一种提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽及其应用的制作方法

1.本发明属于化妆品原料领域，具体涉及一种提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽及其应用。


背景技术：

2.细胞外基质(extracellular matrix，ecm)是构成细胞外微环境的主要成分，在组织稳态、生长和成熟中发挥着重要作用。同时，在细胞成分与周围微环境相互作用的过程中整合了许多细胞进程，如黏附、生存、迁移、形态、增殖和分化等。
3.细胞外基质蛋白主要包括胶原蛋白、弹性蛋白和糖蛋白等。其中胶原蛋白属于不溶性纤维蛋白质，是细胞外基质的主要成分，遍布于各器官和组织，胶原蛋白一般占哺乳动物体内蛋白总量的25％。弹性蛋白是生物组织中弹性较大的结构蛋白，较大量存在于韧带、血管壁和皮肤等弹性组织中，是弹性纤维的主要成分。细胞外基质中的糖蛋白其糖链多为长链氨基多糖，许多长链氨基多糖连接在一蛋白质核心上而构成的糖蛋白。因其糖含量比蛋白质多许多，有时糖的含量可高达95％，故称为蛋白多糖。蛋白多糖是构成结缔组织的主要成分。构成蛋白多糖的氨基多糖有透明质酸、软骨质及硫酸软骨质、硫酸肤质、硫酸角质、肝素及硫酸乙酰肝素等。
4.cn114376951a公开了一种抗糖化肤用组合物及其应用。所述抗糖化肤用组合物包括肌肽、麦角硫因、富勒烯、葡萄多酚和黑枸杞提取物。所述抗糖化肤用组合物能够用于制备精华液，所述精华液的制备方法简单，有利于实现产业化。
5.cn102559826a公开了一种胶原蛋白低聚肽的制备方法。所述方法以动物皮为原料，经过酸及表面活性剂预处理、酶解、脱色、膜分离、干燥得到胶原蛋白低聚肽。通过所述方法得到的胶原蛋白相对分子量主要分布在1000dalton以下，优选地，相对分子量小于1000dalton的低聚肽高斯分布峰面积百分比超过85％，优选超过90％，为胶原蛋白低聚肽。胶原蛋白低聚肽粉末颜色洁白、无任何腥臭味、口感好，具有很好的吸收、渗透性，可广泛应用于化妆品、食品等行业中。
6.因此，基于细胞外基质蛋白研发生物相容性更高、功效更全面的化妆品原料是非常有意义的。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽及其应用。
8.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽，所述提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包括如seq id no:1所示的序列。
10.seq id no:1所示的序列：
11.tvyavtgrgdspassggggsvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgigvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgi
gvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgigvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgigvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgig
12.本发明所涉及seq id no:1所示的氨基酸序列是依据天然弹性蛋白氨基酸序列设计合成的，其氨基酸序列主要由五肽(val-pro-gly-xaa-gly，vpgxg)重复单元串联而成，xaa是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸；本发明所述类弹性蛋白多肽具有良好的生物相容性，能赋予组织以弹性和抗张能力，从而达到支持肌肤弹性的效果。
13.第二方面，本发明提供如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
14.使含有类弹性蛋白多肽编码基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，对表达后体系进行蛋白纯化，制得所述类弹性蛋白多肽。
15.优选地，所述外源表达系统包括原核表达系统或真核表达系统。
16.优选地，所述外源表达系统为原核表达系统；
17.优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌。
18.第三方面，本发明提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述具有抗氧化修复功效的组合物包括：
19.如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白；编码所述重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如seq idno:2所示的序列；所述重组纤连蛋白的氨基酸序列包括如seq id no:3所示的序列。
20.seq id no:2所示的序列：
