞，或所述重组大肠杆菌，或所述细胞催化剂的添加量≥10mg
菌体
/ml。

技术总结
本发明公开了一种糖基转移酶变体及其在AA-2G制备中的应用，属于酶工程技术领域。本发明通过对环糊精葡萄糖基转移酶的一个或多个氨基酸位点进行突变，获得了催化活性明显提高的突变体，相对活性是野生酶的123％～298％，比酶活可提高至6.76U/mg～16.2U/mg。本发明将构建的突变体用于AA-2G的酶催化生产，使催化周期相比于野生型的24h显著缩短至10h甚至更短，AA-2G收率提高至50％以上，且其催化特异性更好，反应产物中无AA-5G、AA-6G及AA-3G等副产物存在。物存在。物存在。


技术研发人员：程磊雨 童涛 彭晨 张宇 王浩 王福祥 姚浩楠
受保护的技术使用者：浙江新和成股份有限公司
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/7/11