21.gggcctcaaggtattgctggacagcgtggtgtggtcggcctgcctggtcagagaggagagagaggcttccctggtcttcctggcccctctggtgaacctggcaaacaaggtccctctggagcaagtggtgaacgtggtccccctggtcccatgggcccccctggattggctggaccccctggtgaatctggacgtgagggggctcctggtgccgaaggttcccctggacgagacggttctcctggcgccaagggtgaccgtggtgagaccggccccgctggaccccctggtgctcctggtgctcctggtgcccctggccccgttggccctgctggcaagagtggtgatcgtggtgagactggtcctgctggtcccgccggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaaggattacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccggtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggccccaggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgctggtactcctggtctgcaaggaatgcctggacctggtccttgctgtggtggttaa
22.seq id no:3所示的序列：
23.tgidfsditansftvhwiapratitgyrirhhpehfsgrpredrvphsrnsitltnltpgteyvvsivalngreesplligqqstvsdggggsnidrpkglaftdvdvdsikiawespqgqvsryrvtysspedgihelfpapdgeedtaelqglrpgseytvsvvalhddmesqpligtqsta
24.本发明还创造性地提出了一种重组胶原蛋白，该蛋白含有如seq id no:2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述胶原蛋白具有保湿、补充皮肤胶原、抗氧化等功效，并且组织相容性、皮肤透过性和使用安全性较高。
25.本发明所述具有氧化修复功效的组合物中的类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白在抗氧化、皮肤损伤修复和保湿方面具有协同增效的作用。所述具有氧化修复功效的组合物中各组分协同增效，可有效增强皮肤屏障作用、减少外界环境导致的皮肤损
伤敏感状态、减少皱纹、增加皮肤水分，使肌肤保持健康状态。
26.优选地，所述具有抗氧化修复功效的组合物以质量份数计包括：
27.0.05-5份如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、0.05-5份重组胶原蛋白和0.05-3份重组纤连蛋白。
28.所述提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的质量份数可以选择0.05份、0.1份、1份、2份、3份、4份或5份等；
29.所述重组胶原蛋白的质量份数可以选择0.05份、0.1份、1份、2份、3份、4份或5份等；
30.所述重组纤连蛋白的质量份数可以选择0.05份、0.1份、0.5份、1份、1.5份、2份、2.5份或3份等；
31.上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
32.更优选地，所述具有抗氧化修复功效的组合物以质量份数计包括：0.05-1份如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白。
33.所述提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的质量份数可以选择0.05份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等；
34.所述重组胶原蛋白的质量份数可以选择0.05份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等；
35.所述重组纤连蛋白的质量份数可以选择0.05份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份或0.5份等；
36.上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
37.本发明中使用所述具有抗氧化修复功效的组合物制备产品时，组合物的添加量为产品制备原料的千分之一，即可产生优异的护肤效果。当所述具有抗氧化修复功效的组合物中的三种蛋白质量份数选择0.05-5份如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、0.05-5份重组胶原蛋白和0.05-3份重组纤连蛋白时，三种蛋白搭配使用，在抗氧化和皮肤损伤修复等方面的作用更强；当组合物中的蛋白质量份数选择0.05-1份如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白时，所述组合物的抗氧化和舒缓修复皮肤效果进一步增强。
38.第四方面，本发明提供一种抗氧化修复护肤品，所述抗氧化修复护肤品的制备原料包括如第三方面所述的具有抗氧化修复功效的组合物。
39.本发明所述的具有抗氧化修复功效的组合物可以作为原料用于制备抗氧化修复护肤品，所述护肤品能够深层滋润皮肤、提高皮肤屏障、促进皮肤损伤修复。
40.优选地，所述抗氧化修复护肤品包括精华液、面膜、面霜、化妆水、乳液或精华油中任意一种。
41.本发明所述抗氧化修复护肤品可以灵活选择本领域技术人员熟知的任一护肤品剂型，如精华液、面膜、面霜、化妆水、乳液或精华油等。
42.第五方面，本发明提供如第四方面所述的抗氧化修复护肤品的制备方法，所述抗氧化修复护肤品为抗氧化修复精华液，所述制备方法包括如下步骤：
43.(1)混合保湿剂和水，制得所述水相混合液；
44.(2)混合步骤(1)所述水相混合液和如第三方面所述的抗氧化修复组合物，制得所述抗氧化修复精华液。
45.本发明提供一种抗氧化修复精华液的制备方法，其中仅需将保湿剂和水混合后，再与如第三方面所述的抗氧化修复组合物混合，即可制得所述抗氧化修复精华液。该制备方法操作简单，适宜工业放大。
46.优选地，所述保湿剂包括丁二醇、甘油聚醚-26、海藻糖、透明质酸钠或1,2-己二醇中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合包括丁二醇和甘油聚醚-26的组合、海藻糖和透明质酸钠的组合或海藻糖和1,2-己二醇的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
47.优选地，步骤(2)所述混合还需添加ph调节剂、螯合剂、抗氧化剂、增溶剂或芳香剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括ph调节剂和螯合剂的组合、螯合剂和抗氧化剂的组合或增溶剂和芳香剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
48.第六方面，本发明提供如第一方面所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽或如第三方面所述的具有抗氧化修复功效的组合物在制备皮肤损伤修复产品中的应用。
49.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
50.1、本发明所涉及seq id no:1所示的氨基酸序列是依据天然弹性蛋白氨基酸序列设计合成的，其氨基酸序列主要由五肽(val-pro-gly-xaa-gly，vpgxg)重复单元串联而成，xaa是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸；本发明所述类弹性蛋白多肽具有良好的生物相容性，能赋予组织以弹性和抗张能力，从而达到支持肌肤弹性的效果。
51.2、本发明所述具有氧化修复功效的组合物中的类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白在抗氧化和皮肤损伤修复方面具有协同增效的作用，此外，重组胶原蛋白还具有保湿和抗衰老作用。因此本发明所述具有氧化修复功效的组合物中各组分协同增效，可有效增强皮肤屏障作用、减少外界环境导致的皮肤损伤敏感状态、减少皱纹、增加皮肤水分，使肌肤保持健康状态。
52.3、本发明所述的具有抗氧化修复功效的组合物可以作为原料用于制备抗氧化修复护肤品，所述护肤品能够深层滋润皮肤、提高皮肤屏障、促进皮肤损伤修复。
53.4、本发明提供一种抗氧化修复精华液的制备方法，其中仅需将保湿剂和水混合后，再与如第三方面所述的抗氧化修复组合物混合，即可制得所述抗氧化修复精华液。该制备方法操作简单，适宜工业放大。
具体实施方式
54.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
55.实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
56.除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所
属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
57.下述pet-28a(+)购自麦克林；bl21(de3)化学感受态细胞为购自默克；甘油聚醚-26购自苏州源泰润化工实力供应商型号为gp100的产品；透明质酸钠为购自赢创官方品牌站型号为hyacare filler cl的商品；聚丙烯酸酯交联聚合物-6为购自卓尔(广州)生物科技有限公司型号为sepima zen的商品；卡波姆为购自广州博峰化工科技有限公司型号为卡波姆940的产品；peg-40氢化蓖麻油为购自广州花之王化工有限公司实力供应商型号为cremophor co 40的产品。
58.制备例1
59.本制备例提供所述提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、所述重组胶原蛋白和所述重组纤连蛋白，上述三种蛋白的制备方法包括如下步骤：
60.(1)重组质粒构建：表达载体选择大肠杆菌宿主适用的pet-28a(+)载体，送至测序公司进行合成，将编码蛋白质的dna连接至表达载体上(根据seq idno:1和seq id no:3的氨基酸序列和密码子表，获得其对应的核苷酸序列)，制得重组蛋白表达载体：类弹性蛋白多肽：pet-28a-1；重组胶原蛋白：pet-28a-2；重组纤连蛋白：pet-28a-3。
61.(2)重组发酵菌株构建：将pet-28a-1、pet-28a-2和pet-28a-3表达载体分别使用化学转化法转至大肠杆菌(bl21(de3))感受态细胞中，利用琼脂糖凝胶电泳筛选转化后平板菌落中的阳性克隆子，将筛选出的阳性克隆子转接至2ml lb培养基，37℃，200rpm培养10h，培养后的菌液使用体积分数为50％的甘油稀释1倍，分装到冻存管中，冻存在-80℃条件下，制得三种蛋白重组发酵菌株。
62.(3)重组发酵菌株发酵培养：将10μl lb重组发酵菌液涂布于固体lb平板，37℃培养箱培养12h后，挑选单克隆，接种于50ml含50μg/ml卡那霉素含量的lb液体培养基中，置于摇床中37℃200rpm培养14h，然后以1:100的比例接种200ml含50μg/ml卡那霉素含量的lb液体培养基中，37℃培养至菌液od＝0.6后加入iptg，使iptg终浓度达到1mm，继续培养4h，随后4℃，4000rpm，离心15min收集菌体。
63.(4)重组蛋白纯化：将菌体超声破碎后离心，沉淀使用tritonx-100洗涤液洗涤，再次离心去除上清，沉淀加入6m盐酸胍，并调节ph到8，充分溶解沉淀后将溶解液过镍亲和层析树脂，使用20mm、50mm、100mm、200mm、500mm浓度梯度咪唑溶液依次洗脱，洗脱液使用蛋白浓缩柱浓缩后，收集浓缩液透析过夜(透析袋，rc膜，14kd，扁平宽度44mm(生工f600112))，随后使用bca试剂盒检测蛋白浓度，并按每5mg蛋白加入体积浓度5％的甘露醇水溶液0.5ml的比例与甘露醇水溶液混匀，随后使用冻干机在-40℃预冻10min，最后-35℃冻干，得到类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白、重组纤连蛋白三种目的蛋白冻干粉。
64.实施例1
65.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法包括如下步骤：
66.混合制备例1制备的类弹性蛋白多肽0.5份、重组胶原蛋白0.5份和重组纤连蛋白0.1份，制得所述具有抗氧化修复功效的组合物。
67.实施例2
68.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法包括如下步骤：
69.混合制备例1制备的类弹性蛋白多肽0.05份、重组胶原蛋白0.05份和重组纤连蛋白0.05份，制得所述具有抗氧化修复功效的组合物。
70.实施例3
71.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法包括如下步骤：
72.混合制备例1制备的类弹性蛋白多肽1份、重组胶原蛋白1份和重组纤连蛋白0.5份，制得所述具有抗氧化修复功效的组合物。
73.实施例4
74.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于将类弹性蛋白多肽0.5份、重组胶原蛋白0.5份和重组纤连蛋白0.1份替换为类弹性蛋白多肽0.03份、重组胶原蛋白0.03份和重组纤连蛋白3.1份，其余均与实施例1相同。
75.实施例5
76.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于将类弹性蛋白多肽0.5份、重组胶原蛋白0.5份和重组纤连蛋白0.1份替换为类弹性蛋白多肽5.1份、重组胶原蛋白5.1份和重组纤连蛋白0.03份，其余均与实施例1相同。
77.实施例6
78.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于将类弹性蛋白多肽0.5份、重组胶原蛋白0.5份和重组纤连蛋白0.1份替换为类弹性蛋白多肽0.03份、重组胶原蛋白0.03份和重组纤连蛋白0.7份，其余均与实施例1相同。
79.实施例7
80.本实施例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于将类弹性蛋白多肽0.5份、重组胶原蛋白0.5份和重组纤连蛋白0.1份替换为类弹性蛋白多肽1.3份、重组胶原蛋白1.3份和重组纤连蛋白0.03份，其余均与实施例1相同。
81.对比例1
82.本对比例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于所述组合物中不含类弹性蛋白多肽，并将类弹性蛋白多肽的质量份数按比例分配至重组胶原蛋白和重组纤连蛋白，其余均与实施例1相同。
83.对比例2
84.本对比例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于所述组合物中不含重组胶原蛋白，并将重组胶原蛋白的质量份数按比例分配至类弹性蛋白多肽和重组纤连蛋白，其余均与实施例1相同。
85.对比例3
86.本对比例提供一种具有抗氧化修复功效的组合物，所述组合物的制备方法与实施例1的区别仅在于所述组合物中不含重组纤连蛋白，并将重组纤连蛋白的质量份数按比例分配至类弹性蛋白多肽和重组胶原蛋白，其余均与实施例1相同。
87.对比例4
88.本对比例提供一种具有抗氧化修复功效的单一组分，制备方法与实施例1的区别仅在于所述单一组分仅含类弹性蛋白多肽，其余均与实施例1相同。
89.对比例5
90.本对比例提供一种具有抗氧化修复功效的单一组分，制备方法与实施例1的区别仅在于所述单一组分仅含重组胶原蛋白，其余均与实施例1相同。
91.对比例6
92.本对比例提供一种具有抗氧化修复功效的单一组分，制备方法与实施例1的区别仅在于所述单一组分仅含重组纤连蛋白，其余均与实施例1相同。
93.应用例1
94.本应用例提供一种抗氧化修复精华液，所述抗氧化修复精华液的制备方法包括如下步骤：
95.(1)将保湿剂、增稠剂和水在82℃下混合8min，制得所述水相混合液；
96.(2)混合增溶剂和芳香剂，随后混合物与水相混合液、实施例1所述具有抗氧化修复功效的组合物、ph调节剂和抗氧化剂在45℃，混合10min，制得所述抗氧化修复精华液，其中所述具有抗氧化修复功效的组合物、保湿剂、增稠剂、ph调节剂、抗氧化剂、增溶剂和螯合剂的具体成分与质量百分含量如表1所示。
97.表1
[0098][0099]
应用例2-7
[0100]
应用例2-7提供六种抗氧化修复精华液，所述抗氧化修复精华液的制备方法与应用例1的区别仅在于将实施例1中的所述具有抗氧化修复功效的组合物替换为实施例2-7中的所述具有抗氧化修复功效的组合物，其余均与应用例1相同。
[0101]
应用对比例1-6
[0102]
应用对比例1-6提供六种抗氧化修复精华液，所述抗氧化修复精华液的制备方法与应用例1的区别仅在于将实施例1中的所述具有抗氧化修复功效的组合物替换为对比例1-6中的所述具有抗氧化修复功效的组合物或具有抗氧化修复功效的单一组分，其余均与应用例1相同。
[0103]
测试例1
[0104]
本测试例对各实施例或对比例所述组合物的抗氧化作用进行评价，具体评价方式如下：
[0105]
使用dpph的清除效率来评估实施例和对比例所述具有抗氧化修复功效的组合物的抗氧化性能。具体评价方法包括：0.05g组合物分别浸入4ml dpph(100μm，在99wt％乙醇中)溶液中，使用仅含dpph的溶液作为对照组，混合完成后在避光孵育60min。然后使用紫外-可见分光光度计测量混合溶液在517nm处的吸光度值。使用以下等式计算：dpph清除率
＝(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度
×
100％，结果如表2所示。
[0106]
表2
[0107][0108][0109]
由表2数据可知，实施例4与实施例5的dpph清除率较实施例1低，表明三种蛋白的质量份数处于优选质量份数外时(0.05-5份类弹性蛋白多肽、0.05-5份重组胶原蛋白和0.05-3份重组纤连蛋白)，三种蛋白质组成的组合物的抗氧化性能降低。实施例6或实施例7中三种蛋白的比例在进一步地优选范围外时(0.05-1份类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白)，dpph清除率实施例4和实施例5高，但较实施例1低，表明三种蛋白的比例处于0.05-1份类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白时，所述组合物可以发挥优异的抗氧化性能。
[0110]
对比例1-6分别含有类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白中的两种或一种，其dpph清除率较实施例1低，表明类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白在抗氧化方面具有协同增效的作用。
[0111]
测试例2
[0112]
本测试例对各应用例或应用对比例所述精华液的止痒修复作用进行评价，具体评价方式如下：
[0113]
(1)取70只豚鼠，雌雄各半，在实验1d前剔除右后足上的毛，去毛面积约为2cm2，将
豚鼠随机分为14组，每组含有5只豚鼠，分别记录为应用例1-7组、应用对比例1-6组和空白组。
[0114]
(2)应用例1-7组、应用对比例1-6组和空白组的豚鼠连续2d在去毛处分别涂抹精华液0.05ml，空白组涂抹等量去离子水，每天1次。
[0115]
(3)实验第3天，用生理盐水分别配置0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)和0.1％(w/v)的磷酸组胺溶液。用粗砂纸将豚鼠右后足背去毛处擦伤，擦伤面积约为1cm2，局部再涂抹相应的精华液1次，涂抹量为0.05ml，空白组涂抹等量去离子水，10min后，在擦伤处滴加0.01％(w/v)的磷酸组胺溶液0.05ml，观察豚鼠否在3min内回头舔舐右后足，如未出现，在擦伤处继续滴加0.02％(w/v)的磷酸组胺溶液0.05ml，观察豚鼠否在3min内回头舔舐右后足。以此类推，每隔3min按上述梯度增加浓度，每次滴加磷酸组胺溶液0.05ml，直至豚鼠在3min内舔舐右后足。以此时所滴加的磷酸组胺的累计总量为致痒阈(μg)，计算同一组别豚鼠致痒阈的平均值和致痒阈差异率，致痒阈差异率＝(实验组致痒阈-空白组致痒阈)/空白组致痒阈
×
100％，结果如表3所示。
[0116]
表3
[0117][0118][0119]
由表3数据可知，应用例4与应用例5的致痒阈差异率较应用例1低，表明三种蛋白
的质量份数处于优选质量份数外时(0.05-5份类弹性蛋白多肽、0.05-5份重组胶原蛋白和0.05-3份重组纤连蛋白)，三种蛋白质组成的组合物的止痒修复的功能降低。应用例6或应用例7中三种蛋白的比例在更优选范围外时(0.05-1份类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白)，致痒阈差异率较应用例1低，表明三种蛋白的比例处于0.05-1份类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白时，所述组合物的皮肤修复止痒作用进一步升高。
[0120]
对比例1-6分别含有类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白中的两种或一种，其致痒阈差异率较应用例1低，表明类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白在修复皮肤损伤，增强皮肤屏障方面具有协同增效的作用。
[0121]
测试例3
[0122]
本测试例对各应用例或应用对比例所述精华液的褪红修复作用进行评价，具体评价方式如下：
[0123]
(1)选取志愿者70人，分为14组，包括13组实验组和1组空白组，每组5人，每组成员性别随机，志愿者排除条件符合《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》纳入、排除标准。
[0124]
(2)选择受试者左手臂内侧作为受试部位，以规格为2cm2的方形区域进行循环标记；用清水清洗受试区，受试者静坐10min，用德国ck公司的mexamter mx18(色素测试探头)进行皮肤红值空白值的测量。
[0125]
(3)随后用质量分数为50％的辣椒素水溶液(约0.01ml)对受试区域进行刺激；涂抹15min后，进行数值采集；在受试区域涂抹0.05ml精华液，30min后进行数据采集；空白对照涂抹0.05ml纯水；统计每组受试者实验部位测得的数值平均值，计算褪红率，分析红值的变化。
[0126]
褪红率＝(辣椒素处理15min后红值-精华液或水处理30min后红值)/皮肤红值空白值
×
100％
[0127]
评价方法参照文献：王领，抗敏止痒植物组合提取物制备工艺、功效及作用途径研究[d].2015中第2.2.6部分皮肤刺激修复实验所记载的方法，测试结果如表4所示：
[0128]
表4
[0129][0130][0131]
由表4数据可知，应用例4与应用例5的褪红率较应用例1低，表明三种蛋白的质量份数处于优选质量份数外时(0.05-5份类弹性蛋白多肽、0.05-5份重组胶原蛋白和0.05-3份重组纤连蛋白)，所述组合物的褪红作用降低。应用例6或应用例7中三种蛋白的比例在更优选范围外时(0.05-1份类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白)，褪红率较应用例1低，表明三种蛋白的比例处于0.05-1份类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白时，所述组合物的皮肤褪红修复作用进一步升高。
[0132]
对比例1-6分别含有类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白中的两种或一种，其褪红率较应用例1低，表明类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白在舒缓皮肤，快速减少皮肤泛红现象方面具有协同增效的作用。
[0133]
测试例4
[0134]
本测试例对各应用例或应用对比例所述精华液的保湿作用进行评价，具体评价方式如下：
[0135]
(1)选取70名皮肤健康的18-40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成14组，13组使用应用例或应用对比例的所述精华液，1组为空白组使用纯水。志愿者清洁面部后，按
2mg/cm的用量均匀涂抹于面部脸颊直径为2cm的测试区域内，每天使用一次，连续使用30天，通过皮肤测试仪(mc750，德国ck)测定志愿者使用前和使用30天后皮肤含水量；
[0136]
在使用前以及连续使用30天后分别测试各位受试者的面部皮肤含水量，每个数据测试三次，计算每组平均值，按照如下公式计算皮肤含水量变化率：
[0137]
皮肤含水量变化率＝(使用30天后皮肤含水量-使用前皮肤含水量)/使用前皮肤含水量
×
100％；测试结果如表5所示：
[0138]
表5
[0139]
组别皮肤含水量变化率(％)应用例163.2应用例259.8应用例355.7应用例438.3应用例536.5应用例650.8应用例747.6应用例对比例130.8应用例对比例232.1应用例对比例325.9应用例对比例411.6应用例对比例59.2应用例对比例613.7空白组1.8
[0140]
由表5数据可知，对比例1-6分别含有类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白中的两种或一种，其皮肤含水量变化率较应用例1低，表明类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白三种蛋白在提高皮肤含水量方面具有意想不到的协同增效作用。
[0141]
测试例5
[0142]
对应用例制得的精华液进行安全性评价。具体评价方法为：按照《化妆品安全技术规范2015版》中，第七章人体安全性检验方法中的人体皮肤斑贴试验方法进行试验。(1)选择18-60岁复合实验要求的女性志愿者，排除标准：(a)近一周使用抗组胺药或近一个月内使用免疫抑制剂者；(b)近两个月内受试部位应用任何抗炎药物者；(c)受试者患有炎症性皮肤病临床未愈者；(d)胰岛素依赖性糖尿病患者；(e)正在接受治疗的哮喘或其他慢性呼吸系统疾病患者；(f)在近6个月内接受抗癌化疗者；(g)免疫缺陷或自身免疫性疾病患者；(h)哺乳期或妊娠妇女；(i)双侧乳房切除及双侧腋下淋巴结切除者；(n)在皮肤待试部位由于瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其他瑕疵而影响试验结果的判定者；(o)参加其他的临床试验研究者；(p)体质高度敏感者；(q)非志愿参加者或不能按试验要求完成规定内容者。(2)每个应用例对应一组，每组10名志愿者；选用面积不超过50mm2、深度约1mm的合格斑试器材。将各应用例制得的精华液放入斑试器小室内，用量约为0.025g。对照孔不置任何物质为空白对照。将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌
轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。(3)分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表6标准观察皮肤反应。并根据表6的标准进行评估。
[0143]
表6
[0144][0145][0146]
结果显示，本发明制得的精华液，人体使用安全无刺激，应用价值高。
[0147]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的制备工艺，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0148]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0149]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

技术特征：
1.一种提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽，其特征在于，所述提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包括如seq id no:1所示的序列。2.如权利要求1所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：使含有类弹性蛋白多肽编码基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，对表达后体系进行蛋白纯化，制得所述类弹性蛋白多肽。3.如权利要求2所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述外源表达系统包括原核表达系统或真核表达系统。4.如权利要求2或3所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述外源表达系统为原核表达系统；优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌。5.一种具有抗氧化修复功效的组合物，其特征在于，所述具有抗氧化修复功效的组合物包括：如权利要求1所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、重组胶原蛋白和重组纤连蛋白；其中编码所述重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如seq id no:2所示的序列；所述重组纤连蛋白的氨基酸序列包括如seq id no:3所示的序列。6.如权利要求5所述的具有抗氧化修复功效的组合物，其特征在于，所述具有抗氧化修复功效的组合物以质量份数计包括：0.05-5份如权利要求1所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、0.05-5份重组胶原蛋白和0.05-3份重组纤连蛋白；优选地，所述具有抗氧化修复功效的组合物以质量份数计包括：0.05-1份如权利要求1所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽、0.05-1份重组胶原蛋白和0.05-0.5份重组纤连蛋白。7.一种抗氧化修复护肤品，其特征在于，所述抗氧化修复护肤品的制备原料包括如权利要求5或6所述的具有抗氧化修复功效的组合物。8.如权利要求7所述的抗氧化修复护肤品，其特征在于，所述抗氧化修复护肤品包括精华液、面膜、面霜、化妆水、乳液或精华油中任意一种。9.如权利要求7所述的抗氧化修复护肤品的制备方法，其特征在于，所述抗氧化修复护肤品为抗氧化修复精华液，所述制备方法包括如下步骤：(1)混合保湿剂和水，制得所述水相混合液；(2)混合步骤(1)所述水相混合液和如权利要求5或6所述的抗氧化修复组合物，制得所述抗氧化修复精华液。10.如权利要求1所述的提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽或如权利要求5或6所述的具有抗氧化修复功效的组合物在制备皮肤损伤修复产品中的应用。

技术总结
本发明提供一种提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽及其应用，所述提高组织弹性和抗张能力的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列。本发明所涉及SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列是依据天然弹性蛋白氨基酸序列设计合成的，其氨基酸序列主要由五肽(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)重复单元串联而成，Xaa是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸；本发明所述类弹性蛋白多肽具有良好的生物相容性，能赋予组织以弹性和抗张能力，从而达到支持肌肤弹性的效果。持肌肤弹性的效果。


技术研发人员：孙云起 裴运林 刘涵 郭朝万 王宁 肖湲
受保护的技术使用者：广东丸美生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/7/11